Oncotarget公司。2016年1月5日；7(1): 610–621.
线粒体谷氨酰胺酶活性抑制逆转非小细胞肺癌获得性埃洛替尼耐药
2015年4月12日收到；2015年10月29日接受。
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摘要
表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）埃洛替尼在过去十年中对非小细胞肺癌（NSCLC）患者的临床疗效得到批准。不幸的是，癌细胞对这种药物产生耐药性通过各种机制，这限制了患者预后的改善。因此，迫切需要开发新的药物来克服埃洛替尼耐药性。在此，我们提出了一种新的策略，通过抑制谷氨酰胺酶活性来克服NSCLC中获得性厄洛替尼耐药性。谷氨酰胺酶C（GAC）抑制剂化合物968与厄洛替尼合用时，可有效抑制厄洛替尼可耐受的NSCLC细胞HCC827ER和NCI-H1975的细胞增殖。化合物968与厄洛替尼联合使用不仅降低了HCC827ER细胞中GAC和EGFR蛋白的表达，而且抑制了GAC活性。GAC基因敲除和拯救实验证明，埃洛替尼耐药细胞的生长具有谷氨酰胺依赖性。更重要的是，化合物968与厄洛替尼合用可下调厄洛替尼可耐受细胞中的谷氨酰胺和糖酵解代谢。综上所述，我们的研究为通过阻断谷氨酰胺代谢来克服获得性埃洛替尼耐药提供了一种有价值的方法，并建议EGFR-TKI和GAC抑制剂联合应用可能是获得性埃罗替尼耐药非小细胞肺癌的潜在治疗策略。
关键词：非小细胞肺癌、厄洛替尼、谷氨酰胺酶抑制剂-968、表皮生长因子受体
简介
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，每年约有140万至160万人死于肺癌[1–三]. 2014年，总体估计有224210例新确诊病例，159260例最终死于肺癌，占美国所有癌症相关死亡人数的27.2%[4]. 在许多国家，与肺癌相关的死亡率继续上升。根据肿瘤组织学，肺癌的两个主要分类是小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌[5]. 非小细胞肺癌，主要包括鳞癌、大细胞癌和腺癌，占所有肺癌病例的近85%[6].
约20%的肺癌患者存在促进癌细胞生长的EGFR突变[7]. 这使得EGFR成为治疗非小细胞肺癌的重要治疗靶点。据报道，EGFR TKI，如吉非替尼和埃洛替尼，对具有EGFR激活突变的NSCLC具有治疗作用[8–10]. 然而，几乎所有肿瘤在不同的治疗时间后都会对EGFR-TKIs产生耐药性[11,12]. 虽然发生了T790M第二次突变等遗传改变，遇见扩增，肝细胞生长因子（HGF）过度表达[13–16]EGFR-TKIs获得性耐药的确切机制尚不清楚。
与相邻的正常细胞相比，恶性肿瘤细胞在糖酵解和谷氨酰胺代谢中表现出明显不同的代谢需求[17–19]. 最早也是最著名的癌症代谢异常是Warburg效应，其特征是无论氧气供应情况如何，糖酵解和乳酸产量都会增加[20]. 因此，针对癌症中特有的代谢途径可能是癌症治疗的有效策略。最近，有报道称，在对EGFR-TKIs耐药的患者和细胞株中，谷氨酰胺代谢和GLS表达增强[21,22]. 因此，抑制谷氨酰胺代谢可能是防治非小细胞肺癌的潜在策略。
谷氨酰胺是最丰富、用途最广的营养素，在人类细胞的多种代谢过程和信号传递中起着至关重要的作用。对于谷氨酰胺代谢，GLS是谷氨酰胺转化为谷氨酸的关键酶，在许多组织细胞和癌细胞中表达[23–25]. GLS在人类细胞中有两种亚型：GLS1（被称为肾谷氨酰胺酶）和GLS2（被认为是肝谷氨酰胺酶。GLS1是一种磷酸活化酶，具有两种主要的剪接变体：长型（KGA）和短型（GAC）[26]. 据报道，在一些肺癌细胞系中，GAC敲除比KGA敲除导致更多的细胞生长减少，这表明GAC是NSCLC中更重要的GLS1剪接变异体[27].
