Oncotarget公司。2016年1月5日；7(1): 386–401.
MDA-9/Syntenin-Slug转录复合物促进肺腺癌上皮-间质转化和侵袭/转移
,1 ,2,三 ,4 ,1 ,6 ,7 ,8 ,8 ,9 ,4 ,10 ,#11,12和#1,5,8
Szu-Hua Pan公司
2国立台湾大学医学院医学基因组与蛋白质组研究生院，台北
三国立台湾大学医学院转化医学博士学位项目，台湾台北
Yih-Leong Chang先生
4国立台湾大学医学院病理学系和病理学研究生院，台湾台北
Shih-Han Kao先生
6中国医科大学肿瘤医学研究中心，台湾台中
Shuenn-Chen Yang先生
8中国科学院生物医学研究所，台湾台北
陈图武
4国立台湾大学医学院病理学系和病理学研究生院，台湾台北
谢明红
11台湾台南国立成工大学基础医学研究所
12台湾台南国立成工大学临床医学研究所
杨泮池
1国立台湾大学医学院内科，台北
5台大基因组医学中心，国立台湾大学医学院，台湾台北
8中国科学院生物医学研究所，台湾台北
1国立台湾大学医学院内科，台北
2国立台湾大学医学院医学基因组与蛋白质组研究生院，台北
三国立台湾大学医学院转化医学博士学位项目，台湾台北
4国立台湾大学医学院病理学系和病理学研究生院，台湾台北
5国立台湾大学医学院南洋理工大学基因组医学中心，台湾台北
6中国医科大学肿瘤医学研究中心，台湾台中
7台湾高雄长庚纪念医院耳鼻喉科
8中国科学院生物医学研究所，台湾台北
9台湾桃园核能研究所同位素应用处
10台湾台中退伍军人总医院医学研究部
11台湾台南国立成工大学基础医学研究所
12台湾台南国立成工大学临床医学研究所
#贡献均等。
2015年8月5日收到；2015年10月20日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。
- 补充资料
指南：E90D2B97-7345-49FD-BDC7-80DE701FA2C4
摘要
黑色素瘤分化相关基因-9（MDA-9）/Syntenin是一种新的治疗靶点，因为它在肿瘤进展和胞外体生物发生中起着关键作用。这里我们显示，Slug是一种关键的上皮-间充质转换（EMT）调节因子，是MDA-9/Syntenin下游靶点。有丝分裂原EGF刺激增加Slug表达和MDA-9/Syntenin核移位。MDA-9/Syntenin利用其PDZ1结构域与Slug结合，这种相互作用进一步导致HDAC1募集，Slug转录抑制因子活性上调，Slug-介导的EMT增强，并促进癌症侵袭和转移。PDZ结构域和MDA-9/Syntenin的核定位都是促进Slug介导的癌症侵袭所必需的。临床上，与肺腺癌中低表达患者相比，MDA-9/Syntenin高表达和Slug高表达患者的总生存率较低。我们的研究结果提供了证据，证明MDA-9/Syntenin是Slug的关键适配器，它可以通过转录增强Slug介导的EMT来促进癌症的侵袭和转移。
关键词：Syntenin、Slug、EMT、侵袭、肺腺癌
简介
肺癌死亡率，尤其是非小细胞肺癌（NSCLCs），仍然是全球癌症治疗中的主要医疗问题[1,2]转移是治疗失败的主要原因[2–4]. EMT是转移的关键起始步骤，由一组转录阻遏物调节，包括锌指蛋白，如蜗牛或Zeb家族蛋白[5]. Slug是蜗牛家族的一员，参与许多生理过程，包括中胚层形成、细胞迁移和入侵[6]，Slug表达与非小细胞肺癌的临床结局相关[7–9].
