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Oncotarget公司。2016年1月5日；7(1): 446–458.
2015年11月9日在线发布。 数字对象标识：10.18632/肿瘤靶点6371
预防性维修识别码：项目经理4808010
PMID：26623559

白细胞介素-6抑制通过在人骨肉瘤裸鼠模型中循环肿瘤细胞减少肿瘤自接种

张英龙,#1 琼马,#1 刘涛（Tao Liu）,#1 关国锋,#2 张开良,三 陈佳彦,4 楠佳,1 石咀岩,1 陈观音,1 刘士伦,1 郭江,1 姚璐,1 温燕华,1 赵海恩（Haien Zhao）,1 Yong Zhou（永州）,1 清羽扇,1和邱秀春1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

循环肿瘤细胞（CTCs）的肿瘤自接种可促进肿瘤的进展和复发。之前，我们证明了CTC的肿瘤自接种发生在骨肉瘤中，并揭示了白细胞介素-6（IL-6）可能促进CTC的吸引。在这里，我们研究了白细胞介素-6在CTC肿瘤自接种中的潜在机制。IL-6抑制被抑制在体外细胞增殖、迁移和侵袭。此外，rhIL-6激活Janus活化激酶/信号转导子和转录激活子3（JAK/STAT3）和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2（MAPK/ERK1/2）途径在体外两种途径都增加了细胞增殖，但只有JAK/STAT3途径促进了迁移。抑制IL-6被抑制体内肿瘤生长和转移。IL-6抑制或JAK/STAT3通路抑制减少了原发性肿瘤中CTC的播散。总之，IL-6促进CTC在裸鼠模型中的肿瘤自接种。这一发现可能为未来预防骨肉瘤进展和复发的治疗干预提供一种新的策略。

关键词：骨肉瘤、循环肿瘤细胞自接种肿瘤、白细胞介素-6、转移、复发

简介

骨肉瘤是一种恶性、高转移性癌症，主要发生在儿童和青少年。在采用联合化疗之前，>90%的骨肉瘤患者出现肺转移[1]. 目前，约75%的非转移性骨肉瘤患者可以治愈[1,2]. 然而，伴有肺或骨转移的骨肉瘤患者的5年生存率仍约为25-50%[2]. 复发患者预后较差。他们的生存率<20%，并且没有明确的二线化疗药物[1,三,4]. 因此，转移和复发是骨肉瘤治疗的难题。

肿瘤复发的一个主要原因是循环肿瘤细胞（CTC）数量的增加，一些化疗耐药的CTC可能成为治疗后复发的根源[5]. CTCs的肿瘤自播种补充了传统的转移理论，该理论强调CTCs从原发肿瘤向血流的单向运动，然后播种远处器官形成转移[6]. 肿瘤自接种涉及CTC循环回到原发肿瘤，促进原发肿瘤生长和疾病进展[7]. CTC的双向循环和植入为术后患者肿瘤复发提供了新的解释。复发可能是由于CTC将残留肿瘤细胞最少的局部部位重新植入或转移到残留的肿瘤基质中所致[8]. 乳腺癌、结肠癌和黑色素瘤中已证实CTC的肿瘤自种[7,9]. 此外，我们证明它也发生在骨肉瘤中[10]. 骨肉瘤细胞分泌的细胞因子，如白细胞介素6（IL-6），可促进CTC的招募和接种[10]. 在本研究中，我们探讨了IL-6在肿瘤自接种中的作用及其机制。

IL-6不仅由T细胞、单核细胞和成纤维细胞分泌，还由乳腺癌、前列腺癌和肺癌细胞分泌[11]. IL-6刺激B细胞分化并促进抗体生成[11,12]. 在癌症发展中，IL-6促进增殖、血管生成、迁移、侵袭和转移[13]. IL-6通过Janus活化的激酶/信号转导子和转录激活子3（JAK/STAT3）、有丝分裂原活化的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶1/2（MAPK/ERK1/2）和磷脂酰肌醇3-激酶/Akt（PI3K/Akt）途径发出信号，所有这些都与癌症和转移有关[14].