在我们之前的研究中，我们发现了一种新的GAC抑制剂，命名为968（5-（3-溴-4-（二甲氨基）苯基）-2,2-二甲基-2,3,5,6-四氢苯并[α]-菲咯啶-4（1H）-酮）。在小鼠异种移植模型中阻断乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤生长，但对正常细胞无抑制作用[28]. 因此，在本研究中，我们试图探索化合物968能否通过阻断谷氨酰胺代谢来克服非小细胞肺癌患者对厄洛替尼的耐药性，并确定化合物968与厄洛替尼联用治疗非小细胞癌的疗效。
结果
厄洛替尼对人NSCLC-HCC827和HCC827ER细胞的影响
人非小细胞肺癌细胞株HCC827(表皮生长因子受体外显子19缺失[delE746-A750]）和埃洛替尼耐药HCC827ER细胞遇见本研究采用基因扩增技术。我们首先证实了HCC827ER细胞对埃洛替尼的耐药性。如图所示即使浓度高达2μmol/L，HCC827ER细胞的生长也不受厄洛替尼的抑制。然而，HCC82 7细胞在这些条件下无法生长，仅10%的亲代HCC827细胞在接触10 nmol/L厄洛替尼后存活(***P（P）< 0.001).
HCC827ER细胞对厄洛替尼耐药(A类)细胞生长测定。HCC827和HCC827ER细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用浓度增加的厄洛替尼处理48小时，或不处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）***P（P）< 0.001. (B类)软琼脂分析。将HCC827和HCC827ER细胞与添加0.3%agrose和10%FBS的RPMI 1640混合，并在添加0.5%agrose及10%FBS RPMI 1640.用埃洛替尼（1μM）处理细胞或未处理细胞。在生长14天后对菌落进行评分。100%表示计数的500个单元格。(C类)上述软琼脂分析中菌落形成的统计分析。数据代表三个独立实验的平均值（平均值±标准差）**P（P）< 0.01.
为了研究恶性细胞的非锚定生长，进行了软琼脂试验。对于HCC827ER细胞，无论是否用1μM厄洛替尼处理，它们都会形成大的集落。然而，对于HCC827细胞，它们形成了集落，但用1μM埃洛替尼治疗后集落消失(**P（P）<0.01，图). 这些结果进一步证实HCC827ER细胞对厄洛替尼耐药。
HCC827和HCC827ER细胞的生长取决于谷氨酰胺的可用性
一些癌细胞使用谷氨酰胺（Gln）来支持促增殖的合成代谢过程[29]. 为了评估谷氨酰胺代谢对HCC827和HCC827ER细胞的影响，我们检测了含有或不含谷氨酰胺的培养基中的细胞生长。HCC827和HCC827ER细胞在无谷氨酰胺RPMI 1640培养基中培养，并在1至6天内计数细胞数。HCC827的细胞数量从第1天的约100%下降到第6天的18%（图, ***P（P）<0.001），HCC827ER细胞也观察到类似的结果。这些结果表明，这两种细胞的生长都对谷氨酰胺有很大的依赖性。
HCC827和HCC827ER细胞的生长依赖于谷氨酰胺(A类)HCC827（1×105每孔细胞数）和HCC827ER细胞数（1×105每孔细胞数）在含有或不含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养6天。每天统计细胞数量。计算在含有谷氨酰胺（300 mg/L L-谷氨酰胺）的培养基中培养的细胞数量作为对照。数据显示为三个实验的平均值±S.D***P（P）< 0.001. (B类)用对照siRNA或靶向GAC的siRNA1和siRNA2转染HCC827细胞。细胞按指定天数生长并计数。未经处理的细胞作为对照。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (C类)将对照siRNA或siRNA1和靶向GAC的siRNA2转染HCC827ER细胞。细胞按指定天数生长并计数。未经处理的细胞作为对照。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (D类)通过Western blot（顶面板）测定siRNA敲除HCC827和HCC827ER细胞中GAC的效率。转染pCDNA 3.1-V5-GAC后，测定GAC在HCC827和HCC827ER细胞中的拯救效率（底部面板）。(E类)用靶向GAC的对照siRNA或siRNA1和siRNA2转染HCC827细胞。24小时后，将V5-GAC质粒转染HCC827细胞。在指定的天数内计算细胞数。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (F类)用对照siRNA或靶向GAC的siRNA1和siRNA2转染HCC827ER细胞。24小时后，将V5-GAC质粒转染HCC827ER细胞。在指定的天数内计算细胞数。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）***P（P）< 0.001.
