J Am心脏协会。2016年2月；5（2）：e002757。
小鼠颈动脉渐进性狭窄与人类低灌注血管性痴呆密切相关
、医学博士、博士，1,2 ，博士，三 ，博士，三 ，医学博士，4 ，博士，4 、医学博士、博士，4 、医学博士、博士，1 ，博士，FRCP，5 ，博士，博士生，三和医学博士、博士、FACP
1,4 Yorito Hattori公司
1日本国立大脑和心血管中心中风和脑血管疾病科
2日本佐余市南美京都医院国立医院组织神经内科
Jun‐ichiro Enmi先生
三日本国立大脑和心血管中心放射研究科
井口聪（Satoshi Iguchi）
三日本国立大脑和心血管中心放射研究科
Satoshi Saito先生
4日本国立大脑和心血管中心再生医学部
Masahiro Tsuji先生
4日本国立大脑和心血管中心再生医学部
川崎长冢
1日本国立大脑和心血管中心中风和脑血管疾病科
拉杰什·N·卡拉里亚
5纽卡斯尔大学神经科学研究所，英国纽卡斯尔老龄与活力校园
岩原雅芳
1日本国立大脑和心血管中心中风和脑血管疾病科
4日本国立大脑和心血管中心再生医学部
1日本国立大脑和心血管中心中风和脑血管疾病科
2日本佐余市南美京都医院国立医院组织神经内科
三日本国立大脑和心血管中心放射研究科
4日本国立大脑和心血管中心再生医学部
5纽卡斯尔大学神经科学研究所，英国纽卡斯尔老龄与活力校园
通讯作者。 *通信地址：Masafumi Ihara，医学博士、博士，FACP，国家大脑和心血管中心中风和脑血管疾病部；5‐7‐1 Fujishiro‐dai，佐田，大阪565‐8565，日本。电子邮件：pj.og.cvcn@arahi公司 2015年10月20日收到；2016年1月13日接受。
版权©2016作者。Wiley Blackwell代表美国心脏协会出版。 这是一篇根据创意共享署名——非商业许可证，允许在任何媒体上使用、分发和复制原始作品，前提是原始作品被正确引用，且未用于商业目的。 - 补充资料
视频S1。泪囊缩窄器（AC）的外科植入。通过颈部中线切口，露出左侧颈总动脉（CCA），并将其从鞘层（包括左侧迷走神经）中分离出来。CCA周围放置4‐0丝线。该缝合线轻轻地将动脉提起，将AC手术植入CCA，然后移除缝合线。
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摘要
背景
现有的血管认知障碍（VCI）啮齿动物模型显示脑血流（CBF）发生突变，不能可靠地复制VCI的临床发病机制。因此，我们旨在建立一种VCI小鼠模型，在该模型中，CBF在手术干预后逐渐降低，随后出现进行性运动和认知障碍。
方法和结果
成年C57BL/6J雄性小鼠通过使用内径为0.75 mm的杏仁状血管收缩器进行渐进性颈总动脉狭窄（GCAS）手术。GCAS后28天内，杏仁体收缩肌逐渐收缩后，颈总动脉逐渐狭窄，随后79.3%的区域狭窄是由于平滑肌细胞增殖和内膜巨噬细胞浸润所致。28天生存率为91%。动脉自旋标记显示，28天内，皮质和皮质下CBF（与术前值的比值）分别逐渐持续下降至54.6%和51.5%。然而，磁共振血管造影显示软脑膜动脉侧支血流信号增加。第32天，在白质中发现星形胶质细胞和小胶质细胞的稀少和增殖，以及少突胶质细胞的损失。只有25%的GCAS小鼠观察到海马神经元丢失，这与Morris水迷宫测试中没有异常一致。旋转试验显示运动障碍，Y迷宫试验显示工作记忆缺陷。
结论