在这项研究中，我们报告IL-6抑制抑制在体外和体内骨肉瘤的生长和转移。此外，我们发现IL-6激活STAT3和ERK通路。我们使用隐丹参酮和法国财务报告180204STAT3和ERK通路的抑制剂，分别证明STAT3增加迁移和增殖，而ERK只增加增殖。我们还发现，抑制IL-6或STAT3通路可显著降低原发性肿瘤中的CTC种子。总之，IL-6和活化的STAT3通路是CTC抑制肿瘤自接种的新靶点，CTC具有抑制骨肉瘤进展和提高生存率的巨大潜力。

结果

人骨肉瘤细胞系SOSP-9607及其亚系F5M2和F4表达IL-6

使用IL-6免疫细胞化学，我们发现人骨肉瘤细胞系SOSP-9607及其亚系F5M2和F4表达IL-6（图​（图1a）。1a个). 与这些骨肉瘤细胞相比，人成骨细胞系hFOB 1.19几乎不表达IL-6（图​（图1a）。1a个). 我们用Western blotting证实所有这些细胞株都表达IL-6。通过ImageJ软件、单向方差分析和Newman-Keuls多重比较试验分析，我们发现骨肉瘤细胞（SOSP-9607、F5M2和F4）表达的IL-6水平高于正常成骨细胞（hFOB 1.19）(对<0.001，图1b和1c). 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）结果与Western blotting结果一致（图​（图1d1天).

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骨肉瘤细胞中IL-6的表达及shRNA介导的抑制

a。免疫细胞化学检测IL-6在SOSP-9607、F5M2和F4骨肉瘤细胞和对照hFOB1.19正常人成骨细胞中的表达（200×）。b。Western blotting显示IL-6蛋白在SOSP-9607、F5M2和F4人骨肉瘤细胞和对照hFOB1.19正常人成骨细胞中的表达。c。ImageJ软件分析的相对IL-6蛋白表达水平。所有骨肉瘤细胞比正常成骨细胞表达更多的IL-6(对< 0.001).d。qRT-PCR结果显示IL-6 mRNA在SOSP-9607、F5M2和F4人骨肉瘤细胞和对照hFOB1.19正常人成骨细胞中表达。所有骨肉瘤细胞比正常成骨细胞表达更多的IL-6(对< 0.001).e、。qRT-PCR结果显示shRNA沉默后IL-6 mRNA水平。shRNA显著抑制SOSP-9607和F5M2细胞系中IL-6 mRNA的表达(对< 0.001).f、。shRNA沉默后通过蛋白质印迹检测IL-6蛋白。g、。ImageJ分析了IL-6蛋白的相对表达水平。shRNA可有效抑制SOSP-9607和F5M2细胞中IL-6蛋白的表达(对< 0.001).小时。GFP-9607、9607-shIL-6、GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞的GFP荧光图像（200×）*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001.

小发夹RNA（shRNA）显著抑制人骨肉瘤细胞中IL-6的表达

shRNA显著降低SOSP-9607和F5M2细胞中IL-6的表达。qRT-PCR显示，shRNA-2使SOSP-9607细胞中IL-6的表达降低了79.94%，而shRNA-1使F5M2细胞中IL-1的表达降低87.30%（图​（图1e）。第1页). 针对IL-6蛋白的Western blotting和使用ImageJ软件的数据分析表明，shRNAs使IL-6表达降低了>70%（SOSP-9607或F5M2；图1f和1g). 这些细胞的绿色荧光蛋白（GFP）图像如图所示​图1h1小时.

IL-6敲除降低人骨肉瘤细胞的增殖能力

使用基于四氮唑染料（MTT）的细胞生长检测，我们发现稳定的IL-6敲除降低了SOSP-9607的增殖率(对<0.001，图​图2a）2年)和F5M2电池(对<0.001，图​图2b）2亿)与相应的控制单元进行比较。集落形成分析表明，对于两种SOSP-9607，稳定的IL-6敲除细胞形成的集落少于对照细胞(对<0.01，数字2c和2d)和F5M2电池(对<0.001，数字2e和2f).