通过各种机制，如泛素介导的蛋白质体降解，鼻塞蛋白在低侵袭性癌细胞中保持在低水平。最近的报道表明，p53/MDM2和GSK-3β/CHIP能够通过调节Slug降解来减少癌细胞的侵袭[7,10,11]. Slug转录抑制E-cadherin的表达，从而促进EMT的发育过程以及癌症的侵袭和转移[12]. 然而，Slug介导的转录控制癌症侵袭的详细调控机制尚不清楚。
黑色素瘤分化相关基因-9（MDA-9）/Syntenin是一种包含两个串联PDZ结构域的支架蛋白。它通过组织蛋白质复合物参与多种细胞过程，从而充当介体，从质膜传递细胞信号，促进细胞内蛋白质运输，或刺激胞外体的产生[13–18]. 最近的研究表明，MDA-9/Syntenin的上调可能通过与质膜上的激酶或受体结合，并在几种癌症中介导P38/NF-κB、Smad信号或AKT通路的激活，从而导致癌症进展[19–28]. 此外，一些研究表明，MDA-9/Syntenin也可能存在于高侵袭性癌细胞的细胞核中，并与癌症进展相关[29,30]. 然而，核MDA-9/Syntenin的功能需要进一步研究。
本研究揭示了MDA-9/Syntenin调控Slug功能和控制癌细胞侵袭/转移的分子机制。此外，EGF刺激可增强MDA-9/Syntenin的核转位，核MDA-9/Syncenin与Slug相互作用，在细胞核内形成转录抑制复合物，增强Slug转录抑制因子活性，促进肺腺癌的EMT、侵袭和转移。
结果
MDA-9/Syntenin与Slug相互作用并共同定位于细胞核
为了确定Slug在癌症侵袭中的调节机制，使用酵母双杂交系统筛选Slug的潜在关联蛋白(图S1A). 在池中发现MDA-9/Syntenin。β-gal分析进一步证实MDA-9/Syntenin与Slug相互作用（图). 为了检测Slug和MDA-9/Syntenin的亚细胞分布及其相互作用，使用GFP标记的Syntenin-和DsRED标记的Slug融合蛋白共同转染到HEK293细胞。结果表明，GFP标记的Syntenin与DsRED标记的Slug蛋白在细胞核中部分共定位（图). 为了检测它们的表达，对CL1-5细胞进行了分离，并且Slug和MDA-9/Syntenin在CL1-5细胞核部分共存（图).
MDA-9/Syntenin与肺腺癌细胞系中Slug相关，其表达水平与侵袭能力呈正相关答：。酵母双杂交试验中MDA-9/Syntenin与Slug的结合。在选择培养基上生长pACT2-MDA-9/Syntenin和pAS2载体中的构建物的选定菌落。载体和α-catulin作为阴性对照。AD，激活域；BD，绑定域。B。瞬时转染pEGFP-Syntenin和pDsRed-Slug的HEK293细胞的共焦图像。C、。CL1-5细胞内源性MDA-9/Syntenin和Slug蛋白分布的Western blot分析。Lamin B和GADPH分别是细胞核和胞浆部分的指示剂。D。通过在H1299细胞或E.公司。CL1-5细胞内源性水平。输入面板显示用于免疫沉淀的1/20全细胞裂解物。F、。对肺腺癌细胞株进行裂解，并通过免疫印迹法直接分析Slug和MDA-9/Syntenin蛋白的表达。
通过过表达和内源性联合免疫沉淀试验来确认MDA-9/Syntenin和Slug在肺腺癌细胞系中的相互作用。结果表明，当MDA-9/Syntenin和Slug蛋白在H1299细胞中均过度表达时，它们相互关联（图). 此外，免疫沉淀法证实了CL1-5细胞中MDA-9/Syntenin和Slug之间的内源性相互作用（图). 还观察到H1299、CL1-5和CL141中MDA-9/Syntenin和Slug的内源性表达水平(图S1B). 总之，这些数据表明，MDA-9/Syntenin和Slug都位于细胞核中，并且相互关联。
由于Slug是一种侵袭性因子，通常在侵袭性癌细胞中高度表达，因此研究了这两种蛋白的表达与细胞侵袭性之间的关系。在包括EKVX、H23、H322M、H522、H520、A549、HOP62、H226、CL1-5和CL141在内的多个肺癌细胞系中，MDA-9/Syntenin和Slug的表达与肺腺癌细胞系的侵袭性呈正相关（图)和四种乳腺癌细胞系(补充图1C)表明MDA-9/Syntenin和Slug可能与细胞侵袭性有关。
MDA-9/Syntenin和Slug均调节肺腺癌细胞系的EMT和侵袭性
为了确定MDA-9/Syntenin和Slug是否影响肺腺癌细胞系的细胞侵袭性，对其表达进行敲除，并在体外进行侵袭试验。靶向MDA-9/Syntenin或Slug的siRNAs或慢病毒转导shRNAs的敲除增加了E-cadherin的表达（图和补充图2A). 此外，在Slug或MDA-9/Syntenin沉默的CL1-5和CL141稳定细胞中，典型的间充质标志物N-钙粘蛋白被抑制，表明这些细胞经历了EMT。
MDA-9/Syntenin增强Slug-介导的E-cadherin调节和细胞侵袭答：。E-cadherin表达水平的测量，B。细胞侵袭，以及C、。瞬时转染siCtl、siSlug或siSyntenin 72 h的CL1-5和CL141细胞的细胞形态。细胞侵袭条形图显示侵袭细胞的平均数量±SD(n个= 3, *对< 0.05, **对< 0.001).D。用Slug和MDA-9/Syntenin表达载体瞬时感染HEK293细胞的细胞侵袭性测量。侵袭细胞表示为平均值±SD(n个= 3, *对< 0.05, **对< 0.001).E.公司。慢病毒感染后72小时，用显微镜拍摄用对照、Slug、MDA-9/Syntenin或Slug+MDA-9/Synctenin表达的HEK293细胞的细胞形态。F、。表达对照、Slug、MDA-9/Syntenin或Slug+MDA-9/Syncentin的HEK293细胞中E-cadherin和vimentin的Western blot分析。（+：MOI=1.5，++：MOI=3）。
