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Oncotarget公司。2016年1月5日；7(1): 1066–1075.
2015年11月2日在线发布。 数字对象标识：10.18632/目标6279
预防性维修识别码：项目经理4808052
PMID：26544515

重新排列的EML4-ALK融合转录物在循环血小板中隔离，并能够监测非小细胞肺癌患者的血基crizotinib反应

R.乔纳斯A.尼尔森,1,2,三，* 尼基·卡拉查里奥,4,* 若尔迪·贝伦盖尔,1 安娜·吉梅内斯·卡皮坦,5 佩皮恩·谢伦,1,三 克里斯蒂娜·泰西多,5 Jihane Tannous公司,6 贾斯汀·库伊伯,7 埃丝特·德雷斯,1 马格达·格拉博夫斯卡,1 马特·范·凯伦,6 丹妮尔·海德曼,8 埃里克·桑尼森,8 Anne-Marie C.丁格曼,9 圣地亚哥·维特里,4 Bakhos A.Tannous公司,6 安娜·德罗兹多夫斯基,10 拉斐尔·罗塞尔,4,5,11,12,** 埃格伯特·史密斯,7,**和托马斯·伍廷格1,三，6,**
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关联数据

补充资料

摘要

目的：携带EML4-ALK重排的非小细胞肺癌对克雷唑替尼敏感。然而，尽管最初有反应，大多数患者最终会复发，在治疗过程中监测EML4-ALK的重新排列可能有助于识别这些患者。然而，与系列肿瘤活检相关的挑战凸显了基于血液的检测对生物标记物监测的必要性。血小板可以隔离肿瘤细胞释放的RNA，因此对于生物标记物的无创评估来说是一个很有吸引力的来源。方法：采用RT-PCR方法对77例非小细胞肺癌患者（其中38例为EML4-ALK重排肿瘤）的血小板和血浆中EML4-ALK重排进行分析。在29名接受克里唑替尼治疗的EML4-ALK重组肿瘤患者中，血小板中的EML4-ALK重组与无进展生存率和总生存率相关。结果：RT-PCR检测血小板EML4-ALK重排的敏感性为65%，特异性为100%。在用克里唑替尼治疗的29例患者中，EML4-ALK+血小板患者的无进展生存期为3.7个月，EML4-ALK-血小板患者的16个月（危险比为3.5；对= 0.02). 对一名患者30个月内血小板中EML4-ALK重排的监测显示，在放射疾病进展前两个月，患者对克雷唑替尼耐药。结论：血小板是无创检测EML4-ALK重排的重要来源，可能有助于预测和监测克里唑替尼的疗效，从而提高仅基于影像学的临床决策。

关键词：诊断、非小细胞肺癌、液体活检、血小板、EML4-ALK

简介

基因改变导致的癌症可能对靶向突变途径的治疗性抑制剂敏感。例如，约16%的非小细胞肺癌（NSCLC）中存在致病性表皮生长因子受体（EGFR）突变，使其对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）吉非替尼、埃洛替尼和阿法替尼敏感[1-三]. 间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因的重排发生在2-7%的非小细胞肺癌中，也定义了肺癌的一种不同的分子亚型[4]. 最常见的ALK重排是将棘皮动物微管相关蛋白样4（EML4）与ALK并列，并产生异常的EML4-ALK融合基因，带有多个嵌合体变体，所有这些变体编码ALK的相同部分，但包含EML4的不同截断[4]. ALK重排肿瘤的生长和生存依赖于ALK，并且对ALK抑制剂如克雷唑替尼、铈替尼和阿来替尼表现出明显的敏感性[5-8]. 然而，尽管最初有反应，但对这些靶向治疗产生的获得性耐药性始终会导致疾病进展。大约三分之一的ALK重排非小细胞肺癌复发患者是由于ALK酪氨酸激酶结构域内获得性突变所致[9]. EML4-ALK扩增和旁路信号转导是另一种耐药机制，尽管原癌基因受到抑制，但仍能重建关键下游增殖和生存信号的激活[10].