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shRNA治疗后抑制细胞增殖、迁移和侵袭

a。GFP-9607和9607-shIL-6细胞的MTT分析。9607-shIL-6细胞的增殖率明显低于GFP-9607细胞(对< 0.001).b。GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞的MTT分析。F5M2-shIL-6细胞的增殖率显著低于GFP-F5M2细胞(对< 0.001)c。GFP-9607和9607-shIL-6细胞集落形成分析的代表性图像。d。9607-shIL-6细胞的集落形成效率显著低于GFP-9607细胞(对< 0.01).e、。GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞集落形成分析的代表性图像。f、。F5M2-shIL-6细胞的集落形成效率显著低于GFP-F5M2细胞(对< 0.001).g、。Transwell迁移测定中GFP-9607和9607-shIL-6细胞的代表性图像。小时。9607-shIL-6细胞的迁移率低于GFP-9607细胞(对< 0.001).i、。Transwell侵袭试验中GFP-9607和9607-shIL-6细胞的代表性图像。j。9607-shIL-6细胞的侵袭能力低于GFP-9607细胞(对< 0.001).k、。Transwell迁移分析中GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞的代表性图像。l、。F5M2-shIL-6细胞的迁移率低于GFP-F5M2细胞(对< 0.001).米。Transwell侵袭试验中GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞的代表性图像。n.（名词）。F5M2-shIL-6细胞的侵袭能力低于GFP-F5M2细胞(对< 0.001). *对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001.

IL-6敲除减少人骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

与对照组相比，在Transwell迁移试验中，两组SOSP-9607的IL-6敲除细胞穿过插入物的数量显著降低（图2克和2小时,对<0.001）和F5M2电池（图2k和2l,对< 0.001). 这些Transwell侵入分析结果与两种SOSP-9607中的迁移减少一致（图2i和2j,对<0.001）和F5M2电池（图2米和2米,对< 0.001).

rhIL-6通过激活JAK/STAT3和MAPK/ERK1/2通路刺激F5M2细胞

我们测量了JAK/STAT3、MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt途径磷酸化的变化（图​（图3a）。3a年). rhIL-6治疗后，p-STAT3增加，并在5分钟、15分钟和30分钟时保持磷酸化。磷酸化随后消失。p-ERK1/2在5min和15min时增加，但在30min时磷酸化几乎消失，然后完全消失。p-AKT水平没有变化，几乎没有磷酸化。总STAT3、总ERK1/2、总AKT和内部对照β-微管蛋白的表达始终一致。

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rhIL-6治疗后F5M2细胞的信号通路激活

a。根据Western blotting，p-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT、STAT3，p-ERK1/2和AKT的表达变化。在rhIL-6治疗的前30分钟检测到p-STAT3和p-ERK1/2，表明rhIL-6激活JAK/STAT3和MAPK/ERK1/2通路，但不激活PI3K/AKT通路。b。不同浓度STAT3抑制剂隐丹参酮或ERK1/2抑制剂处理F5M2细胞的MTT分析法国财务报告180204与对照DMSO相比，这两种抑制剂都降低了F5M2细胞的增殖(对< 0.001). 隐丹参酮的抑制作用比FR180204型(对< 0.001). 预计违约概率50隐丹参酮=19.03μM和ED50法国财务报告180204=89.20微米。c。在rhIL-6孵育前用50μM隐丹参酮预处理F5M2细胞有效降低p-STAT3水平。d。用2μM预处理F5M2细胞法国财务报告180204rhIL-6孵育前有效降低p-ERK1/2的表达。e、。在Transwell迁移分析中，在rhIL-6孵育之前，F5M2细胞在有或无抑制剂治疗下的代表性图像。f、。隐丹参酮，但不是法国财务报告180204rhIL-6显著抑制细胞迁移(对< 0.001). *对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001.

STAT3和ERK1/2抑制剂抑制F5M2细胞增殖

用不同浓度的STAT3抑制剂隐丹参酮或ERK1/2抑制剂处理F5M2细胞后法国财务报告180204在24小时内，我们使用MTT分析测量光密度（图​（图3b）。3亿). 抑制剂组的吸光度随着抑制剂浓度的增加而降低(对< 0.001). 对照DMSO组无明显变化(对> 0.05). 与DMSO对照组相比，这两种抑制剂都降低了F5M2细胞的增殖(对< 0.001). 隐丹参酮对增殖的抑制作用明显高于法国财务报告180204(对< 0.001). 使用ED50计算软件，我们发现隐丹参酮的ED50为19.03μM法国财务报告180204ED50为89.20μM。

STAT3抑制剂隐丹参酮抑制F5M2细胞迁移

使用Western blotting和ImageJ软件分析，我们发现用50μM隐丹参酮或2μM法国财务报告180204将p-STAT3或p-ERK1/2的表达分别减少约相同程度（超过70%）（图3c和3d). 因此，我们使用50μM隐丹参酮和2μMFR180204型因为它们具有类似的抑制磷酸化的能力。使用Transwell迁移分析（图3e和3f)，我们发现rhIL-6治疗组的迁移细胞数量高于阴性对照组(对< 0.001). 此外，rhIL-6和隐丹参酮治疗组的迁移细胞数量明显低于rhIL-6治疗组(对<0.001），但rhIL-6-和法国财务报告180204-治疗组无显著差异(对> 0.05).