沉默Slug或MDA-9/Syntenin在高侵袭性细胞中的表达可降低癌细胞的侵袭性（图)和增强的细胞-细胞粘附（图). 因此，MDA-9/Syntenin和Slug均可促进高侵袭性肺癌细胞的EMT和细胞侵袭性。
MDA-9/Syntenin的过度表达增强了Slug-介导的E-cadherin抑制和癌细胞侵袭性
为了研究MDA-9/Syntenin是否通过调节Slug增强EMT和侵袭，在这两种蛋白表达水平均较低的HEK293细胞中检测了细胞侵袭能力、细胞形态和EMT标记物表达水平的影响(补充图1B). 结果表明，Slug和MDA-9/Syntenin在HEK293细胞中的过度表达分别使癌细胞的侵袭性增加6.72倍和1.44倍。Slug和MDA-9/Syntenin的共同表达显著增加了12.72倍的细胞侵袭性（图). 单独过度表达Slug的细胞和Slug+MDA-9/Syntenin的细胞都有明显的纺锤状形态变化（图). MDA-9/Syntenin表达的增加增强了Slug介导的E-钙粘蛋白抑制和波形蛋白表达的升高（图). 这些数据表明，MDA-9/Syntenin增强了Slug-介导的E-cadherin表达和细胞侵袭性。
MDA-9/Syntenin调节Slug介导的癌症侵袭和转移
为了研究MDA-9/Syntenin是否影响肺腺癌细胞中Slug介导的调节，沉默了MDA-9/Syncenin在CL1-5和CL141细胞中的表达，以确认MDA-9/Syntenin对Slug抑制活性的影响。结果表明，与对照细胞相比，Slug过度表达细胞中E-cadherin的表达降低（图，CL1–5和CL141中的3号车道）。MDA-9/Syntenin的表达在这些细胞中沉默后，E-cadherin表达的减少被逆转（图，CL1-5和CL141中的4号车道）。沉默MDA-9/Syntenin表达下调内源性Slug的活性并增加E-cadherin的表达（图，CL1–5和CL141中的2号车道）。根据这一观察结果，沉默CL1–5和CL141中MDA-9/Syntenin的表达可抑制父母和Slug过度表达细胞中的癌细胞侵袭性（图).
敲低MDA-9/Syntenin表达降低Slug-促进的E-cadherin抑制和癌症侵袭/转移答：。分别用siCtl和siSyntenin瞬时转染表达对照或Slug的CL1-5（左）和CL141（右）细胞。通过Western blotting和RT-PCR分别测定这些细胞中E-cadherin的蛋白和mRNA表达水平。B。侵袭力用Boyden腔侵袭试验测定。侵袭细胞表示为平均值±SD(n个= 3, *对< 0.05, **对< 0.001).C、。MDA-9/Syntenin沉默在鼻塞促转移中的作用体内顶部面板：静脉注射CL1-5/Vector+shCtl、CL1-5/Vactor+shSyncenin-b、CL1-5/Slug+shCt1和CL1-5/Slug+shSynctenin-b稳定细胞的小鼠代表性肺部（黑色箭头表示肺部肿瘤）。下图：苏木精-伊红（H&E）染色对肺部肿瘤进行组织学检查。比例尺，200μm。D。尾静脉注射5周后计算转移瘤结节数(n个=每组6人）。肿瘤结节用平均值±SEM表示。
进一步证明MDA-9/Syntenin的表达是否是Slug介导的肿瘤转移所必需的体内，通过病毒感染建立了具有或不具有MDA-9/Syntenin沉默的CL1–5/载体和CL1–5/Slug稳定细胞，并证实了细胞侵袭能力(补充图2B). 将四组肿瘤细胞直接接种到小鼠尾静脉，并在35天时检测小鼠肺结节的形成。含有CL1-5/Slug+shCtl细胞的小鼠比注射CL1-5/vector+shCt1细胞的鼠出现更多的肺结节（平均数：线向量+shCml的56.33±47.87，线向量+Slug+shCtl的129.66±45.45；对<0.05）（图). 相反，静脉注射MDA-9/Syntenin沉默克隆的小鼠肺结节较少（平均数：Vector+shSyntenin-b系34±12.47，Slug+shSyntenin-b系78.33±29.25，对<0.05）（图). 因此，CL1-5小鼠模型的肺转移支持了MDA-9/Syntenin表达调节Slug介导的肿瘤转移的研究结果体内.
Slug通过连接子区域与MDA-9/Syntenin的PDZ1结构域相互作用
为了检测MDA-9/Syntenin是否通过与Slug相关联而增强EMT，我们生成了一系列缺失突变体，以确定Slug和MDA-9/Syncentin之间的相互作用域（图). SNAG和Slug结构域之间残基氨基酸33–89周围的Slug连接区是与MDA-9/Syntenin相互作用所必需的（图). 另一方面在体外通过MDA-9/Syntenin的不同缺失结构进行GST下拉分析（图和补充图3A)显示Slug蛋白仅存在于含有MDA-9/Syntenin的PDZ1下拉复合物中（图和补充图3A). 该观察结果与酵母双杂交筛选一致，其中包含PDZ1结构域的MDA-9/Syntenin片段与Slug相关(补充图1A).
