长非编码RNA ZFAS1与CDK1相互作用，参与结直肠癌p53依赖性细胞周期控制和细胞凋亡

在CRC组织和细胞系中ZFAS1表达增加

在119名CRC患者的验证队列中（表中的验证队列​表1）1)我们观察到，与配对的正常结肠组织相比，111例（93%）CRC组织中ZFAS1的表达至少高出两倍（图​（图1B，1B年,对< 0.0001). 在CRC细胞系中也测定了ZFAS1的表达，包括HCT116+/+（p53野生型）、HCT116-/-（p53-null）、HT-29、DLD-1（p53^241层)、Colo-206、CaCO-2、SW-837和SW-620细胞。我们的数据表明，与其他CRC细胞系相比，HCT116+/+、SW-620和HT-29中ZFAS1的表达明显更高（图​（图1B）。1B年). Northern blot分析进一步证实，与HCT116−/−和DLD-1细胞相比，HCT116+/+和SW-620中ZFAS1的表达显著更高（图​（图1C）。1摄氏度). 为了评估通过不同方法获得的表达数据在CRC中的ZFAS1放松调节，我们下载并分析了RNAseq TCGA数据集COADREAD，并证实CRC肿瘤组织中的ZFAS1水平明显高于非肿瘤结直肠组织(对< 10⁻¹¹)（图​（图1D）。一维). 我们对ZFAS1的表达与各种临床病理特征进行了相关性分析，在我们的队列中，我们没有观察到ZFAS1表达与临床分期、淋巴结转移、远处转移、分级、肿瘤直径和生存率有任何关联(对>0.05，数据未显示）。

CRC细胞中ZFAS1沉默的SiRNA选择

利用ZFAS1特异性siRNAs研究了其在CRC细胞系中的功能相关性。为了沉默CRC细胞中ZFAS1的表达，将三个单独的siRNA瞬时转染到细胞系中(补充图S1A,1B年、和1摄氏度). 使用RT-qPCR在HCT116+/+、HCT116−/−、DLD-1和SW-620细胞中转染后24小时至120小时内评估沉默效率。在三种siRNA中，n271359 siRNA表现出最高的沉默能力(补充图S1A). 因此，在随后的所有实验中，该siRNA被选择用于ZFAS1沉默。我们尚未观察到ZFAS1沉默对SNORD12水平的任何影响(补充图S2A)SNORD12的沉默也不影响ZFAS1的表达(补充图S2B).

ZFAS1沉默抑制CRC细胞的增殖、细胞周期和集落形成

ZFAS1在HCT116+/+、HCT116−/−和DLD-1细胞中表达沉默。ZFAS1的下调显著抑制HCT116+/+和DLD-1细胞的增殖(对<0.05）（图​（图2A）。2安培). 然而，在HCT116−/−细胞中未观察到对细胞增殖的影响（图​（图2A）。2安培). 流式细胞术用于评估CRC细胞中ZFAS1的沉默是否与细胞周期相分布的变化有关。如图所示​图2B，2B型沉默ZFAS1的细胞中，S期CRC细胞（HCT116+/+，DLD-1）的百分比显著降低(对< 0.05). 这些结果表明，沉默ZFAS1表达会导致CRC细胞中的G1受体。为了确定ZFAS1表达沉默是否也影响CRC细胞的致瘤性，进行了集落形成试验。如图所示​图2C，2摄氏度，沉默ZFAS1导致HCT116+/+和DLD-1细胞中软琼脂上的菌落数量显著减少(对< 0.05).

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图2

ZFAS1基因敲除对结直肠癌细胞增殖的影响在体外

答：。采用台盼蓝排除法测定HCT116+/+、DLD-1和HCT116−/-细胞的增殖。数据表示三个独立实验的平均值±S.D。B。ZFAS1沉默对细胞周期的影响。条形图表示G0/G1、S或G2/M阶段的细胞百分比，如图所示。C、。在ZFAS1沉默后，进行集落形成生长分析以确定HCT116+/+、DLD-1和HCT116-/-细胞的增殖。对菌落进行计数和捕获*对< 0.05, **对< 0.01.

ZFAS1与细胞周期素依赖性激酶1相互作用

ZFAS1相互作用蛋白由在体外使用HCT116+/+和DLD-1细胞分离的蛋白裂解物的生物素-亲和素下拉系统(补充图S3). 通过质谱分析鉴定的蛋白质是根据蛋白质鉴定分数和匹配的肽数（分数>100，肽匹配≥5）来选择的。根据蛋白质的功能和以前与癌症的关系，确定的蛋白质进一步缩小了范围（表​（表3）。三). 根据GeneOntology分析，这些蛋白质大多参与细胞周期检查点的调节（倍增>5，对=0.01）和细胞周期过程（富集倍数>5，对= 0,02). 我们选择Aurora激酶B（AUKB）、细胞周期蛋白依赖性激酶9（CDK9）、细胞因子依赖性激酶1（CDK1）和死亡域相关蛋白6（DAXX）进行进一步评估。利用RNA-结合蛋白免疫沉淀技术评估这些候选蛋白是否能与ZFAS1直接相互作用。我们的实验表明，ZFAS1与DAXX没有相互作用，仅与AUKB和CDK9有少量相互作用，但与CDK1有显著的相互作用（图​（图3三).