IL-6 shRNA抑制裸鼠原发性肿瘤的生长和转移

我们利用骨肉瘤细胞及其IL-6敲除对应物建立了原发性肿瘤。F5M2-shIL-6肿瘤的生长速度比对照组GFP-标记的F5M2（GFP-F5M2）肿瘤慢（图​（图4a）4a类)基于肿瘤体积（图​（图4b，4b个,对<0.05）和重量（图​（图4c，4c类,对< 0.05). 血红素-伊红（H&E）染色鉴定了肿瘤组织（图​（图4d）。第4天). 我们在SOSP-9607组中观察到类似的趋势（图​（图4e）第四版)基于肿瘤体积（图​（图4f，第4页,对<0.05），重量（图​（图4g，4克,对<0.05）和H&E染色（图​（图4h）。4小时). 对于F5M2，对照组的肺重量明显大于IL-6敲除组（图4i和4j)和SOSP-9607电池（图4l和4m). 与对照组相比，IL-6敲除组的H&E染色肺组织的转移较少（图4k和4n).

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IL-6 shRNA抑制裸鼠原发性肿瘤的生长和转移

a。裸鼠模型中原发性GFP-F5M2和F5M2-shIL-6肿瘤的代表性图像。b。F5M2-shIL-6组的肿瘤体积小于对照GFP-F5M2组的肿瘤体积(对< 0.05).c。F5M2-shIL-6组的肿瘤重量低于对照GFP-F5M2组(对< 0.05).d。GFP-F5M2和F5M2-shIL-6组原发性肿瘤的代表性H&E染色石蜡包埋切片（200×）。e、。裸鼠模型中原发性GFP-9607和9607-shIL-6肿瘤的代表性图像。f、。9607-shIL-6组的肿瘤体积小于对照GFP-9607组(对< 0.05).g、。9607-shIL-6组的肿瘤重量低于对照GFP-9607组(对< 0.05).小时。原发性GFP-9607和9607-shIL-6肿瘤的H&E染色石蜡包埋切片的代表性图像（200×）。i、。裸鼠模型中GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞肺转移的代表性图像。j。F5M2-shIL-6组的肺重量低于对照GFP-F5M2组(对< 0.01).k、。GFP-F5M2和F5M2-shIL-6组（200×）肺H&E染色石蜡包埋切片的代表性图像。l、。裸鼠模型中GFP-9607和9607-shIL-6细胞肺转移的代表性图像。米。9607-shIL-6组的肺重量小于对照GFP-9607组(对< 0.05).n.（名词）。来自GFP-9607和9607-shIL-6组（200×）的H&E染色石蜡包埋肺切片的代表性图像*对< 0.05, **对< 0.01.

F5M2细胞比F4细胞具有更高的肿瘤自接种能力

在用SOSP-9607细胞系建立原发性肿瘤后，我们用RFP标记的F5M2或F4（RFP-F5M2或RFP-F4）细胞作为CTC建立肿瘤自接种模型。与RFP-F4细胞相比，RFP-F5M2细胞接种原发肿瘤的频率更高（图5a和5b).

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IL-6 shRNA和隐丹参酮均抑制CTC植入原发性肿瘤

利用RFP-F5M2细胞建立肿瘤自接种裸鼠模型的原发肿瘤冰冻切片的代表性荧光图像a。或RFP-F4细胞b。作为CTC。在肿瘤自接种裸鼠模型中，F5M2细胞的接种能力明显高于F4细胞。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染，红色和蓝色荧光图像融合。冷冻切片在荧光观察（200×）后进行H&E染色。c。使用RFP-F5M2细胞作为CTC建立的肿瘤自接种裸鼠模型的GFP-9607原发肿瘤冰冻切片的代表性荧光图像。d。用RFP-F5M2细胞作为CTC建立的肿瘤自接种裸鼠模型的9607-shIL-6原发肿瘤冰冻切片的代表性荧光图像。e、。GFP-9607原发性肿瘤冷冻切片的代表性荧光图像，该肿瘤来自一个用隐丹参酮治疗并用RFP-F5M2细胞作为CTC建立的肿瘤自接种裸鼠模型。用DAPI对所有切片（c、d和e）进行复染，并合并红色、绿色和蓝色荧光图像。与对照组相比，IL-6 shRNA-和隐丹参酮治疗组显示出对CTC种子的抑制。