MDA-9/Syntenin的PDZ1结构域和细胞核定位需要与Slug相互作用答：。显示野生型Slug及其删除结构的示意图。B。将截短的Slug变异体与HA-Syntenin瞬时转染H1299细胞后，用抗Flag抗体对裂解产物进行免疫沉淀，并用SDS-PAGE进行解析。C、。MDA-9/Syntenin及其三个缺失突变体的结构域示意图。D。所示纯化的GST-Syntenin融合蛋白与在体外被HA标记的Slug的翻译蛋白，并被谷胱甘肽珠拉下。通过免疫印迹法测定蛋白质结合。E.公司。在H1299细胞中瞬时转染Flag-Syntenin和HA-Slug变体后，用抗Flag抗体免疫沉淀裂解产物，并通过Western blotting溶解。F、。分别用pEGFP-Syntenin、pEGFP-PDZs和pEGFP-PDZs-NLS质粒瞬时转染HEK293细胞的共聚焦图像。G.公司。CL1–5细胞在无血清培养基中培养12 h，加或不加EGF（40 ng/ml）处理6 h。细胞分离的裂解产物通过免疫印迹法溶解。H。瞬时转染EGFP、EGFP-Syntenin和EGFP-ΔPDZ1质粒的HEK293/载体或HEK293/4lug细胞的细胞分级分析。
为了进一步研究MDA-9/Syntenin的PDZ1结构域是否对Slug的相关性至关重要，免疫沉淀结果显示标记的WT-和ΔPDZ2-Syntenin-与Slug相关（图和补充图3B)，但含有PDZ1的突变体Flag PDZs具有较低的细胞核定位特性[29]，不是。当Flag-PDZs的表达通过标记PDZ的C末端的核引导序列（NLS）而强制进入细胞核时（图)，与Slug的关联性增加（图泳道5），这意味着MDA-9/Syntenin的核定位对于结合Slug至关重要。
有丝分裂原EGF刺激增加MDA-9/Syntenin核移位
为了探讨丝裂原刺激是否调节肺癌细胞中MDA-9/Syntenin的核移位，用重组表皮生长因子（EGF）处理CL1-5细胞，并分析MDA-9/Syncentin的分布。EGF处理提高了Slug蛋白的表达，并显著增加了核部分中MDA-9/Syntenin的水平（图和补充图4B).
为了检测Slug的表达是否影响MDA-9/Syntenin的分布，在HEK293细胞中与DsRED标记的Slug融合蛋白共同表达GFP标记的Syntenin-缺失结构。与Syntenin-ΔPDZ1和-PDZs相比，在Slug表达细胞的细胞核中积聚的Syntenin WT和-ΔPDZ 2更多(补充图4A). 为了证实这些观察结果，在对照细胞或Slug-过度表达的稳定细胞中转染Syntenin-WT和-ΔPDZ1。通过细胞分离检测MDA-9/Syntenin蛋白的分布。对照细胞显示，Slug的分布主要在细胞核部分中检测到，GFP蛋白在胞质部分中检测到（图). 与对照细胞相比，Slug-过表达稳定细胞中的核GFP-Syntenin水平增加了4.3倍。Syntenin-ΔPDZ1的表达消除了这种增加（图). 因此，与Slug的结合促进了细胞核中MDA-9/Syntenin的维持。
MDA-9/Syntenin通过HDAC1募集增强Slug介导的转录抑制
由于MDA-9/Syntenin与Slug结合，因此进一步探讨了MDA-9/Syncenin如何调节Slug功能。据报道，MDA-9/Syntenin可以通过降低Sox4蛋白体降解来增强其转录活性[31,32]. 因此，通过环己酰亚胺试验估计了Slug蛋白在对照细胞或MDA-9/Syntenin表达细胞中的半衰期。结果表明，Slug蛋白的稳定性没有显著改变(补充图5A).
然而，当与MDA-9/Syntenin共同表达时，Slug表达细胞中E-cadherin的mRNA减少（图). 为了阐明MDA-9/Syntenin是否增强Slug阻遏物活性，在HEK293细胞中的3x蜗牛结合位点（SBS）-Gal4荧光素酶报告系统中转染含有或不含MDA-9/Syncenin的Slug。当MDA-9/Syntenin表达呈剂量依赖性升高时，鼻塞抑制活性分别显著增加36.5%和47.4%（图).