GCAS模型成功地在28天内逐渐持续降低CBF，复制与脑灌注不足相关的关键组织学、放射学和行为特征，导致VCI。
关键词：杏仁体收缩肌、颈动脉狭窄、小鼠、皮层下缺血性血管性痴呆、血管认知障碍
主题类别：认知障碍、脑血管疾病/中风、人类疾病动物模型、动脉粥样硬化、狭窄
介绍
尽管发展了多种治疗和预防药物，动脉粥样硬化疾病仍然是世界范围内死亡率和发病率的主要原因。1在中风领域，世界范围内颈动脉狭窄/闭塞的发病率增加是由于久坐生活方式导致代谢紊乱增加，加上摄入过多热量，从而增加了脑梗死和血管认知障碍（VCI）的易感性。2VCI至少占痴呆症所有病因的20%，其发病率仅次于阿尔茨海默病（AD）。然而，伴随AD病理的VCI也已成为与年龄相关的认知障碍的增加原因。三脑灌注不足也被认为会加速AD的病理。4因此，血管因素影响痴呆（包括AD）的机制值得进一步研究。VCI是一种异质性疾病，但大约一半的VCI病例具有缺血性白质（WM）改变及相关运动和认知功能障碍的特征。颈动脉疾病或心力衰竭导致的慢性脑灌注不足可导致WM改变，5这两种情况都会导致脑血管舒缩反应性的丧失，导致血脑屏障的破坏和胶质细胞的激活。6
为了模拟这种病理状态，通过操纵小鼠或沙土鼠的双侧颈总动脉（CCA）狭窄、小鼠单侧CCA闭塞和大鼠双侧CCA闭塞等颈动脉建立了各种啮齿动物慢性脑灌注不足模型。7小鼠双侧CCA狭窄（BCAS）模型是最有希望的慢性脑灌注不足模型。8BCAS模型显示了人类低灌注VCI的特征，如WM稀疏、胶质增生和工作记忆损伤。然而，该模型有一个固有的局限性，即脑血流量（CBF）在BCAS手术后立即急剧下降，然后在1个月后逐渐恢复，因此无法可靠复制VCI中明显的“慢性”脑灌注不足。9,10因此，前一急性期对神经病理学和行为后果的影响是一个持续关注的问题。我们试图建立一种新的小鼠模型，消除急性期的CBF，在急性期CBF逐渐降低到慢性期的水平，方法是使用一种称为杏仁体收缩器（AC）的装置，可以预见，该装置可以实现CCA的逐渐缩小。希望这种模型的开发将有助于测试人类低灌注VCI的新疗法。
方法
动物
使用10至12周龄的雄性C57BL/6J小鼠（体重24-29克；日本SLC），并可随意获得食物和水。所有程序均按照国家大脑和心血管中心伦理委员会的动物实验指南进行。所有手术均在麻醉下进行，并尽一切努力将痛苦降至最低。在生存研究中，我们将垂死状态作为人道的终点。“濒死状态”被定义为一种不可避免地导致死亡的不可逆转的状态。垂死的迹象包括（1）对手动刺激缺乏反应，（2）静止，和/或（3）无法进食或饮水。在这种情况下，用二氧化碳窒息对动物实施安乐死。
研究设计
根据手术程序，C57BL/6J雄性小鼠被分为3组：（1）渐进性CCA狭窄（GCAS）手术，在双侧CCA上放置AC（内径0.75 mm；Tokyo Instruments）（n=22）（图A） ，（2）BCAS手术9（n=7；仅测量皮层表面CBF）和（3）假手术（n=10）。在GCAS或BCAS治疗前和治疗后1、3、7、14和28天，使用激光散斑流量计（LSF）（Omegazone；Omegawave）和动脉自旋标记（ASL）（7‐T，BioSpec 70/30 USR；Bruker BioSpin）在GCAS治疗前、治疗后14和28天后，测量CBF的时间变化。在GCAS治疗前、治疗后14天和28天进行脑磁共振成像（MRI）（BioSpec 70/30 USR）。在GCAS或假手术后32天进行组织学评估。在GCAS或假手术后14天和28天进行Rotarod、wire hang和Y‐maze测试，在GCAS和假手术后28到32天进行Morris水迷宫测试。