对耐药性生物标志物的评估可以帮助早期识别可能复发的患者，最好是在放射成像提供进展证据之前。然而，尽管检测活检肿瘤组织仍是当前推荐的突变分析方法，但与系列肿瘤生物检测相关的挑战，尤其是在非小细胞肺癌中，促使了对非侵入性血液检测的研究，以允许作为常规临床护理的一部分，对生物标记物进行频繁评估。肿瘤细胞可以通过多种微泡依赖或独立机制向血液中释放RNA，一些模型表明血小板对肿瘤细胞的生长、扩散、侵袭、灌注、迁移、外渗和建立远处转移至关重要[11-13]. 使用共焦显微镜和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），我们先前已经证明，从健康人分离的血小板会从癌细胞中摄取含有RNA的膜泡[14]. 此外，从胶质瘤和前列腺癌患者分离的血小板分别含有癌相关RNA生物标记物EGFRvIII和前列腺癌抗原3（PCA3）[14]. 由于血小板RNA易于分离和分析，血小板似乎是生物标记物无创监测的诱人来源[15,16]. 然而，据我们所知，使用血小板检测非小细胞肺癌患者的EML4-ALK重排尚未得到研究。

我们评估了检测非小细胞肺癌患者、有无EML4-ALK重组肿瘤患者和健康对照者血小板和血浆中EML4-ALK重组的可行性。此外，在用克里唑替尼治疗的一组患者中，我们检测了血小板中EML4-ALK重排对预后的潜在影响。在整个治疗过程中，我们还监测了一名指标患者血小板中EML4-ALK的重排。

结果

非小细胞肺癌患者血小板和血浆中EML4-ALK重排的检测

本研究设计了三个平行的目标：首先，确定检测血小板和血浆中EML4-ALK重排的敏感性和特异性，并与匹配的组织活检相关联；其次，研究血小板中EML4-ALK重排对克里唑替尼疗效的潜在影响；第三，通过评估血小板中的EML4-ALK重排，验证在整个治疗过程中监测患者的可行性。

为了实现第一个目标，从荷兰公立医院采集了2008年至2014年间77名诊断为非小细胞肺癌的患者的血液样本(n个=49），西班牙(n个=25），以及美国(n个= 3). 38名患者患有EML4-ALK重组肿瘤，通过荧光原位杂交（FISH）、RT-PCR或两者都检测到（图​（图1A）。1安培). 患者特征如所示补充表1在这38名患者中，有35名患者接受了克里唑替尼治疗，其中9名一线，13名二线，13名进一步治疗，总有效率（ORR）为66%，中位无进展生存期（PFS）为7个月（95%CI，3.8至10.2）。

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答：。组织FISH和血小板RT-PCR检测的代表性EML4-ALK阳性病例（视觉（左）和定量（右）分析）。通过RT-PCR产物的Sanger测序确认分析的血小板样本。NSCLC人细胞系H3122作为阳性对照（PC）。NC，阴性对照。B。血小板中肿瘤衍生的EML4-ALK RNA的摄取。用PKH67标记H2228 NSCLC细胞系的外显子，标记血小板中的外显体摄取。外泌体对血小板的摄取表现为血小板中PKH67标记的外泌物和标记的卵磷脂（罗丹明）重叠。C、。将EML4-ALK转录物从H2228外泌体阳性转移到血小板。阳性对照细胞系的外显子；NTC，非模板控制。

表​表11显示配对组织和血液样本中EML4-ALK重排的检测率。从32名患者的血液样本中分离出血浆RNA，其中14人患有EML4 ALK重排肿瘤。在三名患有EML4-ALK重组肿瘤的患者的血浆中检测到EML4-ALK重排，而在他们的肿瘤中没有检测到任何一名没有EML4-ALK重排的患者，这表明RT-PCR检测血浆RNA的敏感性为21%，特异性为100%。从67名患者的血样中分离出血小板RNA，其中34人患有EML4-ALK重组肿瘤。22例EML4-ALK重组肿瘤患者的血小板中检测到了EML4-ALK重排，而在肿瘤中没有检测到EML4-ALK重排的患者，这表明RT-PCR检测血小板RNA的敏感性为65%，特异性为100%。21名健康献血者的血小板中均未检测到EML-ALK重排（表​（表11).