IL-6 shRNA和隐丹参酮均抑制CTC的肿瘤自接种

在肿瘤自接种模型中用9607-shIL-6细胞或对照GFP-9607细胞建立原发性肿瘤后，与对照组相比，IL-6 shRNA组中RFP-F5M2细胞（CTCs）的接种显著减少（图5c和5d). 然后我们又建立了一个接受隐丹参酮治疗的附加组。与对照组相比，RFP-F5M2细胞接种也显著减少（图5c和5e).

临床骨肉瘤标本IL-6高表达与术后复发显著相关

我们对11例术后复发患者和29例首次手术患者的临床骨肉瘤标本进行了IL-6免疫组化染色。临床骨肉瘤标本中IL-6的高表达与术后复发显著相关（图​（图6，6,对< 0.05).

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骨肉瘤患者IL-6高表达与术后复发的关系

a。临床骨肉瘤标本石蜡包埋切片中IL-6++、++、+和–表达的代表性图像（200×）。用苏木精溶液对所有切片进行复染。b。在骨肉瘤标本中，高IL-6表达（+++）与术后复发密切相关，使用Yates校正的Chi-square检验(对< 0.05).

讨论

骨肉瘤的治疗主要是手术加辅助化疗，单纯原发性肿瘤患者的治愈率约为70%。然而，术后复发仍然是一个复杂的问题[1,三]. 许多骨肉瘤患者术后CTC水平较高[15]. CTC自身植入肿瘤为骨肉瘤复发提供了一种新的解释。我们之前的研究表明，肿瘤自接种发生在骨肉瘤裸鼠模型中，IL-6可能会加速这一过程[10]. 本研究确定IL-6是促进自播种的关键因素，并探讨其潜在机制。

为了研究IL-6在肿瘤自接种中的作用，我们降低了原发性骨肉瘤细胞中IL-6的水平。我们之前证明原发性骨肉瘤细胞（SOSP-9607）比CTC（F5M2或F4细胞）分泌更多的IL-6[10]. 在这项研究中，我们测量了肿瘤细胞中IL-6的表达，发现所有骨肉瘤细胞都表达IL-6。SOSP-9607细胞表达的水平明显较高，与先前的研究结果一致[10]（图1a–1d). 然后，我们使用shRNA敲除IL-6，以确定IL-6的缺失是否抑制了CTC对原发性肿瘤的吸引力。我们使用IL-6 shRNA建立了稳定的IL-6敲除细胞系（图1f–1小时)并与各自的对照组相比，研究shIL-6细胞系的增殖、迁移和侵袭的变化。使用MTT和细胞集落形成分析，我们确定IL-6敲除抑制骨肉瘤细胞的增殖（图2a–2f). 此外，Transwell迁移和侵袭实验表明，IL-6的敲低降低了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭在体外（图2克–2牛顿). 因此，IL-6增加了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭在体外间充质干细胞（MSCs）通过分泌IL-6促进骨肉瘤增殖和转移[16]. 与数量有限的间充质干细胞相比，肿瘤中的原代肿瘤细胞数量更多。我们的研究进一步证明，原代骨肉瘤细胞表达的IL-6在促进生长和转移方面具有更强的作用。

在我们之前的研究中，我们发现rhIL-6对F5M2细胞有吸引力，这可以使CTC接种更有效[10]. 为了进一步探讨CTC吸引IL-6的潜在机制，我们选择rhIL-6和CTC替代F5M2细胞来模拟体内条件。我们研究了三种可能与该过程相关的已知途径，发现JAK/STAT3和MAPK/ERK1/2途径被激活（图​（图3a）。3a年). IL-6诱导STAT3激活，持续激活的STAT3促进许多癌症的增殖和转移[16]. STAT3是一种新型抗癌药物靶点，许多抑制剂正在开发中[17]. 隐丹参酮，提取自丹参Bunge，直接与STAT3的SH2结构域结合，抑制STAT3磷酸化和二聚化[18]. 隐丹参酮抑制前列腺癌细胞生长并诱导其凋亡[18,19]和乳腺癌细胞[20,21]. IL-6也激活了MAPK/ERK通路。激活的ERK参与许多癌症的肿瘤生长、血管生成、凋亡和耐药性[22–25]ERK抑制是一种潜在的癌症治疗方法[26].法国财务报告180204ERK的选择性抑制剂竞争性干扰ATP结合ERK的能力，阻断ERK途径中的蛋白质相互作用[27].FR180204型抑制某些肿瘤细胞的增殖、生长和存活[28,29].