Ameriod缢管(交流s） 诱导双侧颈总动脉内膜增厚和管腔狭窄(CCA公司s） ●●●●。A、 显示手术植入自动控制关于双边CCA公司s.B，代表性图像自动控制s显示中心孔（管腔）逐渐变窄。下图显示了内径的时间变化交流s（n=2）。C、 术前（左）和术后（右）横切面的代表性图像CCA公司苏木精-伊红染色。D、 术前（左）和术后（右）横切面的代表性图像CCA公司染有松紧带的范·吉森(执行副总裁)、Masson三色(机器翻译)，α-平滑肌肌动蛋白（α‐座椅模块组件)和电离钙结合适配器分子1（Iba1）染色。逐渐的CCA公司狭窄(全球通用会计准则)尽管术前内膜增厚，但术后32天手术仍导致内膜增厚CCA公司s很瘦。箭头表示内部弹性层，箭头表示外部弹性层。比例尺指示50μm（C）和20μm（D）。E、 显示内膜厚度的直方图CCA公司s之前和之后全球通用会计准则（n=3）*P（P）<0.01.
缩窄器
杏仁体缩颈器（AC）由一个钛外壳组成，外壳围绕着一个内部有内腔的吸湿酪蛋白材料。酪蛋白成分逐渐吸收水分，从而膨胀，导致其所包裹的动脉管腔可预测的变窄。内径和外径分别为0.75 mm和3.25 mm，长度为1.28 mm。
AC的外科植入
用1.5%异氟醚麻醉小鼠。两个CCA都暴露在外，并通过颈部中线切口从鞘中脱离。在每个CCA周围放置一条4‐0丝线，缝合线轻轻提起CCA，并将AC手术植入双侧CCA（图A和视频S1）。直肠温度保持在36.5°C至37.5°C之间。
BCAS手术
用1.5%异氟醚麻醉小鼠。在颈部中线切口后，两个CCA均暴露并脱离鞘层。使用4‐0丝线轻轻提起CCA，并将内径为0.18 mm的微线圈（Sawane Spring）手术植入双侧CCA，以诱导约50%的动脉狭窄。直肠温度保持在36.5°C至37.5°C之间。
CBF LSF测量
相对CBF由LSF确定，LSF能够实现高分辨率二维成像，并与绝对CBF值呈线性关系。11在1.5%异氟醚麻醉下通过颅骨进行记录。大多数附着在颅骨上的骨膜都是用细尖镊子取出的。每次记录时，用盐水浸泡的纱布擦拭颅骨表面。在每次测试之前，使用校准参考装置（校准仪S/N 080715‐5；欧米伽波）进行校准。在相同大小的感兴趣区域（900像素）测量平均CBF，该区域位于前角后方1 mm和外侧2 mm处。CBF值以术前值的百分比表示。
磁共振成像
所有MRI均在配备梯度系统的7‐T水平钻孔成像系统（BioSpec 70/30 USR）上进行，梯度系统的最大梯度振幅为669 mT/m，摆幅为7989 T/m每秒。使用内径为86‐mm的线圈进行射频传输。使用4通道仅接收相控阵表面线圈检测信号。用异氟醚（4%用于诱导，1.5-1.8%用于维持）在1.2 L/min的室内空气中与0.1 L/min的氧气混合麻醉小鼠。将动物置于俯卧位置，并用咬杆和耳杆固定头部。体温由直肠温度计监测，并用温水床和暖气维持。连续监测心率和呼吸频率。T2加权图像采用松弛增强快速采集（RARE）序列采集，参数如下：RARE因子，8；重复时间（TR）/回波时间（TE），3500/28.74ms；平均数，2；基体尺寸，200×200；视野（FOV），2.0×2.0 cm2; 平面内空间分辨率，100×100μm2; 层厚，0.5mm；无间隙；切片数，35；扫描时间为2分55秒。使用快速低角度拍摄序列获得三维（3D）飞行时间（TOF）磁共振血管造影（MRA）图像，参数如下：TR/TE，22.43/3.30 ms；平均数，1；基体尺寸，200×200×200；视野，2.0×2.0×2.0厘米三; 空间分辨率，100×100×100μm三; 扫描时间为11分13秒。在三维TOF MRA中，使用了倾斜优化的非饱和激励脉冲和流量补偿。使用AZEWIN（AZE有限公司）重建最大强度投影图像。