为了进一步证实这两种细胞系的谷氨酰胺依赖性，我们在HCC827和HCC827ER细胞中通过siRNAs敲除GAC，并进行细胞增殖分析。如图所示，siRNA1和siRNA2敲低GAC显著抑制HCC827的细胞生长（图*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01）和HCC827ER（图, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001）。GAC的表达如图所示为了进一步证明GAC在获得性耐药性调节中的重要作用，我们敲除了GAC，然后将GAC质粒转染到细胞中进行拯救实验。HCC827ER的抢救效率远高于HCC827细胞（图).
所有这些结果表明，HCC827和HCC827ER细胞的生长是谷氨酰胺依赖性的，GAC在厄洛替尼耐药的NSCLC细胞中起着调节细胞增殖的中心作用。
化合物968与厄洛替尼联合应用对HCC827ER细胞的生长具有协同抑制作用
谷氨酰胺分解和谷氨酰胺酶（GLS）已被证明对癌症的发展和进展是不可或缺的。谷氨酰胺酶C（GAC）是肾脏型谷氨酰胺酶的一种剪接变体，已被证明是肿瘤细胞中GLS的主要形式[22,24]. 在我们之前的研究中，我们发现了一种新型GAC抑制剂化合物968，并证明了化合物968对乳腺癌细胞的生长具有强大的抑制作用[23]. 在本研究中，我们已经证明HCC827和HCC827ER细胞的生长依赖于谷氨酰胺。我们想知道化合物968是否对HCC827和HCC827ER细胞的生长有影响。如图所示不同浓度的化合物968均显著抑制HCC827和HCC827ER细胞的生长(*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01）。化合物968对HCC827和HCC827ER细胞的抑制作用在统计学上无显著差异，表明化合物968通过与厄洛替尼不同的途径抑制NSCLC细胞增殖。
化合物968与厄洛替尼联合应用对HCC827ER细胞的生长具有协同抑制作用(A类)饱和密度分析。用或不增加化合物968浓度的方法处理细胞6天，胰蛋白酶化并计数。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (B类)HCC827和HCC827ER细胞在添加有10%FBS的RPMI 1640中培养，并用化合物968（10μM）或厄洛替尼（1μM），或化合物968与厄洛替尼联用48小时或未经处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）***P（P）< 0.001. (C类)HCC827ER细胞在添加有10%FBS的RPMI 1640中培养，并用厄洛替尼（1μM）和增加浓度的化合物968（5、10、20和40μM）联合处理，或用化合物968，10μM和增加浓度厄洛替尼布（0.5、1、2和4μM）联用处理48小时或未经处理。通过结晶紫染色测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (D类)时间进程实验。HCC827ER细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用化合物968（10μM）、厄洛替尼（1μM）或化合物968与厄洛替尼联用（1μM）处理不同时间或未处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001.
通过细胞生长测定进一步研究化合物968与厄洛替尼联合对HCC827和HCC827ER细胞生长的影响。与对照细胞相比，经化合物968处理48小时后，HCC827和HCC827ER细胞的细胞数均减少了20%。然而，当使用化合物968和厄洛替尼联合治疗时，HCC827ER细胞的生长被有效抑制（图, ***P（P）<0.001）表明化合物968不仅克服了获得性埃洛替尼耐药，而且还恢复了HCC827ER细胞对埃洛替尼敏感性。
为了进一步研究化合物968与厄洛替尼联用对HCC827ER细胞生长的作用方式，我们通过改变一种试剂的浓度和另一种试剂浓度的固定来进行细胞生长测定。如图所示将浓度增加的化合物968（5、10、20和40μM）与1μM埃洛替尼联合处理HCC827ER细胞48小时。与浓度为40μM的未经处理的对照细胞相比，细胞生长呈968剂量依赖性下降，细胞数量减少72%（图, *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01). 然而，当HCC827ER细胞用浓度增加的厄洛替尼（0.5、1.0、2.0、4.0μM）和10μM化合物968联合处理时，HCC827 ER细胞的生长并没有以厄洛替尼布剂量依赖性的方式减少(*P（P）< 0.05).