MDA-9/Syntenin通过招募辅阻遏物HDAC1促进Slug依赖性转录抑制答：。通过RT-PCR测定表达对照、Slug、MDA-9/Syntenin或Slug+MDA-9/Syncentin的HEK293细胞中E-cadherin mRNA的水平。以Gβ样蛋白的表达水平作为内部对照。B。用表达Slug和Flag-Syntenin质粒的3xSBS荧光素酶报告子转染HEK293细胞48小时。条形图表示荧光素素酶活性的相对表达，标准化为对照肾小球报告子活性±SD(n个= 3, *对< 0.05, **对< 0.001).C、。MDA-9/Syntenin与E-盒寡核苷酸上的Slug相关。EMSA凝胶显示的磷图像分析32P标记的E-box寡核苷酸与在体外翻译蛋白（+：3μl，++：6μl）或带有指示抗体（Ab：抗体，0.3μg）。D。CL1-5细胞E-cadherin启动子上MDA-9/Syntenin、Slug和HDAC1的ChIP-PCR分析。ChIP使用所示抗体检测内源性MDA-9/Syntenin、Slug和HDAC1。E.公司。在H1299细胞中表达所指示的HDAC1-Flag、HA-Syntenin、Slug蛋白的质粒转染后48小时，用抗Flag抗体免疫沉淀细胞裂解物。然后通过Western blotting分析相关蛋白。F、。在E-cadherin启动子上检测CL1-5/shCtl和CL1-5/sh Syncenin-b稳定细胞的HDAC1水平。使用抗HDAC1抗体进行ChIP分析，以IgG作为阴性对照。
为了探讨MDA-9/Syntenin是否影响Slug与E-box序列的结合，使用了EMSA。HA-Slug，而非HA-Syntenin，直接绑定到电气盒序列（图，车道3和4））。然而，HA-Syntenin与E-box探针上的HA-Slug相关（图，车道5）。结果表明，MDA-9/Syntenin通过间接结合Slug靶基因的启动子区域参与Slug阻遏复合物。
为了确定MDA-9/Syntenin是否调节Slug-介导的E-cadherin转录抑制，在CL1-5细胞中进行ChIP分析。MDA-9/Syntenin、Slug和HDAC1参与E-cadherin启动子区体内（图). 此外，还观察到MDA-9/Syntenin与HDAC1的关联在体外和体内(补充图5B和图). 此外，在MDA-9/Syntenin敲除细胞中，E-cadherin启动子上的HDAC1减少，这意味着MDA-9/Syncenin作为介质促进HDAC1与E-cadherin启动子的结合（图). 这些数据表明，MDA-9/Syntenin通过向E-box元件招募共同阻遏物HDAC1来增强Slug的阻遏活性。
MDA-9/Syntenin增强的Slug-介导的E-cadherin抑制和癌症侵袭依赖于其核定位和联合阻遏物募集
Slug-介导的E-cadherin抑制需要MDA-9/Syntenin的PDZ结构域（图). 为了确定增强的Slug介导的细胞侵袭是否需要PDZ结构域和MDA-9/Syntenin的核存在，在HEK293细胞中检测到每个MDA-9/Syncenin缺失突变体存在时，检测到Slug中介的细胞侵袭性，并在补充图6A结果表明，Syntenin-ΔPDZ1消除了与Slug的相互作用，导致Slug介导的细胞入侵增强完全丧失（图). 值得注意的是，Syntenin-PDZs消除了侵袭，而Syntenin-PDZs-NLS与Slug轻度相关，部分增强了侵袭（图)这意味着MDA-9/Syntenin的核定位在增强Slug介导的癌症侵袭中至关重要。此外，Syntenin-ΔPDZ2并没有增加细胞侵袭性，也没有增强Slug-介导的E-cadherin抑制，尽管该突变体在细胞核中被转位(补充图4A)并绑定到Slug（图). 这些发现表明，MDA-9/Syntenin的PDZ结构域和核定位都需要促进Slug介导的细胞侵袭。MDA-9/Syntenin可以作为一个关键的适配器来增强Slug介导的细胞侵袭(补充表1).