冠状切片的CBF测量是通过使用流动敏感的交替反转恢复技术进行的，12,13基于ASL的方法。在每一个非选择性和切片选择性实验中，通过使用RARE序列获得22个不同反转时间的图像，参数如下：RARE因子，72；TR/TE，10 000/46毫秒；平均数，1；矩阵大小，128×128；视野，4.0×4.0厘米2; 平面内空间分辨率，313×313μm2; 层厚，1.0mm；和切片数，1。使用了以下反演时间值：30、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1950、2100和2300 ms。总扫描时间为8分24秒。使用ParaVison 5.1（Bruker BioSpin）从获得的44张图像中计算CBF图像。采集2个冠状切片（前角水平和海马水平[前角水平−2.0 mm]）的CBF图像。使用Dr View/LINUX R2.5.0程序（旭化成信息系统）对CBF图像进行感兴趣区域分析。在T2加权图像的相应切片中，直径为1mm的圆形感兴趣区域对称地放置在大脑皮层区域和皮层下区域，包括胼胝体（CC）、尾壳核和海马，并叠加在CBF图像上。CBF值表示为术前值的百分比。
组织学评价
通过腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）对小鼠进行深度麻醉，并用0.01 mol/L磷酸盐缓冲盐水和4%多聚甲醛经心灌注固定。大脑被移除，并通过海马在大脑前角和大脑前角−2mm处冠状分开，同时移除双侧CCA。大脑被石蜡包埋，切成6微米厚的冠状面，CCA被切成2微米厚的横切面。苏木精-伊红、弹性van Gieson（EVG）、Masson三色染色（MT）和Klüver-Barrera（KB）染色用于观察任何组织学变化，包括CCA内膜增厚和脑缺血变化。如前所述，WM病变的严重程度分为正常（0级）、神经纤维排列紊乱（1级）、显著空泡形成（2级）和有髓纤维消失（3级）。14对于免疫组织化学检测，小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（血管平滑肌细胞标记，1:200；DAKO）、兔抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（星形胶质细胞标记，1-2000；DAKO）、家兔抗电离钙结合接合器分子1（Iba1）抗体（小胶质细胞和巨噬细胞标记物，1:200；Wako），兔抗谷胱甘肽‐S公司使用转移酶π（GSTπ）抗体（少突胶质细胞标记物，1:100；Merck Millipore）和NeuN（1:100；默克Millipoer）抗体。使用ImageJ软件包（美国国立卫生研究院）计算CCA管腔面积狭窄百分比、CCA内膜厚度、CC中GFAP阳性星形胶质细胞、Iba1阳性小胶质细胞和GSTπ阳性少突胶质细胞的面积百分比。
Rotarod测试