还进行了时间进程实验。用厄洛替尼、化合物968或化合物968与厄洛替尼联用分别治疗HCC827ER细胞0、12、24、36、48、60和72小时。单独用厄洛替尼（1μM）或化合物968（10μM）治疗轻微或中度抑制HCC827ER细胞的生长。然而，化合物968（10μM）和埃洛替尼（1μM）的组合以时间依赖的方式有效抑制HCC827ER细胞的生长（图). 与对照组相比，联合组的细胞数从100%减少到38%(***P（P）< 0.001).
为了测试化合物968是否对除厄洛替尼外的其他抗癌药物致敏癌细胞，使用吉非替尼（EGFR的第一选择性抑制剂）和顺铂（一类含铂抗癌药物的第一个成员）进行评估。如所示图S1化合物968对高浓度吉非替尼致敏癌细胞，其致敏效率低于厄洛替尼。此外，化合物968对cispatin的细胞敏化作用较弱。
这些发现表明，化合物968在逆转HCC827ER细胞获得性埃洛替尼和吉非替尼耐药中起关键作用。
化合物968和厄洛替尼联合使用也会降低其他非小细胞肺癌细胞系的生长
为了研究其他人类非小细胞肺癌细胞株是否存在类似现象，我们使用了三种新的细胞株（A549、NCI-H1975和NCI-H1650）进行细胞增殖试验。其中A549细胞为EGFR野生型，NCI-H1975和NCI-H1650细胞为具有相同激酶域突变的EGFR突变体（L858R和ΔE746-A750）。它们还具有其他变化，例如NCI-H1975中的T790M和NCI-H1650中的PTEN损失[30,31]. 埃洛替尼即使在2μM的浓度下也没有显著抑制所有这些细胞系的生长，这表明所有这些细胞株对埃洛替尼都不敏感（图). 然而，化合物968抑制A549和NCI-H1975细胞的细胞增殖，但对NCI-H1650细胞的生长没有影响（图). 此外，化合物968对NCI-H1975的抑制作用比A549细胞强得多。
化合物968和厄洛替尼联合使用也会降低其他非小细胞肺癌细胞系的生长(A类)NCI-H1650、NCI-H1975和A549细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用不同浓度的厄洛替尼（0.01、0.05、0.1、0.5、1和2μM）处理48 h或未处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）。(B类)NCI-H1650、NCI-H1975和A549细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用不同浓度的化合物968（0、5、10和20μM）处理48 h或未处理。通过结晶紫染色测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (C类)NCI-H1650、NCI-H1975和A549细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用厄洛替尼（1μM）和增加浓度的化合物968（5、10和20μM）处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (D类)NCI-H1650、NCI-H1975和A549细胞在添加有10%FBS的RPMI 1640中培养，并用化合物968（10μM）和增加浓度的埃洛替尼（0.01、0.1、1和2μM）处理48小时或不处理。用结晶紫染色法测定细胞生长。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
同时观察厄洛替尼联合化合物968对三种NSCLC细胞株的影响。如图所示用增加浓度的化合物968（5、10和20μM）与1μM埃洛替尼联合处理NCI-H1650、NCI-H1975和A549细胞48小时。NCI-H1975细胞的生长呈化合物968剂量依赖性下降，与浓度为20μM的未处理对照细胞相比，细胞数量减少了70%（图, ***P（P）< 0.001). 浓度为20μM时，A549细胞的生长略有下降。然而，NCI-H1650细胞的生长没有显著下降。当这些细胞系用浓度增加的厄洛替尼（0.01、0.1、1.0和2.0μM）和10μM化合物968处理时，NCI-H1975和A549细胞的生长没有以厄洛替尼布剂量依赖性的方式减少（图)而在此条件下对NCI-H1650细胞的生长无影响。