在肺腺癌患者中，需要核MDA-9/Syntenin的PDZ结构域来增强Slug调节的细胞侵袭，并且Slug/Syntenin的表达与低生存率有关答：。通过RT-PCR测定表达对照、Slug、Slug+WT、Slug/ΔPDZ1或Slug+ΔPDZ 2的HEK293细胞中E-cadherin mRNA的水平。B。用所示的MDA-9/Syntenin缺失突变体和对照载体或Slug感染HEK293细胞72小时。使用改良的Boyden腔侵袭试验测定这些细胞的侵袭能力。侵袭细胞表示为平均值±SD(n个= 3, *对< 0.05).C、。用MDA-9/Syntenin的Flag-WT、Flag-PDZs和Flag-PDZs-NLS瞬时转染HEK293/载体或HEK293/4lug细胞48小时。通过改良的Boyden腔侵袭试验对这些转染细胞的侵袭细胞进行评分。条形图显示侵袭细胞的平均数量±SD(n个= 3, *对< 0.05, **对< 0.001).D。119例肺腺癌手术患者原发肿瘤标本中Slug和MDA-9/Syntenin典型蛋白表达模式的免疫组织化学分析。比例尺，100μm。E.公司。119例鼻塞性非小细胞肺癌患者总生存率的Kaplan-Meier分析−Syntenin公司−，鼻塞+Syntenin公司−，鼻塞−辛替宁+、和Slug+Syntenin公司+. The对数值采用双侧对数秩检验。
MDA-9/Syntenin高表达和Slug高表达与肺腺癌患者生存率低相关
为了进一步验证MDA-9/Syntenin和Slug表达在肿瘤进展中的临床意义，采用免疫组织化学方法检测了119例肺腺癌患者肿瘤标本中MDA-9/Syncenin和Slug-蛋白的表达。表中提供了119名患者的特征用抗MDA-9/Syntenin和Slug抗体对每个样本的连续切片进行染色（图). MDA-9/Syntenin和Slug蛋白对患者预后的联合影响分析表明，MDA-9/Syntenin-Slug高表达患者的总体生存率低于低表达患者（图,对= 0.0098).
表1
MDA-9/Syntenin和Slug表达与临床参数和病理特征的关系1
| | | 鼻塞 | | Syntenin公司 | |
|---|
| 类别 | 子类别 | 编号 | 低（%） | 高（%） | 对 | 低（%） | 高（%） | 对 |
|---|
| 患者总数 | | 119 | 65(54.6) | 54(45.4) | | 62(52.1) | 57(47.9) | |
| 性别 | 女性 | 55 | 32(49.2) | 23(42.6) | 0.470 | 26(41.9) | 29(50.9) | 0.328 |
| 男性 | 64 | 33(50.8) | 31(57.4) | | 36(58.1) | 28(49.1) | |
| 肿瘤大小，cm | < 3 | 24 | 13(20.0) | 11(20.4) | 0.960 | 13(21.0) | 11(19.3) | 0.821 |
| ≥ 3 | 95 | 52(80.0) | 43(79.6) | | 49(79.0) | 46(80.7) | |
| 肿瘤分期 | 第一阶段 | 54 | 35(53.8) | 19(35.2) | 0.005 | 22(35.5) | 32(56.1) | 0.068 |
| 第二阶段 | 39 | 13(20.0) | 26(48.1) | | 23(37.1) | 16(28.1) | |
| 第三阶段 | 26 | 17(26.2) | 9(16.7) | | 17(27.4) | 9(15.8) | |
| Slug表达式（%） | 低 | 65 | - | - | | 31(50.0) | 34(59.6) | 0.291 |
| 高 | 54 | - | - | | 31(50.0) | 23(40.4) | |
| Syntenin表达（%） | 低 | 62 | 31(47.7) | 31(57.4) | 0.291 | - | - | |
| 高 | 57 | 34(52.3) | 23(42.6) | | - | - | |
采用逐步选择模型进行多变量Cox比例回归分析，以评估各种独立预后因素与患者生存率的相关性（表). MDA-9/Syntenin和Slug高表达的表型是一个独立的预测因子（危险比：2.348，95%CI:1.412-3.906；对=0.001）。这些结果表明，MDA-9/Syntenin高表达和Slug高表达的患者在肺腺癌中的临床结果较差。
表2
根据多变量Cox回归分析通过免疫组织化学染色确定肺腺癌患者死亡率的危险比1
| 变量 | 危害比（95%C.I.） | 对 |
|---|
| MDA-9/Syntenin+Slug | 2.348（1.412至3.906） | 0.0010 |
| 年龄 | 0.978（0.948至1.009） | 0.1557 |
| 性别 | 3.012（1.536至5.907） | 0.0013 |
| 肿瘤分期 | 1.431（0.656至3.124） | 0.3681 |
讨论
最近发现MDA-9/Syntenin在控制癌症侵袭和进展中发挥重要作用[19]. MDA-9/Syntenin的异常表达与胶质瘤、乳腺癌和葡萄膜黑色素瘤的不良临床预后相关[22,23,30]. MDA-9/Syntenin还参与外体的生物生成和肿瘤微环境的调节[18,33,34]这表明它可能是一个有希望的治疗靶点[35]. 我们的研究发现，核MDA-9/Syntenin可以在肺腺癌中Slug-介导的EMT中起到联合阻遏物的作用（图). MDA-9/Syntenin在有丝分裂原介导的信号激活过程中提升其核位置，并增强对Slug转录抑制复合体的协同阻遏物募集，从而调节Slug介导的癌症进展。
核MDA-9/Syntenin通过转录共阻遏物募集增强Slug介导的癌细胞侵袭的示意模型Slug的异常表达通过与MDA-9/Syntenin结合，然后招募共同阻遏物来抑制粘附分子，如E-cadherin，从而增强Slug介导的EMT/侵袭，从而促进癌转移，从而在细胞核中累积MDA-9/Syncenin。
MDA-9/Syntenin的核转位是发挥其增强Slug阻遏物功能的先决条件。先前的研究和我们的发现表明，EGF通过蛋白质稳定刺激Slug活性[11]，然后促进MDA-9/Syntenin在细胞核中的积累（图和). 增加的核MDA-9/Syntenin可以通过PDZ1相互作用域与Slug相互作用，并可以增强Slug转录活性。然而，Slug过表达通过未知机制在细胞核中保留MDA-9/Syntenin，就像其他MDA-9/Syntenin-结合转录因子一样[31].