如前所述，在GCAS或假手术后14天和28天，将小鼠放在旋转鼓上（Muromachi Kikai）并测量杆上保持平衡的时间，进行旋转试验。10在5分钟内，转子速度从4 rpm加速至40 rpm。试验重复5次，每次试验间隔5分钟。
电线悬挂测试
如前所述，在GCAS或假手术后14天和28天进行钢丝悬挂试验。15将一根金属丝（2 mm×60 cm）固定在一个透明的矩形开口塑料盒（30 cm高×60 cm宽×40 cm长）的顶部。电线被紧紧地固定在水箱的顶部，以避免振动，因为振动会干扰鼠标的性能。将小鼠放在金属线上，记录其跌倒的潜伏期。重复5次，每次尝试间隔5分钟。测定平均跌倒潜伏期。
Y‐迷宫测试
如前所述，通过Y迷宫测试评估空间工作记忆和自发活动。16Y迷宫测试在黑暗期（7-11）进行下午)GCAS或假手术后14天和28天。迷宫由3条相同的臂组成（长40厘米，高9.5厘米，宽4厘米），标记为A、B或C，与中心点成120°角。实验是在灯光昏暗的房间里进行的。在对每只小鼠进行测试后，使用超次氯酸水浸泡纸清洁迷宫地板，以消除气味，避免嗅觉提示。将每只老鼠放在起始臂的末端，让它们在8分钟的时间内在迷宫中自由移动，而不需要食物、水或电击足等强化物。手动记录手臂进入的顺序。当所有4只爪子都位于手臂滑道上时，一只老鼠被认为进入了手臂。交替被定义为连续进入所有3个兵种（例如，序列，ABCBCBCA被视为2次交替，第一次连续进入ABC，最后一次连续进入BCA，共6次；33%的交替）。最大交替次数的计算方法为手臂总次数减去2，交替百分比的计算方法是（实际交替次数/最大交替次数）×100。还记录了会议期间进入的武器总数，这反映了自发活动。在测试过程中，进入手臂少于8次的老鼠被排除在外，因为它们的数据没有反映出精确的变化。
莫里斯水迷宫试验
如前所述，Morris水迷宫测试在GCAS或假手术后28至32天进行。15莫里斯水迷宫测试包括一个圆形水池（直径120厘米，深度40厘米）和一套视频分析系统（EthoVision XT5；Noldus）。水池里充满了30厘米深的含有无毒白色油漆的水。一个透明的圆形平台（直径8 cm）被淹没在水池1个象限（目标象限）中心水面以下1 cm处。在红十字标志的另一侧，一个红色的十字标志和蓝色的向上箭头被用作游泳的方向提示。在最初的4天中，我们每天进行4次试验，每次试验间隔5分钟（采集阶段）。在采集阶段，平台保持在相同的位置。将小鼠放在起始位置（与目标位置相邻的象限；参见图8C中的区域2），然后释放到水中。每只老鼠被允许游泳60秒，发现隐藏的平台，然后爬上它。当老鼠到达平台或60秒过去后，试验立即终止。如果一只老鼠成功爬上了平台，它可以在那里停留10秒钟。如果鼠标在60秒内没有到达平台，则将其放置在平台上，并允许其停留15秒。记录到达平台的潜伏期（逃避潜伏期）和平均游泳速度。在第5天（最后一天），小鼠接受一次探测试验，将平台从游泳池中取出，让小鼠游泳60秒寻找平台。记录每个象限的游泳时间。
统计分析
使用StatView（SAS Institute）进行统计分析。图中所有数值均表示为平均值±SEM。数据由Mann–Whitney进行分析U型对两组进行比较测试，先进行单因素方差分析，然后进行Bonferroni校正，作为两组以上比较的事后检验，或进行双向重复测量方差分析，以比较CBF和行为表现的时间变化。与的差异P（P）<0.05在所有分析中均被视为具有统计学意义。
结果
死亡率
所有接受BCAS和假手术的小鼠存活至手术后32天，22只GCAS小鼠中的20只在GCAS后存活32天（存活率91%）。