大约50%的非小细胞肺癌患者在对TKIs初始反应后复发，可检测到EGFR中的T790M突变。它被认为是EGFR-TKIs获得性抗性的标志。我们的结果表明，化合物968与厄洛替尼联合使用可以克服非小细胞肺癌患者对厄洛替尼特的获得性耐药性，尤其是EGFR（T790M）突变。
化合物968通过阻断HCC827ER细胞的谷氨酰胺酶活性逆转获得性埃洛替尼耐药
EGFR是埃洛替尼的靶点，我们想知道化合物968是否通过抑制EGFR来克服获得性埃洛替尼耐药。我们用化合物968研究了EGFR和GAC在HCC827和HCC827ER细胞中的表达。化合物968以剂量和时间依赖性的方式降低了HCC827细胞中EGFR和GAC的表达（图). 有趣的是，尽管化合物968抑制了HCC827ER中GAC的表达，但即使在最高浓度（10μM）和最长治疗时间（48 h）下，化合物968也没有降低HCC827 ER细胞中EGFR的表达（图). 我们进一步评估了化合物968与厄洛替尼联合使用对HCC827和HCC827ER细胞中EGFR和GAC表达的影响。EGFR在HCC827细胞中的表达水平（图，左面板）高于HCC827ER细胞（图，右侧面板），而GAC的表达水平相反。虽然化合物968或厄洛替尼单独治疗并没有显著抑制HCC827ER细胞中EGFR的表达，但化合物968和厄洛替尼可明显抑制EGFR表达（图，右侧面板）。这种联合也降低了HCC827ER细胞中GAC的表达水平。波段强度的统计分析如所示图S2。
化合物968通过阻断HCC827ER细胞GAC活性逆转获得性埃洛替尼耐药(A类)HCC827细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用0、1、5和10μM浓度的化合物968处理48小时（左面板）或用10μM化合物968治疗0、12、24和48小时（右面板）。Western blot检测EGFR和GAC的表达。(B类)HCC827ER细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，并用0、1、5和10μM浓度的化合物968处理48小时（左面板）或用10μM化合物968治疗0、12、24和48小时（右面板）。Western blot检测EGFR和GAC的表达。(C类)HCC827（左面板）和HCC827ER（右面板）细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，分别用化合物968（10μM）、埃洛替尼（1μM）或化合物968和埃洛替尼加用（1μM）处理48小时。Western blot检测EGFR和GAC的表达。(D类)HCC827和HCC827ER细胞在添加10%FBS的RPMI 1640中培养，分别用化合物968（10μM）、埃洛替尼（1μM）或化合物968与埃洛替尼联用48小时，然后从不同细胞中分离线粒体，用谷氨酰胺酶活性测定法测定GAC活性。数据表示三个独立实验的平均值（平均值±SD）**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
为了了解化合物968逆转HCC827ER细胞获得性埃洛替尼耐药的分子机制，我们测试了人类非小细胞肺癌细胞中GAC的酶活性（图). HCC827ER细胞的GAC活性略高于HCC827细胞。与未经处理的细胞相比，化合物968单独处理可使HCC827ER细胞的GAC活性降低约40%，但与未经治疗的细胞相比化合物968和厄洛替尼联合处理可使GAC活性抑制约70%(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). 所有这些结果表明，组合治疗通过抑制EGFR和GAC的表达，并进一步抑制GAC活性，从而有效逆转获得性埃洛替尼耐药性。
化合物968和厄洛替尼联合降低HCC827ER细胞的谷氨酰胺和糖酵解代谢