我们使用不同浓度的两种抑制剂进行MTT试验，以揭示它们对骨肉瘤细胞增殖的影响。图​图3b3亿表明隐丹参酮和法国财务报告180204抑制肿瘤细胞增殖，表明这两种途径都参与了骨肉瘤细胞的增殖。隐丹参酮是一种比以前更有效的增殖抑制剂法国财务报告180204为了确定与迁移增加相关的途径，我们使用了Transwell迁移分析，无论是否进行抑制剂治疗。JAK/STAT3通路负责IL-6对细胞迁移的大多数影响（图3e–3f). 因此，我们推测JAK/STAT3通路的激活可能会促进肿瘤自种过程中CTC的吸引。JAK/STAT3通路的激活增强了肿瘤的进展、增殖、侵袭、免疫抑制和治疗抵抗[30,31]. 我们的研究旨在进一步探讨其在CTC促进肿瘤自接种中的作用。

在动物实验中，我们研究了在裸鼠模型中敲低IL-6表达的效果。抑制IL-6可显著降低SOSP-9607和F5M2裸鼠原发肿瘤模型的生长和转移（图​（图4），4)，根据在体外结果（图​（图2）。2). 因此，我们得出结论，IL-6促进了肿瘤的发展。随后，我们使用F5M2亚系作为肿瘤自接种模型中的CTC，而不是我们之前研究中使用的F4亚系[10]因为F5M2细胞更有效地播种（图5a和5b). 我们建立了有或无shRNA或抑制剂治疗的肿瘤自接种模型，发现IL-6 shRNA和隐丹参酮都抑制RFP标记的CTC植入原发性肿瘤（图5c–5e). 因此，IL-6及其活化的STAT3通路可能是CTC阻断肿瘤自接种的有效靶点。

为了进一步研究临床骨肉瘤患者IL-6与肿瘤自接种的相关性，我们对术后复发患者和首次手术患者的标本进行了IL-6免疫组化检测。肿瘤细胞的自接种可能部分解释了术后复发，因为肿瘤周围残留的肿瘤病灶或水肿组织可能会从血流中吸引肿瘤细胞，重新进入局部区域，最终导致或加重复发[7,8]. 术后复发患者IL-6的强阳性表达明显高于对照组（图​（图6）。6). 因此，IL-6的高表达与骨肉瘤患者术后复发密切相关。IL-6可能在临床情况下促进肿瘤细胞的自接种。

总之，IL-6增强了CTC的肿瘤自接种作用。IL-6和活化的JAK/STAT3通路可能是阻断或抑制肿瘤自蔓延的有效靶点。此外，STAT3抑制剂隐丹参酮可能用于延缓肿瘤进展和提高骨肉瘤生存率。对CTC在骨肉瘤中自我植入肿瘤的进一步研究将导致更具体、更全面的治疗。

材料和方法

细胞培养

人骨肉瘤细胞系SOSP-9607由我院建立并维持。从SOSP-9607细胞系中分离出具有不同转移潜能的F5M2和F4亚系[32,33]. 张英龙博士和石珂教授用红色荧光蛋白（RFP）标记F5M2和F4细胞[10]. 所有细胞均在添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基（HyClone，美国）中培养，并在37°C和5%CO的条件下保持2从中国科学院（中国上海）类型培养标本馆购买的人成骨细胞系hFOB 1.19保存在补充了10%FBS（PAA，德国）、L-谷氨酰胺（150 mg/L，Sigma-Aldrich，美国）、NaHCO的DMEM/F12培养基中三（1.5 g/L，Sigma-Aldrich，美国）和G418（0.3 mg/mL，Sigma-Aldrich，美国），温度为33.5°C。