受ACs影响的CCA逐渐缩小
将AC放置在双侧CCA上会导致预期的内腔狭窄（图B） ●●●●。术后28天，AC逐渐缩小，无腐蚀，直径狭窄57.0%（图B） ●●●●。值得注意的是，与术前CCA相比，CCA的苏木精-伊红染色显示动脉壁显著肥大，管腔面积狭窄79.3%（图C） ●●●●。我们用EVG和MT染色以及免疫组化α‐SMA和Iba1进一步评估了组织。32天以上接受ACs治疗的CCA显示EVG染色的内膜增厚（72.3μm），α-SMA阳性平滑肌细胞迁移到内膜，巨噬细胞浸润，而MT染色显示内膜中的胶原纤维没有增加，尽管术前CCA显示内弹力层内的内膜较薄，平均厚度仅为1.4μm（图D和E） ●●●●。这些发现表明，CCAs中诱导了内膜肥大变化，在早期动脉粥样硬化变化中也观察到了类似的变化。
用LSF记录皮层表面CBF的时间剖面
BCAS手术后第1天，皮质表面CBF急剧下降至基线水平的72.4%，第3天开始恢复，第28天达到82.5%。相反，在GCAS组中，BCAS组没有观察到急性期，术后第1天和第3天的CBF显著高于BCAS组的CBF。然而，术后28天，GCAS组的CBF继续下降，显著低于BCAS组（GCAS 70.8%vs.BCAS 82.5%）（图A和B） ●●●●。
脑血流的时间分布(CBF公司)小鼠颈总动脉逐渐狭窄（GCAS）。A和B，激光散斑流量计的代表性图像（A）和皮层表面的时间剖面CBF公司（B） 在小鼠中全球通用会计准则（n=12）和双侧CCA公司微弹簧圈狭窄（双侧CCA狭窄[BCAS]；n=7）。皮质表面的水平CBF公司在指定的时间点（每次手术前和手术后1、3、7、14和28天）的估计值显示为基线的百分比CBF公司.两组在双向重复测量方面没有显著差异方差分析. *P（P）<0.01,全球通用会计准则与BCAS公司在指定的每个时间点。C、 感兴趣的地区(投资回报率)用于测量CBF公司动脉自旋标记图像(ASL公司)磁共振灌注成像。这个CBF公司大脑皮质区的数值由6个圆环计算得出投资回报率s为蓝色，位于2个圆环的皮质下区域投资回报率红色s。D，代表性多层冠状CBF公司从获取的图像ASL公司在脑前角和海马水平全球通用会计准则手术后14天和28天全球通用会计准则手术。E、 他们的时间剖面CBF公司大脑皮层（蓝色）和皮层下（红色）全球通用会计准则小鼠（n=4）。两组在脑角和海马水平上没有显著差异。
ASL记录的区域CBF的时间剖面
VCI和皮层下缺血性血管性痴呆的特征之一是由终末动脉供血的脑深部组织出现慢性脑低灌注。因此，我们研究了GCAS后大脑深层结构中的CBF，并在GCAS前后进行了ASL。GCAS后28天，皮层和皮层下CBF逐渐下降（图C到E） ●●●●。GCAS后28天内，皮质下CBF水平的时间分布几乎与大脑前角和海马水平的皮质CBF相似。在角水平，第14天和第28天皮质下CBF分别为86.8%和51.5%，而皮质CBF分别是基线CBF的86.7%和54.6%。
GCAS小鼠颅内MRA信号逐渐减弱
LSF显示GCAS后28天皮质表面CBF为基线的70.8%，但ASL显示皮质和皮质下CBF≈基线的50%（图)提示我们用MRA可视化血管流动，以确定CBF水平差异的原因。GCAS后14天和28天，双侧颈内动脉、大脑中动脉和大脑前动脉的信号变得模糊，反映出颅内动脉中的前循环流量逐渐减少。相反，脑表面大脑后动脉向前循环发出的侧支血流信号在GCAS后14天开始出现，28天增强，GCAS后第14天和28天后交通动脉信号增强（图). 侧支循环的存在解释了用两种方法测量28天时CBF水平的差异：使用LSF评估的皮层表面CBF在一定程度上被侧支循环所补偿，但使用ASL评估的实质（皮层和皮层下）CBF没有。