为了探索厄洛替尼耐药非小细胞肺癌细胞的代谢组学特征，并了解细胞的代谢适应性，我们进行了1H 1D NMR实验来分析这些细胞中的代谢物变化。HCC827和HCC827ER细胞的代谢谱分析结果确定了负责HCC826和HCC82 7ER细胞之间不同表型的代谢物（图). 与HCC827细胞相比，HCC827ER细胞中的谷氨酰胺和糖酵解代谢显著上调。包括谷氨酰胺在内的代谢物浓度（图, **P（P）<0.01），谷氨酸（图, *P（P）<0.05），葡萄糖（图, *P（P）<0.05）和乳酸（图, *P（P）在HCC827ER细胞中，当化合物968与厄洛替尼联合使用时，浓度降低。有趣的是，HCC827ER细胞储存了丰富的三磷酸腺苷（ATP）用于细胞代谢（图, ***P（P）<0.001），ATP浓度从29.8μM大幅下降到4.1μM(**P（P）<0.01）。共检测到64种代谢物1核磁共振氢谱分析见表S1图中显示了糖酵解和谷氨酰胺代谢产物的简单路径图这些结果清楚地表明，与HCC827细胞相比，HCC827ER细胞中的糖酵解和谷氨酰胺代谢增强。综上所述，我们可以得出结论，化合物968通过抑制谷氨酰胺代谢和糖酵解，逆转非小细胞肺癌获得性埃洛替尼耐药。
化合物968和厄洛替尼联合抑制谷氨酰胺和糖酵解代谢谷氨酰胺的浓度(A类)，谷氨酸(B类)，葡萄糖(C类)，乳酸(D类)和ATP(E类)在HCC827、HCC827ER细胞或用化合物968（10μM）联合厄洛替尼（1μM）处理的HCC827%细胞中检测到。数据代表三个独立实验的平均值（平均值±标准差）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (F类)本研究中糖酵解和谷氨酰胺代谢产物的总图。
讨论
表皮生长因子受体（EGFR）是一种酪氨酸激酶受体，在调控细胞增殖、存活和凋亡等多种细胞过程中发挥着重要作用。它是HER家族的成员，其中还包括HER2（ErbB2）、HER3（ErbB3）和HER4（ErbB4）[32,33]. 由基因突变或基因扩增或两者共同引起的EGFR信号通路的组成性激活已被证明与非小细胞肺癌的发生、发展和不良预后密切相关[34]. 因此，EGFR成为非小细胞肺癌治疗的标志性靶点之一。然而，几乎所有最初对吉非替尼或埃洛替尼有显著反应的患者最终大多在6-12个月内对其产生耐药性，这被定义为“获得性耐药性”[12]. 因此，迫切需要制定有效的战略来克服阻力。
在本研究中，我们探索了一种通过抑制谷氨酰胺代谢来克服非小细胞肺癌获得性埃洛替尼耐药性的新方法。癌细胞中谷氨酰胺代谢增强已被用于癌症诊断和治疗。因此，GLS酶近年来已成为小分子治疗干预的关键靶点[35]. 设计并合成了几种谷氨酰胺酶抑制剂，用于靶向谷氨酰胺代谢治疗癌症。然而，由于毒性和副作用，它们仍然没有用于癌症治疗[34–36]. 在我们之前的工作中，当我们研究Rho GTPases调节的细胞转化时，我们发现了一种新型谷氨酰胺酶抑制剂复合物968，它能有效抑制乳腺癌细胞的生长，但对正常人乳腺上皮细胞和3T3细胞的生长和形态无影响[23]. 为了检查化合物968是否对肺细胞系有副作用，我们使用原代人支气管上皮（HBE）细胞进行了在补充方法结果表明，即使在40μM浓度下，化合物968也不影响HBE细胞的增殖、凋亡和细胞周期(图S3)表明化合物968对正常肺细胞也有低或无毒性作用。
最近，研究人员发现，不仅在对厄洛替尼敏感的非小细胞肺癌细胞中，而且在对厄洛替尼耐药的细胞中，谷氨酰胺的摄取和GAC的表达也显著增强[21,22]. 在我们的研究中也观察到类似的结果，我们发现GAC在HCC827ER细胞中的表达远高于HCC827细胞。我们还发现化合物968抑制了埃洛替尼耐药的NSCLC细胞株HCC827ER的细胞生长，表明化合物968使HCC827 ER细胞对埃洛替尼复敏在体外为了找出化合物968使HCC827ER细胞对埃洛替尼再敏感的分子机制，我们检查了不同治疗方法的EGFR表达水平。尽管埃洛替尼或化合物968单独治疗对EGFR的表达没有影响或作用较弱，但化合物968和埃洛替尼的组合明显降低了EGFR的表达。这可以解释为什么化合物968和厄洛替尼联合使用对HCC827ER细胞的生长具有协同抑制作用，因为它们不仅抑制GAC，而且也抑制EGFR。
