MicroRNA-17-5p激活的Wnt/β-catenin通路参与肝纤维化的进展

Sal B诱导Wnt/β-catenin通路失活和WIF1表达上调

Wnt/β-catenin通路异常参与器官纤维化的发展[22,23]. 为了探讨Wnt/β-catenin通路是否参与Sal B对肝纤维化的影响，检测了P-β-catentin的蛋白水平体内和在体外Sal B治疗后。结果表明，Sal B使CCl中β-catenin的磷酸化显著增加₄-治疗组大鼠、HSC-T6细胞和原代HSC（图​（图1D一维和图​图2E）。第二版). Sal B治疗还导致HSC-T6和原发性HSC的TCF活性降低（图​（图2C）。2摄氏度). 为了进一步研究Sal B对Wnt信号的抑制是否与Wnt信号抑制剂的表达增加有关，在CCl中检测了Wnt信号抑制因子包括WIF1、sFRP1、sFRP2和DKK1-4的mRNA表达₄-Sal B治疗后的大鼠、HSC-T6细胞和原代HSC。研究发现，Sal B增加了WIF1的mRNA水平，而其他药物则没有增加（图​（图1C，1摄氏度，图​图2A2安培和支持信息图S1). 免疫印迹分析进一步证实Sal B导致WIF1蛋白增加体内和在体外（图​（图1D一维和图​图2B）。2B型). 因此，选择WIF1进行下一个实验。这些结果表明，Sal B通过增加P-β-catenin和WIF1的水平，抑制Wnt/β-catening通路。

Sal B抑制HSC激活引起的WIF1上调

先前的研究报道WIF1是一种有效的Wnt途径拮抗剂[9]. 为了探讨WIF1是否参与Sal B诱导的抗纤维化作用，将WIF1 siRNA转染HSC-T6细胞和原代HSC，使WIF1沉默。用WIF1 siRNA阻断WIF1成功抑制了HSC-T6细胞和原代HSC中WIF1的mRNA和蛋白水平（图​（图2A2安培和图​图2B）。2B型). 接下来，用WIF1 siRNA检测Sal B处理细胞的TCF活性和P-β-catenin水平。TCF报告活性测定表明，Sal B降低的TCF活性被HSC-T6细胞和原代HSC中的WIF1 siRNA逆转（图​（图2C）。2摄氏度). 此外，由Sal B引起的增强的P-β-catenin水平被WIF1 siRNA逆转（图​（图2E）。第二版). 值得注意的是，Sal B对HSC中α-SMA和I型胶原mRNA和蛋白水平的影响被WIF1 siRNA阻断（图​（图2D二维和图​图2E）。第二版). Sal B治疗引起的细胞增殖减少也被WIF1表达的沉默所阻断（图​（图2F）。2楼). 这些结果表明WIF1参与了Sal B诱导的抗纤维化作用。