IL-6的免疫细胞化学

隔夜将细胞接种在玻璃盖玻片上。然后用PBS清洗纸片三次，并用4%聚甲醛固定10分钟。在用Triton X-100（美国Sigma-Aldrich）培养20分钟和用5%BSA缓冲液培养1小时后，用多克隆人IL-6抗体（1:200稀释，德国GeneTex）培养细胞。在4°C下培养过夜后，用PBS清洗细胞三次，然后用二级抗体培养1h。再清洗三次后，用DAB溶液培养细胞5min，然后用苏木精复染。安装后，在显微镜下观察细胞，以评估IL-6的表达。

定量RT-PCR

SOSP-9607、F5M2和F4细胞在用冷PBS洗涤三次后用TRIzol试剂（美国生命科技公司）进行裂解。所有样品均送至Sangon Biotech Company（中国上海）进行后续实验。内部控制采用β-肌动蛋白。引物序列如下：人IL-6正向：5′-GGCAGAAAACAACCTGTAACCT-3′，反向：5′-CAAACCCAAAAGAGTGATG-3′；人β-肌动蛋白正向：5′-TAGTTCGTTACACCTTTTG-3′，反向：5′-TCACCTTCACGTTCGT-3′。每个实验重复三次。

靶向IL-6的shRNA

从Hanbio Biotechnology Company（中国上海）购买了三种shRNA靶向人IL-6的慢病毒。慢病毒shRNA-1（CAGCCCTGAGAAAGGAGACATTTAA）用于敲低F5M2细胞中IL-6的表达。慢病毒shRNA-2（GGATTCAATGAGAGACTTGC）用于抑制SOSP-9607细胞中IL-6的表达。通过qRT-PCR和Western blotting评估敲除效率。将稳定的IL-6敲低骨肉瘤细胞（9607-shIL-6细胞或F5M2-shIL-6细胞）及其各自的加扰shRNA对照（GFP-9607细胞或GFP-F5M2细胞）用于随后的实验。

MTT分析

将GFP-9607、9607-shIL-6、GFP-F5M2和F5M2-shIL-6细胞接种到五个96周的培养板中过夜。第二天，从培养箱中取出一个平板，向每个孔（包括空白对照）中添加20μl MTT溶液（5 mg/mL，Sigma-Aldrich，USA）。培养4小时后，向每个孔中添加150μl二甲基亚砜（美国Sigma-Aldrich）。然后摇晃平板，并使用微型平板阅读器（美国热电科学公司）使用490/630-nm过滤器进行测量。每24小时重复一次相同的程序，直到测量最后一块板。每个实验重复三次。

集落形成分析

每孔200个GFP-9607、9607-shIL-6、GFP-F5M2或F5M2-shIL-6细胞接种到6孔板中，一式三份。培养10天后，每孔用PBS洗涤三次，用4%聚甲醛固定10分钟，然后用4%结晶紫溶液染色5分钟。洗涤后，对各组菌落进行计数和成像。菌落形成效率计算如下：菌落形成率=（菌落数/接种细胞数）×100%。每个实验重复三次。

跨井运移和侵入分析

Transwell迁移和侵入分析按照我们之前的研究所述进行[10]. 上部室播种1×105细胞，下腔充满完整的RPMI-1640培养基。仅使用Transwell插入物检测迁移，使用预涂有50μl BD-Matrigel™基底膜基质的插入物检测入侵（1:3稀释，BD Biosciences，USA）。在分析中，将9607-shIL-6或F5M2-shIL-6细胞与其各自的对照细胞进行比较。培养18小时后评估迁移试验，培养22小时后评估入侵试验。每个实验重复三次。

蛋白质印迹

使用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（美国罗氏）的RIPA裂解缓冲液收集细胞裂解物，并按照我们之前的研究所述准备用于印迹检测[34]. 然后，通过电泳分离30μg每个样品，并转移到PVDF膜上，用5%BSA或非脂肪干乳在室温（RT）下封闭1 h，然后在4°C下与初级抗体孵育过夜。IL-6抗体（美国GeneTex）按1:1000稀释。p-STAT3、p-ERK1/2、p-AKT、STAT3，ERK1/2和AKT抗体（美国Bioworld）均以1:500稀释。使用β-微管蛋白（1:2000稀释）抗体（美国Sigma-Aldrich）作为内部对照。第二天，用Tris缓冲盐水和吐温（TBST）洗涤三次，每次5分钟后，在RT下用二级抗体（1:40000）孵育膜1小时。最后，用ECL底物和过氧化物溶液（Genshare Biological，中国）培养膜，并使用Bio-Read成像系统（美国）进行扫描。每个实验重复三次。

