由ptf1a型斑马鱼肠道神经系统发育中的：GFP

摘要

引言

肠神经系统（ENS）由沿肠壁分布的肌间神经丛和粘膜下神经丛内相互连接的神经节组成(Bornstein等人，1984年). ENS调节胃肠运动，作为外周神经系统的最大部分，常被称为“第二大脑”(Furness，2006年). ENS主要来源于“迷走神经”嵴，该嵴起源于耳后区的背神经管(LeDouarin和Teillet，1973年;Anderson等人，2006年). 迷走神经嵴细胞离开神经管，向腹侧前肠移动。进入前肠后，它们改变方向，开始向尾部迁移，最终填充整个肠道，这一迁移过程耗时数天，是所有胚胎细胞迁移中最长的。一旦到达最终目的地，肠神经嵴（ENC）就会沿肠道全长分化为各种各样的肠神经元和神经胶质细胞(Furness，2006年;Sasselli等人，2012年). 由于神经嵴发育不当会导致先天性巨结肠症（结肠无神经节细胞增生症）等发育缺陷（Bergeron等人，2012），因此人们对了解肠神经嵴的迁移、规范和分化非常感兴趣。

尽管最近的研究已经确定了ENS内终末分化肠神经元亚型的各种神经递质标记物(Uyttebroek等人，2010年; rev.英寸Sasselli等人，2012年)然而，对于介导向特定神经元谱系的终末分化的转录因子知之甚少。尽管如此，一些实验已经阐明了这个问题。例如Ascl1公司是一种基本的helix-loop-helix（bHLH）转录因子，导致ENS中所有5-羟色胺能神经元的完全丢失，表明其在肠神经元亚型分化中的需要(Blaugrund等人，1996年). 类似地，bHLH转录因子失活手牌2在神经嵴细胞中导致神经节模式的破坏和VIP的选择性丢失⁺神经元，表明其在小鼠肠道肽能肠神经元分化中的重要性(Hendershot等人，2007年). 然而，对负责肠神经元亚型鉴定和末端分化的转录因子编码的理解仍然有限。因此，鉴定发育中ENS中表达的新因子将突出可能参与这些过程的候选基因。

胰腺特异性转录因子1a，ptf1a型在发育中的斑马鱼胰腺中表达(Lin等人，2004年;Zecchin等人，2004年)，视网膜(Jusuf和Harris，2009年)和小脑(Kani等人，2010年)在胚胎发育期间。Ptf1a在斑马鱼腹侧胰腺规格和外分泌胰腺发育中起着关键作用(Lin等人，2004年;Zecchin等人，2004年;Dong等人，2008年)以及在视网膜抑制性神经元亚型分化过程中的功能(Dullin等人，2007年;Fujitani等人，2006年)，小脑(Hoshino等人，2005年). 鉴于Ptf1a在神经系统内各种神经元类型的亚型规范中的重要作用，我们试图检测它是否也存在于发育中的ENS中(ptf1a型：GFP）表明ptf1a型在斑马鱼幼虫发育中的ENS中的神经元亚群中表达。因此，这些数据将Ptf1a确定为发育中ENS的新神经元标记物。

结果

转基因品系Tg（ptf1a:GFP）在斑马鱼幼体发育阶段标记了ENS神经元的一个子集

转基因品系Tg(ptf1a型：GFP）之前已经证明可以标记表达体内ptf1a(Godinho等人，2007年;Jusuf和Harris，2009年;Kani等人，2010年). 检查表达ptf1a型存在于发展中的ENS中，ptf1a型：GFP⁺对受精后3至6天（即发育中的斑马鱼ENS的末端分化开始的时间）的幼虫进行了检测。整体共聚焦显微镜显示ptf1a型：GFP⁺细胞最初出现在中肠的4dpf处(图1A)，并保持为5 dpf和6 dpf(图1B、C)，有一些ptf1a型：GFP⁺6 dpf时在肠球（前肠）中也可见细胞(图1F). 平均13分ptf1a型：GFP⁺4dpf中肠细胞，4dpf 19细胞，6dpf 21细胞(图1D). GFP公司⁺胚胎的其他区域也有细胞，如胰腺(图1F). 为了检测内源性ptf1a型在发展中的ENS中，我们完成了全部就地杂交。与转基因系中观察到的细胞分布一致，该分析揭示了ptf1a型发育中的大脑、胰腺和中肠中的转录物，而不是后肠中的，6 dpf(图1G、H).

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图1

转基因品系Tg(ptf1a型：GFP）标记幼体ENS内的神经元子集

（A–A〃）4 dpf、（B–B〃）5 dpf和（C–C〃）6 dpf条件下的最大投影共焦叠加描绘ptf1a型：GFP⁺和胡⁺中肠内的细胞（虚线），比例尺：70微米，用于A–C。（D） 显示总数量的条形图ptf1a型：GFP⁺肠道中的细胞从4dpf到6dpf，误差条代表s.e.m.，n=6。（E） 沿z轴的最大强度共焦投影显示ptf1a型：GFP⁺/胡⁺细胞以6 dpf（比例尺：100微米）的同心模式沿肠管共同定位。（F） 6 dpf的侧视图ptf1a型：GFP⁺幼鱼。（G，H）整体安装后的腹侧视图就地杂交ptf1a型揭示了这一点ptf1a型定位于6只dpf幼虫的大脑、胰腺和中肠。（一） 显示胡总百分比的条形图⁺神经元ptf1a型：GFP⁺在中肠中，5dpf和6dpf的误差条代表s.e.m.，n=6。内球-肠球。