此外，MDA-9/Syntenin通过与辅阻遏物HDAC1结合来增强Slug转录抑制活性。Syntenin-ΔPDZ2可能缺乏招募HDAC1的能力，因此无法增加细胞侵袭。综上所述，这些结果表明，这种调节依赖于MDA-9/Syntenin的核移位和联合阻遏物募集。
Pascale首次报道了核MDA-9/Syntenin分布等人。[29]. 其他研究指出，在高转移性细胞系和肿瘤标本中可以检测到核MDA-9/Syntenin[29,30,36]但核MDA-9/Syntenin如何参与肿瘤转移的详细机制尚不清楚。本研究证明了一种潜在的机制，通过这种机制，核MDA-9/Syntenin可以通过与转录抑制因子结合并募集更多的辅因子来增强其在细胞中的生物功能，从而在细胞核中积累。由于在MDA-9/Syntenin序列中没有典型的核定位信号，MDA-9/Synctenin是如何转位到细胞核中的有待进一步阐明。
虽然MDA-9/Syntenin的表达是普遍存在的，但与其他蛋白质的结合可能会影响MDA-9/Synctenin的分布[37]. MDA-9/Syntenin的两个PDZ结构域包含不同的肽结合特异性，C末端区域可能具有膜靶向调节能力[19,29,38]. MDA-9/Syntenin的N末端区域可以与Sox4或泛素结合，并促进MDA-9/Synctenin在细胞质或细胞核中的定位[31,36]. 这项研究表明，MDA-9/Syntenin的N末端区域的缺失减少了其细胞核的积累以及与Slug的蛋白质结合(补充图4a,3a年、和图)，并降低增强Slug介导的细胞入侵的能力。MDA-9/Syntenin非结构N末端区域的分子内相互作用影响配体与PDZ结构域的结合，并限制MDA-9/Syncenin的膜靶向能力。这些发现表明，MDA-9/Syntenin的N末端延伸可能在调节亚细胞靶向性方面具有更多功能。
Slug被报道为癌症进展的关键促进剂，然而，Slug介导的反式阻遏的调控机制尚不清楚。先前的研究表明HADC1是Slug介导的基因沉默所必需的[39]，我们的发现为Slug介导的EMT调控提供了新的见解，MDA-9/Syntenin在其中促进HDAC1的募集以增强Slug的抑制活性，从而导致细胞侵袭性和转移性增加体内此外，MDA-9/Syntenin和Slug的表达水平可以预测肺腺癌患者的临床结局。因此，MDA-9/Syntenin/Slug调节通路可能是肺腺癌的重要治疗靶点。
材料和方法
细胞培养
人类肺腺癌细胞系A549、H1299、胚胎肾细胞系HEK293和HEK293T细胞购自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯州ATCC）。人肺腺癌细胞系EKVX、H322M、H522、H226、H520、HOP62和H23，以及乳腺癌细胞系MCF-7、T47-D、MDA-MB-231和Hs578t购自美国国家癌症研究所发展治疗计划（NCI，马里兰州贝塞斯达）。
在研究实验室建立了人肺腺癌细胞系CL1-5和CL141，CL1-5由CL1-0细胞系衍生而来在体外如前所述的跨井选择[40]CL141来源于临床患者[41]. 细胞系H1299、A549、MCF-7、Hs578t、HEK293和HEK293T在37°C的含5%CO2的增湿培养箱中在补充有10%FBS的DMEM中培养。EKVX、H23、H322M、H522、H226、H520、HOP62、CL1-5、CL141、T47-D和MDA-MB-231在添加10%FBS的RPMI 1640培养基中培养。
质粒和抗体
通过RT-PCR从H1299中获得人MDA-9/Syntenin cDNA。将其全长或缺失结构亚克隆到pACT2、pcDNA3.1-HA、pCMV-tag2（Clontech，CA，USA）、pEGFP（Invitrogen）和pLKO.1-AS2-neo载体中，用于生产慢病毒或通过标准分子克隆程序进行细菌表达的pET28a载体。标记的Slug如前所述[10]. 将Slug的全长或缺失结构亚克隆到pAS2-1、pCI-neo、pcDNA3.1-HA、pDsRED和AS2-neo载体中。pcDNA3-HDAC1-Flag由Wen-Ming Yang博士（台湾台中国立中兴大学分子生物学研究所）提供。
用于免疫印迹分析的初级抗体是抗Syntenin（小鼠单克隆抗体，S-31或兔多克隆抗体，H-48，Santa Cruz Biotechnology，CA，USA和兔单克隆抗体，Abcam，MA，USA）、山羊抗Slug（Santa Cruz Biotechnology）、山羊抗HDAC1（Santa Cruz Biotechnology）和小鼠抗β-肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology），小鼠抗Flag（Sigma-Aldrich，MO，USA）、小鼠抗HA（Covance，Berkeley，California，USA，）、鼠抗E-cadherin（BD Biosciences，Inc.，CA，USA。