细胞信号通路检测

1×10的等分6将F5M2细胞接种到60毫米培养皿中过夜。第二天，更换培养基，用100 ng/ml的rhIL-6溶液培养细胞0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、6小时、12小时、24小时或48小时。如上所述，从不同的治疗时间组收集蛋白质。Western blotting检测（磷酸化）p-STAT3、p-ERK1/2和p-AKT，以及（总）STAT3，ERK1/2及AKT，以确定通路激活。每个实验重复三次。

抑制剂实验

首先，进行MTT分析。STAT3抑制剂隐丹参酮和ERK1/2抑制剂法国财务报告180204（美国塞莱克）稀释至0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100和200μM的浓度，并以二甲基亚砜作为载体对照。F5M2细胞接种于3×10三每口井用96-well板隔夜处理。然后用不同浓度的抑制剂或对照替换培养基。24小时后，对所有平板进行如上所述的MTT分析。然后进行抑制剂效率测试。F5M2细胞接种于1×106每60-mm培养皿隔夜培养细胞。第二天，用上述两种不同浓度的抑制剂替换培养基。经过4小时培养和两次PBS洗涤后，用100 ng/ml rhIL-6溶液替换培养基。在rhIL-6刺激15分钟后，收集所有组的蛋白质进行Western blotting。检测p-STAT3和p-ERK1/2的变化，以确定这两种抑制剂的适当浓度。接下来，进行抑制剂迁移测试。将适当浓度的两种抑制剂应用于F5M2细胞4小时。然后将细胞与100 ng/ml的rhIL-6孵育24小时。最后，收集接受或不接受抑制剂处理以及接受或不进行rhIL-6处理的细胞，进行Transwell迁移分析，如前所述。每个实验重复三次。

动物模型

每只裸鼠（3-4周龄；雌性，n个=20）接种3×106将SOSP-9607细胞注入右腿胫骨平台，建立原发性肿瘤。两周后，将小鼠随机分为两组，分别通过尾静脉注射RFP-F5M2或RFP-F4细胞（1×106每只老鼠的细胞数）。两周后，对各组的原发肿瘤进行解剖，并按前述方法准备冰冻切片[10]. 在荧光显微镜下观察RFP标记细胞的接种条件，并比较两组之间的差异。我们接种了3×106将GFP-F5M2、F5M2-shIL-6、GFP-9607和9607-shIL-6细胞移植到裸鼠体内，以建立原发性骨肉瘤模型(n个= 10). 六周后，处死小鼠观察原发性肿瘤生长和肺转移。除了对肿瘤大小（体积或重量）和肺重量进行宏观比较外，还对肺进行H&E染色以观察转移。另外，3×106GFP-9607和9607-shIL-6细胞分别用于建立原发性肿瘤模型，GFP-9606组分为两组(n个= 10). GFP-9607组每天（每周5天）静脉注射100μg隐丹参酮。另一组GFP-9607和9607-shIL-6组接受等量的生理盐水(n个= 10). 两周后，所有三组均接受RFP-F5M2细胞作为CTC的注射。2-3周后，每组的原发肿瘤被切除并解剖。制作冰冻切片以评估播种条件。

免疫组织化学

选择11例术后复发的骨肉瘤患者和29例首次手术的骨肉瘤患者进行免疫组织化学分析。所有标本均经患者批准后在我院采集。按照说明进行免疫组织化学[10]IL-6抗体按1:100稀释。图像在200×显微镜下采集。如前所述，对免疫染色结果进行评估和分析[34].

统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad-Software Inc.，CA，USA）进行。IL-6 Western blot、qRT-PCR和抑制剂迁移分析数据采用单向方差分析测试和Newman-Keuls多重比较测试进行事后配对比较。用Wilcoxon符号秩检验分析IL-6敲除后的MTT测定数据。采用双向方差分析和Bonferroni事后检验分析两种不同抑制剂的MTT分析数据，并计算ED50值。免疫组化数据采用Chi-square检验和Yates校正进行分析。其他数据用双尾Student’st吨-测试。所有数据均以平均值±标准误差表示，以及对<0.05被认为是显著的。

脚注

基金

本研究得到国家自然科学基金资助（No.81372297，81201633，81272441）。

利益冲突

提交人声明不存在利益冲突。

参考文献

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