评估ptf1a型：GFP⁺肠道中观察到的细胞是神经元，我们对GFP和泛神经标记物Hu或乙酰化微管蛋白进行了双重全量免疫化学。在4dpf时，共聚焦图像显示ptf1a型：GFP⁺与Hu共同定位的细胞(图1A′，A〃)或乙酰化微管蛋白，如静态共焦图像和3D渲染电影中所示(图2A′，A〃;支持信息电影1). 然而，在5和6 dpf时，大多数ptf1a型：GFP⁺与Hu共同定位的细胞(图1B′，B〃-C′，C〃;辅助信息电影2)和乙酰化微管蛋白(图2B′，B〃-C′，C〃)揭示了他们的神经元身份。在6 dpf时，沿z轴的共焦叠加投影分析表明ptf1a型：GFP⁺细胞沿肠管外层呈同心模式分布，与Hu共同定位(图1E). 这些数据表明ptf1a型：绿色荧光粉⁺细胞在4dpf时最终分化为神经元之前存在于肠道内，在5dpf和6dpf时，其在分化神经元中的表达保持不变。在5 dpf时，量化显示平均28%的Hu⁺神经元ptf1a型：GFP⁺在中肠，而在6 dpf时，36%是ptf1a型：GFP⁺(图1I)，证明了这一点ptf1a型并非在所有肠神经元中表达，而是在神经元的子集中表达。

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图2

ptf1a型：GFP⁺细胞与神经元标志物乙酰化微管蛋白共同定位于肠道

（A–A〃）4 dpf、（B–B〃）5 dpf和（C–C〃）6 dpf条件下的最大投影共焦叠加描绘ptf1a型：GFP⁺和乙酰化微管蛋白⁺中肠内的细胞（虚线），比例尺：70微米。

以前的研究表明，大约30%的中肠神经元含有5dpf的神经递质5-羟色胺（5HT）(Uyttebroek等人，2010年). 为了确定ptf1a型：GFP⁺中肠神经元也为5HT⁺，我们对ptf1a型：具有抗GFP和5HT抗体的GFP幼虫。在5 dpf时，平均97%ptf1a型：GFP⁺细胞为5HT⁺(图3A-A〃)，表明ptf1a型：GFP⁺神经元群主要是幼虫中肠内的5-羟色胺能神经元。

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图3

ptf1a型：GFP细胞主要是来源于神经嵴的5-羟色胺能肠神经元

中肠最大投影共焦叠加（A–A〃）表明ptf1a型：GFP⁺细胞和神经递质5HT在6dpf时共存。（B–B〃）活的三重转基因仔鱼图像，ptf1a型：GFP-4725sox10:Cre；elf1a型：loxp-GFP-loxp-dsRedpA，显示ptf1a型：GFP⁺细胞来源于神经嵴。比例尺：70微米。

讨论

在这项研究中，我们报告了一种新的ptf1a型：GFP⁺位于斑马鱼幼虫发育中的ENS中肠内的神经元，其中大多数具有5-羟色胺能。这是第一份描述ptf1a型在任何生物体中的ENS表达。此行可以用作体内分化和终末分化神经元的标志物，从而成为ENS发育研究的有用工具。

在斑马鱼ENS分化过程中，肠道祖细胞沿着肠道管向尾部迁移，在肠道间质内，以3 dpf的速度完全填充肠道。随后，这些肠道前体细胞进行广泛增殖，以便在成年斑马鱼肠道内以适当的比例和精确的位置生成数千个肠道神经元(Uyttebroek等人，2010年). 我们没有发现ptf1a型：GFP⁺4dpf之前的细胞表明，它在最初的神经嵴侵入肠道后被激活，提示在肠神经母细胞增殖和/或终末分化过程中可能稍后发挥作用。为了支持这个想法，我们发现ptf1a型：GFP⁺肠道中的细胞与神经元标记物Hu和乙酰化微管蛋白共定位，以及与神经递质5-羟色胺（5HT）共定位。斑马鱼ENS发育过程中，5 dpf时，5-羟色胺能神经元约占幼虫肠道总神经元的25-30%(Uyttebroek等人，2010年). 在成年鱼中，这些比例在近端肠道和中肠中保持不变，而在后肠中，这一比例急剧下降到总神经元的约10%(Uyttebroek等人，2010年). 有趣的是，在发育中的非洲爪蟾视网膜中，Ptf1a调节内核层神经元亚型的平衡，特别是控制视网膜发生过程中产生的GABA能中间神经元的数量(Dullin等人，2007年). 异位表达ptf1a型足以增加5HT的数量⁺神经元，而Ptf1a的缺失减少了5HT的数量⁺视网膜内的神经元(Dullin等人，2007年)这表明Ptf1a在血清素能神经元亚型的分配或分化中具有重要作用。结合这些先前的研究，我们发现ptf1a型：GFP⁺/5HT（高温）⁺肠道中的细胞表明，Ptf1a可能发挥类似的作用。未来的研究旨在进一步研究Ptf1a在肠道神经元亚型发育中的作用，以及其在ENS中的功能调节，这将为外周神经系统中神经发生的机制提供新的见解。

材料和方法

补充材料

致谢

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