MiR-17-5p参与Sal B效应并促进HSC活化

为了确定WIF1的表达是否受到miRNA的抑制，我们使用microRNA.org网站(http://www.microrna.org/microrna/home.do). 因此，提取miR-16、miR-17-5p、miR-20a、miR-2b-5p、miR-21和miR-199-5p作为候选。结果显示，只有miR-17-5p被降低体内和在体外Sal B治疗后（图​（图3A3A级和支持信息图S1). 因此，选择miR-17-5p进行进一步实验。为了研究miR-17-5p过度表达对HSC活化的影响，对原发性HSC中的α-SMA和HSC标志物结蛋白进行了免疫荧光染色。我们发现，miR-17-5p过度表达增加了结蛋白（绿色）和α-SMA（红色）的水平（图​（图3B）。3B公司). 这些数据表明miR-17-5p促进HSC的激活。假设WIF1被预测为miR-17-5p的假定靶点（图​（图5A5A级和图​图5B），第5页)，我们假设miR-17-5p可能促进肝纤维化通过抑制WIF1表达。接下来，在用miR-17-5p模拟物转染的细胞中检测WIF1的mRNA和蛋白质水平。结果表明，miR-17-5p模拟物降低了WIF1的mRNA和蛋白质水平（图​（图3C3C公司和图​图3D）。三维). 我们还研究了miR-17-5p抑制剂和WIF1沉默对细胞周期的影响。细胞周期分析表明，与对照组相比，miR-17-5p抑制剂抑制了S期细胞的比例，增加了G0/G1期细胞的数量，表明miR-17-5抑制剂有助于HSC的失活（图​（图3E）。第3页). 然而，miR-17-5p抑制剂对细胞周期的影响被WIF1 siRNA阻断（图​（图3E）。第三方). 值得注意的是，如H&E和Masson染色所示，miR-17-5p抑制剂治疗显著抑制CCl引起的肝纤维化₄（图​（图4A）。4A级). 免疫组织化学结果进一步证实，CCl中α-SMA水平升高₄-经miR-17-5p抑制剂治疗的大鼠被减弱(P（P）<0.05，图​图4B）。4B类). 所有这些结果表明miR-17-5p可以促进HSC的活化通过WIF1的下调。

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图3

miR-17-5p过度表达促进HSC的激活，并有助于WIF1水平的降低

用miR-17-5p模拟物或miR-NC转染HSC-T6细胞和原代HSC 48小时。答：。在CCl中发现miR-17-5p表达下调₄-Sal B治疗后的大鼠、HSC-T6细胞和原代HSC。B。通过共聚焦激光显微镜评估α-SMA（红色）和结蛋白（绿色）的免疫荧光染色。DAPI染色细胞核呈蓝色。比例尺，50μm。C、。通过实时PCR分析经miR-17-5p模拟物处理的HSC中WIF1的mRNA表达。D。通过western blotting分析经miR-17-5p模拟物处理的HSC中WIF1的蛋白表达。GAPDH被用作内部控制。E.公司。WIF1 siRNA对转染miR-17-5p抑制剂的HSC细胞周期的影响。将miR-17-5p抑制剂转染原代HSC 48 h，然后再转染WIF1 siRNA 48 h。每个值为三个实验的平均值±SD*P（P）与对照组或miR-NC相比，<0.05。^#P（P）与miR-17-5p抑制剂组相比，<0.05。

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图4

MiR-17-5p抑制剂治疗显著抑制CCl引起的大鼠肝纤维化₄

答：。H&E染色（×100）和Masson染色（×10 0）评估肝纤维化。B。应用免疫组织化学方法分析CCl中α-SMA的水平₄-miR-17-5p抑制剂治疗后的大鼠。展示了每组的代表性视图（原始放大倍数×10）。每个值是三个实验的平均值±SD*P（P）与对照组和^#P（P）与CCl相比<0.05₄组。

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图5

miR-17-5p与WIF1的3′UTR的相互作用

答：。WIF1 mRNA 3′UTR中miRNA结合位点的示意图microRNA.org网站黑框表示miR-17-5p，测试序列表示插入荧光素酶报告载体的区域。B。预测靶区和miR-17-5p的相应配对。根据配对位点，相应的荧光素酶报告载体命名为pMIR-17-5p和pMIR-17%-5p-Mut。C、。用pMIR（空载体）、含有miR-17-5p靶序列的pMIR和带有miR-17-5 p突变靶序列的p miR转染HSC。该图显示了转染pMIR-17-5p或pMIR-17.5p-Mut的细胞中的荧光素酶活性。它还显示miR-17-5p前体或miR-NC的共转染*P（P）< 0.05.