表1

RT-PCR检测77例非小细胞肺癌患者和21例健康人血浆和血小板中的EML4-ALK重排
血浆中检测到EML4-ALK重排血小板中检测到EML4-ALK重排
非小细胞肺癌患者N个= 32*N个= 67*
 EML4-ALK再排列肿瘤3/1422/34
 肿瘤中未检测到EML4-ALK重排0/180/33
健康对照第0/21
敏感21%65%
特异性100%100%
准确性66%86%

nd，未确定

*分别在32份和67份样品中分离出血浆和血小板。

外显子将RNA转移到血小板

图1B和1C共聚焦显微镜和RT-PCR显示，癌细胞释放的外泌体是能够将肿瘤衍生的EML4-ALK重排RNA转移到血小板的载体。从健康供体分离血小板，从H2228 EML4-ALK+NSCLC细胞分离外显体。分离的外泌体用PKH67绿色荧光染料标记，然后与血小板孵育。共焦显微镜用于确认来自H2228 NSCLC细胞的PKH67标记的外泌体被血小板内吞（图​（图1B）。1B年). RT-PCR用于建立肿瘤衍生的EML4-ALK重排RNA从癌细胞向血小板的外泌体介导转移。通过RT-PCR在与H2228非小细胞肺癌细胞分离的外泌体孵育的血小板中检测到EML4-ALK RNA，而在与EML4-ALK−非小细胞肝癌细胞系A549外泌体孵育后的血小板中未检测到（图​（图1C1摄氏度).

血小板EML4-ALK重排与克里唑替尼的疗效

在35名克里唑替尼治疗的患者中，有6名患者仅在进展时采集血样，未纳入生存分析，而29名患者在基线检查和/或治疗进展前采集血样并纳入PFS、总生存率和反应分析。29例患者的中位年龄为57岁（范围37-81）；16人从未吸烟者或曾经吸烟者；24人表现状态（PS）0-1；6例有脑转移(补充表1).

29名患者中有23人只有一份血样；6名患者有两份样本，分别在基线检查时和治疗期间获得。在仅有一个样本的23名患者中，有14名患者的血小板检测到了EML4-ALK重排。这14名患者被归类为EML4-ALK+，而其余9名患者被归类为EML4-ALK−。在有两份可用血样的六名患者中，有三名患者在基线检查时检测到EML4-ALK重排，但在治疗过程中丢失，因此被归类为EML4-ALK−，而有一名患者在治疗期间发现EML4-ALK的情况正好相反，因此被分类为EML4-ALK+。其余两个样本在两种情况下均为阴性。共有15名患者被归类为EML4-ALK+，14名患者被分类为EML4-ALK−（图​（图22和补充表S2).

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显示研究中患者分布的流程图

77名非小细胞肺癌患者参与了这项研究，以测试检测血小板中EML4-ALK重排的可行性。根据EML4-ALK在血小板中的状态，将29名患者纳入结果分析。

中位随访时间为13个月（1至48个月），所有29名克里唑替尼治疗患者的PFS为7.0个月（95%可信区间[CI]，4.4至14.7），而14名EML4-ALK−患者的PFS=16个月（95%CI，5.0至未达到[NR]），15名EML4-ALK+患者的PFS1.7个月（95%CI，1.1至8.7）(对=0.01）（图​（图3A）。3A级). 在PFS的单变量分析中，包括性别、年龄、PS、脑转移、先前治疗的行数以及血小板中的EML4-ALK重排，只有EML4-ALK+状态与较短的PFS相关（危险比[HR]，3.5；95%CI，1.2至10.1；对=0.02）（图​（图3A；3A级;补充表S3).