实验性转移体内
CL1-5/载体或CL1-5/Slug与MDA-9/Syntenin沉默表达细胞（1×10）的单细胞悬浮液6)将含有0.1 ml PBS的PBS注射到6周龄NOD SCID小鼠的侧尾静脉中（Bio Lasco，台湾有限公司，台湾台北）。35天后，处死四组肿瘤细胞注射小鼠，并检查其肺部是否有转移(n个=每组6人）。将肺部取出并固定在10%福尔马林中。使用解剖显微镜计数肺结节的数量。
染色质免疫沉淀（ChIP）
CL1-5、CL1-5/shCtl或CL1-5/sh同步蛋白-b（1×107)细胞由Magna ChIP™A/G（Millipore，Billerica，MA）根据制造商的说明进行分析。简单地说，细胞在含有1%甲醛的培养基中交联，并被0.125 M甘氨酸猝灭。用冷PBS洗涤后，刮除细胞，通过超声和离心提取可溶性染色质裂解物，然后与抗Slug（Santa Cruz）、抗HDAC1（Millipore）或抗Syntenin（Santa Cruz）抗体和蛋白A/G磁珠混合，在4°C下过夜。用指定的缓冲液对复合物进行造粒和清洗。
用含有蛋白酶K的洗脱缓冲液在65°C下洗脱DNA/蛋白质溶液2小时，以逆转甲醛交联。用指示引物（正向，5′-CGAACCCCAGTGAATCAGAA-′3和反向，5′-GCGGGGCTGGAGTCTGAACTG-3′）纯化DNA洗脱物并通过PCR扩增E-钙粘蛋白特异性。
患者和肿瘤标本
国立台湾大学医院（台湾台北台大）机构审查委员会批准了这项研究，所有参与者都提供了书面知情同意书。肺肿瘤组织标本取自患者(n个119例），1995年至2005年间在新南威尔士大学接受过完整手术切除的组织学证实的肺腺癌患者。所有标本均经福尔马林固定、切片、苏木精和伊红染色，并进行显微镜检查。根据国际肺癌分期系统，由一名病理学家进行病理分期。
免疫组织化学
如前所述，对腺癌患者的肿瘤组织样本进行免疫组织化学染色。简单地说，用于分析Slug或MDA-9/Syntenin蛋白表达的切片首先在121°C的Trilogy Solution（Cell Marque Corp）或Antigen Retrieval Citra Solution（Biogenex，San Ramon，CA）中高压灭菌10分钟。随后用3%的H处理样品2O（运行）2-甲醇，与DakoCytomation Dual Endogenic Enzyme Block（DakoCycomation）孵育10分钟，Ultra V Block（Lab Vision Corporation）孵养10分钟，与antibody-dilution缓冲液（Ventana Medical Systems，Inc.，Tucson，AZ）孵活10分钟，并与anti-Slug（1:75，ABGENT）孵熟室温下的抗体或抗MDA-9/Syntenin抗体（1:100，Santa Cruz Biotechnology）在4°C下过夜。
根据制造商的协议，使用超灵敏非生物素聚合物HRP检测系统（加州圣拉蒙市BioGenex）检测免疫染色。
统计分析
数据显示为平均值±SEM。统计分析由学生的t吨-测试或皮尔逊χ2测试（视情况而定）。使用Kaplan-Meier方法和双侧对数秩检验确定具有不同表达特征的患者组的总体生存率。超过10%的肿瘤标本的免疫反应性被定义为Slug和MDA-9/Syntenin的高表达。统计显著性设置为对< 0.05. 所有统计分析均使用SPSS软件进行（v10.0；SPSS公司，伊利诺伊州芝加哥）。
鸣谢
作者感谢中国科学院统计科学研究所（Ker-Chau Li）提供EKVX、H23、H322M、H522、H520、HOP62和H226细胞，并感谢王树平提供技术援助。shRNA构建物来自台湾台北中科院分子生物学研究所/基因组研究中心的国家RNAi核心设施。
脚注
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
给予支持
这项工作得到了台湾科技部的资助（MOST102-321-B-002-053；MOST102-325-B--006-016-；MOST102-314-B--006-024-MY3；MOST102-321-B--002-022；MOST104-314-B--006-075-MY3；MOST104-314-B-002-28-MY3）；和台湾国立大学（NTU103R7601-2；NTU104R7601-2）以及台湾中国医科大学（CMU103-RAP-02）。
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