WIF1是miR-17-5p的靶点

为了进一步研究WIF1是否是miR-17-5p的直接下游靶点，将WIF1 mRNA靶区的3′UTR序列克隆到pMIR-REPORT中^TM（TM）荧光素酶质粒（图​（图5A5A级和图​图5B）。第5页). 该构建物与miR-17-5p前体或miRNA阴性对照（miR-NC）共同转染HSC。共转染β-gal报告基因对照质粒以监测转染效率。我们的结果表明，与HSC中的miR-NC相比，WIF1野生型3′UTR驱动的miR-17-5p前体显著降低荧光素酶活性。同时，miR-17-5p前体不抑制突变型WIF1 3′UTR和空载体的荧光素酶活性（图​（图5C）。5摄氏度). 这些结果证实WIF1是miR-17-5p的直接靶点。

细胞培养

大鼠HSC-T6细胞系获得于中国医学科学院研究所（中国北京）。细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM中生长（Gibco，Carlsbad，CA），并在含有5%CO的37°C培养箱中保持₂用10μmol/L Sal B处理HSC-T6细胞和原代大鼠HSC 48 h，这是一个安全剂量[27].

大鼠HSC的分离培养

如前所述，使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（体重400-500 g）分离HSC[32]. 在所有研究中，在隔离后第3天对主要HSC进行研究。α-SMA免疫细胞化学染色证实了培养物的纯度，纯度达到98%以上。

CCl公司₄肝损伤模型

成年雄性Sprague-Dawley大鼠（180-220 g）由温州医科大学实验动物中心提供。服用2ml CCl可诱导肝纤维化₄/橄榄油（1:1，v/v）/kg体重，每周腹腔注射两次，最多持续6周[33]. 30只大鼠随机分为三组，包括橄榄油、CCl₄加上口服磷酸盐缓冲液（PBS）和CCl₄分别加口服Sal B（10 mg/kg）。实验方案经温州医学院动物学会批准。所有动物均按照《实验动物护理和使用指南》接受护理。六周后，在麻醉下处死大鼠，取下肝脏进行进一步分析。肝组织经10%福尔马林固定后进行H&E染色和Masson染色。

慢病毒的产生和转染

慢病毒载体包含阴性对照（Lenti-NC）和慢病毒miR-17-5p抑制剂（Lenti-miR-17-5p-抑制剂），从上海基因化学公司获得。用橄榄油治疗大鼠(n个=6），CCl₄(n个=6），CCl₄加上Lenti-NC(n个=6）和CCl₄加Lenti-miR-17-5p抑制剂(n个= 6). 注射Lenti-miR-17-5p抑制剂或Lenti-NC通过CCl后三周仅出现一次尾静脉₄注入（1×10⁹转换装置/大鼠）。在接下来的3周CCl后₄治疗后，处死大鼠。

RNA干扰分析

按照制造商的说明，在使用Lipofectamine 2000（Invitrogen Carlsbad，CA，USA）治疗Sal B之前进行RNA干扰实验。抗WIF1或干扰序列的siRNA寡核苷酸(表。S1（第一阶段）)由Gene Pharma（中国上海）合成，转染HSC-T6细胞和原代HSC 48小时。

miRNA转染

细胞以1×10的密度接种在6孔板中⁶每个孔的细胞数。然后，用Opti-MEM（Invitrogen，美国）替换培养基，并用脂质体2000将miR-17-5p模拟物（60 nM）和miR-NC（60 nM）（GenePharma，中国）转染细胞48小时。转染6小时后，用含有10%FBS的DMEM替换培养基。

免疫荧光显微镜

将细胞接种在18-mm盖玻片上，并在−20°C的乙酸：乙醇（1:3）溶液中固定5分钟。用5%山羊和马血清/PBS在室温下阻断非特异性结合1h。然后，用抗α-SMA或结蛋白（Abcam）的一级抗体培养细胞，然后用荧光标记的二级抗体（1:50稀释；Dianova）培养细胞[34]. 细胞核用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。用PBS清洗载玻片两次，覆盖DABCO（Sigma-Aldrich），并在488和568 nm处用共焦激光扫描显微镜（日本东京奥林巴斯）进行检查。