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A.的Kaplan-Meier估计。PFS和B。29例克里唑替尼治疗的非小细胞肺癌患者的总生存率（根据血小板EML4-ALK重排状态）。生存曲线上的勾号表示经过审查的数据。C、。纵向监测指标患者的克里唑替尼反应。血小板EML4-ALK状态在上面描述的小瓶指示的时间点得到确认（如左图所示），下面描述的放射反应与字母A-E表示的时间点相对应。在因阑尾炎而停止服用克雷唑替尼的一个月期间，EML4-ALK在患者再次接受克里唑替尼治疗前以血小板形式返回。在放射学疾病进展前两个月，在血小板中检测到EML4-ALK转录物。NC，阴性对照；PC，阳性对照；PR，部分响应；PD，进行性疾病；CT、CT；正电子发射断层扫描

所有29名克里唑替尼治疗患者的中位总生存期为NR（95%CI，6.4至NR），而14名EML4-ALK−患者的中位数总生存期是NR（95%CI，8.0至NR；对=0.11）（图​（图3B）。3B公司). 在单变量分析中，没有变量被确定为总生存率的标志(补充表S3). EML4-ALK+和EML4-ALK−患者对克雷唑替尼的反应无显著差异(补充表S4).

一名代表性患者血小板中EML4-ALK重排的连续监测

为了验证我们的假设，即在放射学证据显示疾病进展之前，可以在血小板中无创检测到获得性耐药性的出现，我们对一名37岁的女性非吸烟者进行了非小细胞肺癌的监测。2012年3月，在基线检查时，在她的肿瘤和血小板中检测到EML4-ALK v1（图​（图3C）。3C公司). 她对克里唑替尼治疗有反应，血小板中的EML4-ALK重排丢失。在因阑尾炎而中断克里唑替尼治疗一个月期间，在她的血小板中检测到EML4-ALK重排，但在她重新开始克里唑替尼治疗时丢失了。2014年6月，在她的血小板中再次检测到EML4-ALK重排；然而，直到两个月后，即2014年8月，正电子发射断层扫描计算机断层扫描（PET-CT）才显示出疾病进展（图​（图3C3C公司).

讨论

在本研究中，我们检查了血小板和血浆用于EML4-ALK重排的无创评估，发现血小板是一种很有前景的生物来源。此外，血小板中EML4-ALK重排的检测和持续性与crizotinib的PFS缩短显著相关。有趣的是，在该指数患者中，血小板中EML4-ALK重排的再次出现预示着在影像学进展前两个月对克雷唑替尼的耐药性。因此，血小板可以与其他有前途的生物来源一起考虑，如血浆、外泌体、无循环DNA和循环肿瘤细胞（CTC），所有这些都被提议作为生物标记物分析的替代平台(补充图S1) [17-19]. 此外，克莱门特等.曾证明血小板中肿瘤衍生蛋白生物标记物的选择性摄取[20,21].

在本研究中，血浆RNA对RT-PCR检测EML4-ALK重排的敏感性低于血小板（21%比65%）。血浆中较低的敏感性可能归因于自由循环RNA分子的快速降解或含有重排EML4-ALK的自由循环外泌体的低丰度。几个小组已经使用CTC检测生物标记物[22]. 例如，Pailler等.，检查了非小细胞肺癌患者CTC中的ALK重排，发现每1ml血液中有四个或更多的ALK重排CTC，具有100%的敏感性和特异性[17]. 然而，由于CTC通常由血液中数千万个正常有核细胞中的少数癌细胞组成，因此它们用于检测EML4-ALK重排必须依赖于新的CTC检测策略。无循环DNA在进行大规模重排时有其局限性，因为寻找染色体制动点需要对基因组DNA进行广泛的深度测序。不幸的是，血小板尚未常规储存，通常需要进行前瞻性采集以分析血小板RNA。血小板的另一个缺点可能是它们对某些治疗方法的潜在反应，导致血液中血小板数量减少和潜在的血小板活化。然而，与用于检测和监测EML4-ALK重排的其他液体生物源相比，血小板在检测和治疗反应方面，以及在提取和快速读出分析结果方面，都是一种有效且具有竞争力的生物源。我们的EML4-ALK测试在治疗监测中的作用在我们的索引患者身上得到了证明，在她的整个治疗过程中，我们对其血小板中的EML4-ALK重排进行了监测。这一指数病例举例说明了使用对血小板中EML4-ALK重排的连续监测来预测病情进展，从而为医生提供了一个早期的机会窗口，以修改治疗并改用第二代ALK抑制剂，如certinib或alectinib。