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图3

采用RNA-结合蛋白免疫沉淀分析检测ZFAS1与Aurora激酶B、CDK9、CDK1和DAXX的相互作用

作为阴性对照，仅使用IgG。

ZFAS1被预测为海绵miR-590-3p靶向细胞周期依赖性激酶1

通过使用基于网络的预测系统，我们筛选了潜在的ZFAS1和miRNAs相互作用，并确定了ZFAS1序列中miR-590-3p（1个靶位点，alignScore=158）和miR-150-5p（1目标位点，alingeScore=155）的假定结合区域。我们评估了这些miRNAs靶向CDK1的潜力，有趣的是，四种用于预测的算法将miR-590-3p定位于CDK1 3′非翻译区。因此，我们在miRWalk数据库中发现，实验证明miR-590-3p可以靶向CDK1[22].

RNA提取

根据制造商的说明，使用mirVana miRNA分离试剂盒（Ambion，Austin，TX，USA）从组织和细胞中提取总RNA。通过使用NanoDrop ND-1000（Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）测量其光学密度（A260/280>2.0；A260/230>1.8），分光光度法测定RNA的浓度和纯度。

LncRNA分析

为了关注那些与临床相关的lncRNA，在研究的探索阶段，通过lncRNA图谱qPCR阵列（System Biosciences，Mountain view，CA）测定了83个候选lncRNA。使用SDS 2.0.1版软件（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统）对RT-qPCR数据进行分析。RNU43被选为lncRNAs表达水平标准化的参考基因。靶lncRNA的相对表达水平由等式2确定^-ΔCT，其中ΔC_T型计算如下：ΔC_T型=C_{感兴趣的TlnRNA}–C_{TRNU43号机组}然后使用RQ Manager 1.2计算相对lncRNA水平。对来自研究分析阶段的标准化表达数据进行统计学评估。

反转录（RT）和定量PCR（qPCR）

RNA提取后，根据制造商的建议，使用高容量cDNA逆转录试剂盒（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统）合成cDNA。使用Taqman非编码RNA分析和Taqman基因表达主混合（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统），通过RT-qPCR检测ZFAS1的表达水平。PCR使用Applied Biosystem 7500序列检测系统进行。

细胞系和培养条件

人类CRC细胞系，包括HCT116+/+（p53野生型）、HCT116-/-（p53敲除）、HT-29、DLD-1（p53^241层)、Colo-206、CaCO-2、SW-837和SW-620均来自美国型培养物收集中心（USA），并保存在添加10%FBS的Dulbecco改良鹰培养基中，100μg ml⁻¹青霉素，100μg ml⁻¹5%CO中的链霉素、0.1 mM非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠（Invitrogen，Gibco，Carlsbad，CA，USA）₂37°C时。

Northern印迹分析

纯化CRC细胞总RNA。使用[α-³²P] dCTP（Perkin Elmer）和Megaprime DNA标签系统（美国宾夕法尼亚州匹兹堡GE Healthcare）。按照制造商的说明，使用QuickHyb（安捷伦，加利福尼亚州圣克拉拉，美国）进行杂交。

结直肠癌细胞的转染

预先设计的消音器选择ZFAS1特异的小干扰RNA（siRNA ID n271359和n271357–A，B），对照siRNA来自Applied Biosystem（美国加利福尼亚州福斯特市）。定制合成的ZFAS1 siRNA（sense 5′-CUGGCUGAACCACUCACAGGUU-3′，以及相应的反义RNA）和SNORD12 siRNA（sense 5′-CUGUGAUCACACUAUT-3′，以及对应的反义核酸）从IDT（Coralville，Iowa，USA）获得。将siRNA寡核苷酸转染到（HCT116+/+[p53野生型]、HCT116-/-[p53敲除]、DLD-1（p53^241层)根据制造商的说明使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂的细胞（Invitrogen）。

细胞活力测定

用台盼蓝排除法测定细胞活力。结直肠癌细胞（HCT116+/+（p53野生型）、HCT116−/−（p53敲除）、DLD-1（p53^241层)用ZFAS1 siRNA和对照siRNA转染细胞，并在不同时间点（24小时至120小时）进行评估，收集转染细胞并将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液混合，用血细胞仪计数活细胞。所有测量重复三次，共四次。