在EGFR激酶结构域790位（T790M）用蛋氨酸替代苏氨酸的突变似乎发生在约50%对EGFR-TKIs获得性耐药患者的肺腺癌中[13,36,37]. 因此，EGFR中的T790M突变被认为是获得性抗EGFR-TKIs的标记。患者对EGFR抑制剂产生获得性耐药性的另一个机制是通过扩增遇见致癌基因[38,13]. 大约5-20%的非小细胞肺癌患者接受了遇见经EGFR-TKI长期治疗后[39]. 2010年，Kenichi Suda等人报告称，HCG827ER是一种对HCC827产生的埃洛替尼获得性耐药的细胞系，其遇见无EGFR T790M突变的扩增[40]. 因此，针对T790M突变体和遇见扩增可能是克服EGFR-TKIs获得性耐药性的潜在策略。在我们的实验中，使用与EGFR突变相关的几个典型人类NSCLC细胞系来研究化合物968和厄洛替尼对细胞生长的抑制作用。化合物968与埃洛替尼联合显著降低了携带遇见扩增和带有T790M突变体的NCI-H1975细胞。它还适度抑制EGFR野生型A549细胞的生长。然而，化合物968和厄洛替尼的联合使用并没有阻止PTEN突变的NCI-H1650细胞的增殖。这些结果表明，化合物968和厄洛替尼联合使用可以逆转EGFR（T790M）突变株和EGFR突变株对非小细胞肺癌获得性埃洛替尼耐药遇见放大。对于非小细胞肺癌获得性EGFR-TKIs耐药性的治疗，这种联合治疗应该是一种有希望的治疗策略。
癌细胞的代谢特征与正常细胞不同，鉴定与埃洛替尼耐药HCC827ER细胞相关的代谢谱有助于了解细胞的代谢适应性。与HCC827细胞相比，HCC827ER细胞中的谷氨酰胺和糖酵解代谢增强，这与以前的报道一致[21]. 有趣的是，化合物968与厄洛替尼合用不仅抑制谷氨酰胺代谢，还抑制糖酵解。这些结果表明，化合物968和厄洛替尼联合使用通过抑制整个细胞代谢而不仅仅是谷氨酰胺途径来抑制厄洛替尼可抵抗的NSCLC细胞的生长。
所有这些结果表明，EGFR和GAC在调节癌细胞功能中起着关键作用。用EGFR抑制剂治疗，如厄洛替尼和吉非替尼，可能会引起多种副作用，包括皮疹、急性肺病和腹泻[44,45]. EGFR-TKI和GAC抑制剂的组合可以优化抗肿瘤疗效和安全性，并为EGFR-TKI耐药的NSCLC提供新的治疗策略。
材料和方法
试剂
化合物968购自Calbiochem（默克Millipore，Darmstadt，德国）。盐酸埃洛替尼从Biovision Inc.获得。化合物968、埃洛替尼布、吉非替尼和顺铂溶解在二甲基亚砜中，并以指定浓度使用。抗β-肌动蛋白抗体和二级抗体购自Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）。小鼠EGFR单克隆抗体来自Becton、Dickinson和Company。兔多克隆GAC抗体是由一家公司制造的。RPMI 1640培养基（含300 mg/L L-谷氨酰胺）和高级RPMI 1640-培养基（不含L-谷氨酸）购自GIBICO（加利福尼亚州卡尔斯巴德，美国）。结晶紫和其他分析级化学品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。
细胞培养
人非小细胞肺癌细胞株HCC827(表皮生长因子受体外显子19缺失[delE746-A750]）和埃洛替尼耐药HCC827ER细胞遇见基因扩增由孙世勇教授（美国埃默里大学医学院血液与肿瘤医学系和Winship癌症研究所）提供。如前所述，HCC827ER细胞通过长期暴露于厄洛替尼浓度增加的环境中而发育[40]. 野生型（A549）和突变型[NCI-H1975（L858R，T790M），NCI-H1650（磷酸酶和张力蛋白同源物丢失）]EGFR-表达细胞系来自美国型培养物收集（ATCC）。所有细胞系均在RPMI-1640培养基中培养，并在37°C的湿度为5%的CO中添加10%的FBS2孵化器。
细胞增殖试验
将HCC827、HCC827ER、NCI-H1975、NCI-H2650和A549细胞接种在24孔板中，密度为每孔2000个细胞，置于0.5 ml培养基中。在埃洛替尼耐药性检测中，用一系列浓度的埃洛替尼来处理细胞（0.01、0.05、0.1、0.5、1和2μM）。对于厄洛替尼和化合物968的联合检测，分别用化合物968、或厄洛替尼布或化合物968与厄洛替宁联合处理细胞。培养48小时后，将细胞固定在10%福尔马林中，并用0.1%结晶紫染色。用10%乙酸萃取染料，并在595nm处测定相对增殖。
软琼脂试验
对HCC827和HCC827ER细胞进行胰蛋白酶消化并计数，1×104细胞在含有10%FBS的0.3%琼脂培养基中用埃洛替尼（1μM）或二甲基亚砜重新悬浮。将混合物铺板在补充有0.5%琼脂糖和10%FBS的RPMI-1640固化层的顶部。每周通过添加1ml含有10%FBS的0.3%琼脂培养基和埃洛替尼（1μM）或二甲基亚砜给细胞喂食。2周后，对大于50μm的菌落进行评分，并计算软琼脂中的细胞生长。