血小板中的EML4-ALK重排是克里唑替尼对EML4-ALK重排的非小细胞肺癌细胞作用的直接读数。充分清除crizotinib介导的细胞会导致EML4-ALK转录物释放到循环中的减少，从而导致血小板EML4-ALK转录物的丢失。相比之下，克里唑替尼耐药导致EML4-ALK转录物的持续产生和释放。癌症患者血液中的DNA来源是在扩张的肿瘤组织中通过凋亡和/或坏死而解体的细胞[23]. 相反，通过微泡依赖或独立机制释放到血液中的RNA在受体细胞中具有功能活性，这表明肿瘤细胞可以利用循环RNA作为与其区域或远端环境“通信”的手段[24]. 因此，表达的生物标记物（例如EML4-ALK RNA分子）比来源于凋亡或坏死细胞的生物标记（例如片段DNA）更能告诉我们细胞功能障碍的情况。这进一步支持了基于无创RNA的血液检测，用于监测肿瘤内正在发生的变化，同时对治疗作出反应。

尽管我们研究中使用EML4-ALK+血小板的患者预后不佳，但我们的发现也可能为这一亚组患者带来潜在的治疗机会。肿瘤或其转移瘤释放的信号分子调节肿瘤细胞对血小板的募集。其中一个分子是Aggrus/podoplanin，这是一种吸引血小板表达CLEC-2受体的蛋白质[13]. 阻断Aggrus/podoplanin与表达CLEC-2的血小板的结合可能是一种新的治疗方法，对EML4-ALK+患者有益。[25]最近研究表明，ALK可以调节间变性大细胞淋巴瘤和EML4-ALK重新排列的非小细胞肺癌中血管内皮生长因子A（VEGFA）的生成，抗VEGFA抗体贝伐单抗强烈抑制小鼠异种移植瘤中间变性大淋巴细胞的生长[26]. 活化血小板释放多种生长因子，包括VEGF，因此，EML4-ALK+患者的亚群可能受益于抗血管生成治疗[13,26].

材料和方法

细胞系

NSCLC人细胞系H3122和H2228由Daniel Costa博士（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院医学系）提供，并分别作为EML4-ALK转录物的变体1和较短变体3的阳性对照。NSCLC人A549细胞系是从美国类型培养物收集（ATCC）中获得的。

血小板和血浆RNA的分离

用标准离心法从同一份全血样本中分离出血小板和血浆，并将其放入含有EDTA抗凝剂的6ml紫色卡普BD真空吸附器中。通过在室温下120g离心20分钟，去除细胞和聚集物，得到富含血小板的血浆。从富含血小板的血浆中分离血小板，在室温下360g离心20分钟，然后在360g离心10分钟并冷冻。血小板颗粒收集在30μl RNAlater中（加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司），并在−80°C下冷冻以供进一步使用。血小板和血浆平行冷冻。根据制造商的说明，使用Agencourt Formapure（马萨诸塞州贝弗利Agencourt-Biosciences）、miRvana RNA分离试剂盒（生命技术）或Trizol（生命技术公司）分离血小板RNA和血浆RNA。血小板RNA的浓度和质量由安捷伦2100生物分析仪和总RNA Pico芯片（安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州）测定。对足够质量的血小板RNA（生物分析仪RIN值>7和/或独特的rRNA曲线）进行生物标记物分析。血浆RNA的质量无法测量，只能定量输入RNA。