免疫组织化学

如前所述，对肝组织切片（3μm厚）进行免疫组织化学染色[35,36]. 简言之，在脱蜡、水合和抗原回收后，样品在4°C下与α-SMA一级抗体（1:100）孵育过夜，然后与生物素化二级抗体孵育。用3,3′-二氨基联苯胺四氯化氢（DAB）染色观察α-SMA的表达。脱水前用苏木精对载玻片进行复染，然后观察纤维化区域内的α-SMA阳性区域。从每个肝脏切片的五个字段计算定量分析。

定量实时PCR

根据制造商的说明，使用miRNeasy Mini试剂盒（美国加利福尼亚州巴伦西亚市齐根）从组织和细胞中提取总RNA。基因表达(表。S1（第一阶段）)使用SYBR Green实时PCR Master Mix（日本大阪东洋）通过实时PCR进行测量。此外，如前所述设计了α-1（I）胶原（Col1A1）、α-SMA、GAPDH和U6的引物[37]. 使用TaqMan MicroRNA Assay（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）检测成熟miRNA的表达。GAPDH和U6 snRNA水平用于标准化mRNA和miRNA的相对丰度[38]分别是。

蛋白质印迹分析

用冰镇裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mM 2-巯基乙醇，2%w/v SDS，10%甘油）对组织和细胞进行裂解。总蛋白通过SDS-PAGE进行定量和分离。然后按照前面所述进行western blot分析[39]. 蛋白质水平归一化为总GAPDH。

细胞增殖试验

将细胞以1×10的密度接种在96孔板中^三细胞每孔，然后用上述miR-17-5p模拟物和miR-NC转染细胞。根据MTT细胞增殖检测试剂盒（Beyotime Biotechnology，中国江苏）的说明，采用MTT检测法测定细胞增殖。在570 nm处用微孔板阅读器（美国Bio-Rad 550）测量光密度。

TCF报告活性测定

使用Lipofectamine 2000将TOPFLASH和FOPFLASH-（Upstate Biotechnology Inc.，Lake Placid，NY，USA）瞬时转染细胞。转染后24小时，收集细胞，并使用双荧光素酶报告分析系统（美国威斯康星州普罗米加）在光度计（美国弗吉尼亚州威努斯基市BioTek Instruments）上测量荧光素酶和肾素的发光。TCF报告活性表示为萤火虫荧光素酶活性与Renilla荧光素酶活性的比值。

细胞周期分析

对于细胞周期分析，我们使用了细胞周期分析试剂盒（Beyotime，中国）。细胞在−20°C的PBS中70%乙醇中固定24小时，然后在37°C的黑暗中用含有200 mg/ml RNase A和50μg/ml PI的0.5 ml碘化丙啶（PI）染色缓冲液标记40分钟。在BD-LSR流式细胞仪（BD Biosciences）上进行分析，并至少重复三次实验。

荧光素酶活性测定

将WIF1基因的3′UTR区域克隆到pMIR-REPORT™荧光素酶质粒（Applied Biosystems）中，以生成pMIR-17-5p和pMIR-17%-5p-Mut载体。WIF1 3′UTR用于miR-17-5p正向、5′-TCGGAGTTACGCGTTCAC-3′和反向、5′-GTTCGCCTCTAGGGCTC-3′。根据制造商的建议，使用Lipofectamine 2000进行转染[40]. pMIR-REPORTβ-gal对照质粒用于转染规范化。使用双光系统（应用生物系统）测量荧光素酶值。

该项目得到了国家自然科学基金（No.81000176/H0317、81100292/H0317和81500458/H0317）、浙江省自然科学基金会（No.Y2090326、Y2110634和LY16H030012）、温州市科学技术局（No.Y20110033和Y20120127）、，王宝恩肝纤维化基金（No.20100002和20120127）、温州医科大学第一附属医院孵化器项目（HFY2014045）和浙江省高校重点学科。