在无谷氨酰胺培养基中生长
将HCC827和HCC827ER细胞接种到12孔培养板（1×10）中5每个孔的细胞数），并允许一夜粘附在孔上。用不含L-谷氨酰胺（300 mg/L）的高级RPMI 1640培养基更换培养基。从第1天到第6天培养细胞，通过细胞增殖试验测定细胞生长。
敲除和转染
在敲除实验中，在siRNA转染前一天接种细胞，以在转染时达到50%的融合率。如前所述，使用了GAC的三种不同的隐形siRNA（Invitrogen，Cat.HSS104192；HSS104193；HSS178458）[28]. 采用非特异性寡核苷酸作为阴性对照，通过Western blot检测敲除效率。在第2天、第4天和第6天通过结晶紫染色测定GAC敲除后的细胞增殖。对于基于质粒的转染，在转染前一天接种转染GAC siRNA 24小时的细胞，以在转染当天达到80%的融合率。然后，用2μg pCDNA 3.1-V5-GLS转染细胞[28]. 在第2天、第4天和第6天，通过蛋白质印迹测定挽救效率，并通过结晶紫染色测定细胞增殖。
饱和密度测定
如前所述进行饱和密度分析[46]. 简单地说，将融合率为70%至80%的细胞进行胰蛋白酶处理，并将其接种到12孔培养板（1×105每孔细胞数）。让细胞贴在微孔上过夜，然后计数（第0天）。用含有化合物968（0、5、10、20和40μM）的新鲜培养基每2天更换一次培养基。在第6天通过血细胞仪对细胞进行计数。
谷氨酰胺酶活性测定
如前所述测定谷氨酰胺酶活性[28,47]进行了一些修改。将分离的线粒体与57 mM三醋酸钠（pH 8.6）和0.225 mM EDTA在37°C下旋转培养，最终体积为110μL，最终浓度为17 mM。反应持续1小时，并通过添加10μL冰镇3M氯化氢（HCl）停止。将一等分淬火反应混合物（10μL）添加到含有114 mM Tris-HCl（pH 9.4）、0.35 mM二磷酸腺苷（ADP）、1.7 mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和6.3 U/ml谷氨酸脱氢酶的培养液中，得到最终体积446 ml。将反应混合物在室温下培养45 min。在340 nm波长下读取每个样品的吸光度，并计算谷氨酰胺酶活性。
蛋白质印迹分析
细胞在含有磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）的裂解缓冲液中进行裂解，蛋白质浓度由BCA蛋白检测试剂盒（Pierce Biotechnology）测定。对总蛋白（20–40 mg）进行SDS-PAGE并转移到PVDF膜（Milipore）。用5%脱脂牛奶封闭膜，并用β-肌动蛋白、EGFR和GAC抗体孵育。清洗3次后，在室温下将膜与辣根过氧化物酶偶联二级抗体孵育1小时。使用增强化学发光检测试剂盒（ECL；Amersham Biosciences UK Ltd，Little Chalfont，UK）对蛋白质进行可视化。使用ImageJ软件对谱带强度进行密度定量。
代谢分析
获得代谢组学图谱以评估HCC827和HCC827ER细胞各种细胞代谢物的相对分布。收集细胞并快速冷冻。Anachro Technologies Inc.（中国武汉）使用其描述的方法进行了进一步的样品制备、代谢分析、峰鉴定和管理[48,49]. 所有NMR实验均在安捷伦DD2 600 MHz光谱仪上进行(1H共振频率）配备三重共振低温探头。使用软件Chenomx NMR Suite 8.0（加拿大埃德蒙顿Chenomx公司）从1D NMR数据中鉴定细胞中的代谢物。
统计分析
结果以平均值±标准偏差表示。代谢物浓度从Chenomx软件导出，并对所有数据集进行主成分分析（PCA），以评估总体模式并检查异常值。通过单因素方差分析测试统计显著性P（P）-小于0.05的值被视为具有统计学意义。所有统计分析均使用GraphPad Prism 5.0进行。
致谢和资金
本研究部分得到了中国国家自然科学基金（8137282331360282）、江西省教育厅（科学技术罗迪项目）资助的J-B Wang。
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