分离和胞外体摄取

利用EML4-ALK阳性（H2228）和野生型对照（A549）NSCLC细胞系的细胞培养液通过超速离心分离外显子。首先通过离心法清除培养基和血浆中的碎片；在500xG下两次，持续10分钟，然后在2000xG下两次，持续15分钟，最后在10000xG下两次，持续30分钟。清除样品中的外显子以100000×G的速度造粒60分钟。外显体在PBS中清洗一次，然后标记以进行摄取实验，或者DNAse-I处理（4个单位；Promega）15分钟，然后在miRVANA裂解缓冲液（Ambion）中裂解以提取RNA（根据制造商的建议）以进行突变检测实验。如前所述，使用PKH67标记（Sigma-Aldrich）H2228微泡和LSM-710共焦显微镜系统、ZEN 2010软件（卡尔蔡司）和63x浸油物镜（卡尔蔡司）分析外显子摄取[14]. 用罗丹明-阴茎倍体素（Invitrogen）对血小板进行染色，以显示血小板结构，并用绿色荧光染料PKH67（Sigma-Aldrich）分析外体摄取。血小板内的EML4-ALK重排RNA通过PCR在逆转录RNA上显示，其设置与前面描述的相同。

EML4-ALK重排的RT-PCR分析

根据制造商的说明，在血栓Dx时，使用Life Technologies的定量PCR Taqman分析（Hs03654556、Hs036504557和Hs0364558）检测三种最常见的EML4-ALK变异体（v1[e13:a20]、v2[e20:a20'和v3[e6:a20]，分别在EML4外显子13、20和6以及ALK外显子20处有断点）。在ABI7500（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上，以TaqMan人类GAPDH控制试剂（生命技术公司，402869）作为输入控制，在标准TaqMans程序中进行60个周期的定量PCR。使用Big-Dye 1.1测序试剂盒（Applied Biosystems）对RT-PCR产品进行Sanger测序，确认EML4-ALK断点。在泛大陆生物技术公司，EML4-ALK通过PCR扩增并在琼脂糖凝胶中可视化。通过上标III（生命技术）将RNA转化为cDNA，并使用40 ng cDNA和1U铂Taq聚合酶（Invitrogen）在20μl反应中扩增。对三种最常见的EML4-ALK变体使用特定的正向和反向引物(补充表S5). EML4-ALK断点通过使用Big Dye 1.1测序试剂盒（Applied Biosystems）对RT-PCR产物进行Sanger测序来确认。

统计分析

所有参与中心都以非连续的方式发送样本，没有根据性别、东部合作肿瘤组（ECOG）PS、吸烟史或之前的治疗进行分层。从克里唑替尼治疗开始到通过连续CT和/或PET-CT首次观察疾病进展，计算PFS。计算从克里佐替尼治疗到任何原因死亡的总生存率。使用Kaplan-Meier方法估计中位PFS和总生存率及其95%CI，并使用非参数log-rank检验进行比较。采用单变量Cox比例-哈扎德回归模型评估每个潜在预后因素与PFS或总生存率之间的相关性。使用SAS V9.3进行所有统计分析。显著性设置为P<0.05。

研究监督

这项研究是根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的。从所有患者处获得书面和/或口头知情同意书并记录在案。获得了各医院机构审查委员会和道德委员会的批准。研究中使用的药物是从制造商处购买的，制造商在研究中没有参与。这些数据由资深作者与所有作者共同收集和分析。通讯作者写了手稿的初稿。所有作者都批准了手稿的最终版本，同意将手稿提交出版的决定，并保证所报告的数据和分析的准确性。

补充材料图表

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鸣谢

财政支持由欧洲研究理事会E8626（RJAN、EFS、TW）和336540（TW）、荷兰科学研究组织93612003和91711366（TW。Rosell博士实验室的工作得到了“La Caixa”基金会和Redes Temáticas de Investigación en Cáncer（RD12/0036/0072）的部分资助。血栓Dx BV和Pangaea Biotech SL的员工参与了这项研究。

脚注

利益冲突

是的，阅读了上述声明后，存在潜在的利益冲突。作者R.Jonas A.Nilsson、Pepijn Schellen、Thomas Wurdinger、Ana Gimenez-Capitan、Cristina Teixido、Rafael Rosell均为泛大陆生物技术或血栓诊断公司的股东和/或员工。

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