细胞周期分析

CRC细胞（HCT116+/+（p53野生型）、HCT116−/−（p53敲除）和DLD-1（p53^241层))用ZFAS1 siRNA转染细胞，用胰蛋白酶消化法获取转染细胞并用70%乙醇固定。随后，在PBS中清洗细胞，并用0.1 mg ml处理⁻¹RNase在37°C下30分钟。最后，1毫克毫升⁻¹加入碘化丙啶，在室温下再培养10分钟。使用FACS Canto II（BD Biosciences，San Jose，CA）测定细胞周期不同阶段的细胞百分比，并使用FlowJo 7.2.2进行分析。（俄勒冈州阿什兰市树之星）。所有测量重复三次，共三次。

软琼脂集落形成试验

用ZFAS1 siRNA或对照siRNA转染细胞^三将细胞与0.35%琼脂溶液混合在含有10%FBS的DMEM培养基中，并在六孔组织培养板中0.75%琼脂层的顶部分层。将平板在37°C和5%CO中培养1-2周₂直到菌落形成。使用凝胶计数法对菌落进行计数（英国阿宾顿牛津光电有限公司）。所有测量重复三次，共三次。

RNA下拉分析和后续蛋白质检测

对于在体外采用特异性引物（5′-CTTCGTCTGGTGCCCGG和3′-GCAG GTAGGCAGTTAGAATTC）通过PCR制备RNA下拉模板ZFAS1 DNA。将PCR产物连接到pGEM-T Easy Vector，并转化为活性细胞。用QIAquick PCR清理试剂盒（Qiagen）消化并纯化5μg制备的质粒。ZFAS1在在体外转录反应。将25μl生物素化RNA与3 mg蛋白裂解物和30μl MyOne链霉亲和素C1 Dynabeads（Invitrogen）在4°C条件下旋转培养过夜。在多次洗涤后，将磁珠重新悬浮在15μl蛋白负载缓冲液中，用SDS-PAGE分离RNA-结合蛋白，并用考马斯G-250进行可视化。通过质谱分析检测，从凝胶和用胰蛋白酶消化的凝胶中去除独特的蛋白质带。

RNA结合蛋白免疫沉淀

根据制造商提供的EZ-Magna RIP试剂盒（美国密理博）的协议进行RNA-结合蛋白免疫沉淀（RIP）。简言之，HCT-116^+/+细胞用冰镇磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，用RIP裂解缓冲液裂解。免疫沉淀使用Aurora激酶B（#3094）、CDK9（#2316）、CDK1（#9116）抗体（马萨诸塞州丹佛市Cell Signaling Technology）和DAXX（#07-471）抗体（美国纽约州普莱西德湖Upstate）和非特异性对照正常IgG抗体。RIP裂解物和磁珠结合抗体一起孵育，并在4°C下旋转过夜。然后，用蛋白酶K消化免疫沉淀物中的蛋白质，并从上清液中纯化结合RNA，用NanoDrop（Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）测量RNA浓度。此外，纯化的RNA经过RT-qPCR分析以证明存在结合靶点。

Western blot分析和抗体

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离细胞蛋白裂解物，转移到PVDF膜上，并利用各种抗体进行Western blot分析。使用的抗体来自以下来源：p53（#2527）、PARP（#9532）、总CDK1（#9116）、细胞周期蛋白B1（#12231）和β-微管蛋白（#2128）（马萨诸塞州丹佛市细胞信号技术）。

ZFAS1海绵状miRNAs及其靶点的预测

StarBase 2.0版(http://starbase.sysu.edu.cn/)通过分析来自所有可用CLIP-Seq实验技术（PAR-CLIP、HITS-CLIP、iCLIP、CLASH）的大量Ago和RBP结合位点而开发，并显示了广泛而复杂的RNA-RNA和蛋白质-RNA相互作用网络[24]. 我们使用这个基于网络的应用程序来发现潜在的ZFAS1-microRNAs相互作用。利用miRWalk在线工具，通过4种生物信息算法（miRanda、miRWalk、RNA22和Targetscan）预测差异表达miRNAs的靶基因(网址：http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/) [25].

这项工作得到了欧洲社会基金和捷克共和国国家预算共同资助的项目“雇用最佳青年科学家促进国际合作赋权”（CZ.1.07/2.3.00/30.0037）、“CEITEC”项目（CZ1.05./1.1.00/02.0068）、MZ CR–RVO（MOU，00209805）、，BBMRI CZ项目（LM2010004）、IGA MZCR NT13549–4/2012和NT13860–4/2012项目以及Deutsche Forschungsgemeinschaft（SFB960 to M.K.）。