颈总动脉逐渐狭窄（GCAS）后颅内动脉血流信号逐渐减少。7‐T脑磁共振血管造影前获得的颅内动脉血流信号的代表性图像全球通用会计准则（左），以及之后14天（中）和28天（右）全球通用会计准则箭头表示大脑后动脉侧支血流信号逐渐增加(PCA公司)前循环。ACA公司表示大脑前动脉；ICA公司颈内动脉；MCA公司大脑中动脉；PcomA，后交通动脉。
大脑的组织学变化
对CC、前连合（ACo）和视束（OT）KB染色分级评分的半定量分析显示，与假手术组相比，GCAS组的WM损伤明显更严重。GCAS后WM稀疏的分级在CC中为1至3级，在ACo中为1或2级，在OT中为0或1级。因此，OT中的WM变化明显低于CC和ACo（图A） ●●●●。在啮齿动物中，OT易受CCA狭窄和闭塞的影响，大鼠双侧CCA闭塞模型显示OT严重退化和萎缩。17视觉系统受损可能会影响运动和认知功能测试，如旋转木测试、Y迷宫测试和Morris水迷宫测试，因为即使在大鼠双侧CCA闭塞模型中，视觉线索也有助于辨别。10在GCAS模型中，OT中WM稀薄程度显著低于CC和ACo；因此，视觉系统似乎得到了保留，就像BCAS模型一样。9,10与假手术小鼠相比，GCAS小鼠CC中的脱髓鞘伴随着GFAP阳性星形胶质细胞和Iba1阳性小胶质细胞的显著增殖。与假手术小鼠相比，在第32天，GCAS小鼠中GST‐π阳性少突胶质细胞的数量趋于减少（图B） ●●●●。海马NeuN的免疫组织化学显示，在12只GCAS小鼠中，只有3只（25%）观察到海马神经元丢失，该区域被活化的星形胶质细胞和小胶质细胞包围（图). 此外，在12只GCAS小鼠中的4只中，在烧灼门、CC或大脑皮层中只有少量脑微梗死（数据未显示）。这些结果表明，GCAS小鼠表现出的组织学变化主要是由于慢性寡糖血症而非急性缺血性改变。
白质明显的低灌注性脑损伤(WM公司). A、 胼胝体旁突部Klüver–Barrera染色的代表性显微照片(科科斯群岛)假手术小鼠和逐渐颈总动脉狭窄（GCAS）小鼠在每次手术后32天的大脑前连合和视束。低线图显示了WM公司各自的变化WM公司区域。B、 胶质纤维酸性蛋白免疫染色的代表性显微照片(GFAP公司)电离钙结合适配器分子1（Iba1）和谷胱甘肽S公司‐转移酶‐π(消费税‐π）在科科斯群岛从假手术和全球通用会计准则小鼠在每次手术后32天。低线图显示了GFAP公司阳性星形胶质细胞、Iba1阳性小胶质细胞和消费税π-假手术大脑中的阳性少突胶质细胞和全球通用会计准则小鼠在每次手术后第32天。比例尺指示（A）中的50μm和（B）中的200μm*P（P）<0.01 vs假手术组；#
P（P）与视神经束相比<0.01。
只有25%的小鼠接受了渐进性颈总动脉狭窄（GCAS）手术，显示海马神经元丢失。一个全球通用会计准则苏木精-伊红（H&E）染色和NeuN免疫组化显示小鼠海马神经元丢失。海马神经元丢失周围GFAP公司阳性星形胶质细胞和Iba1阳性小胶质细胞。下面的直线直方图显示海马神经元缺失的小鼠数量。12例患者中只有3例出现海马神经元缺失全球通用会计准则小鼠和非假手术小鼠（假手术，n=10；全球通用会计准则小鼠，n=12）。
用于运动功能评估的Rotarod测试和钢丝悬挂测试
旋转试验表明，与GCAS组第14天和假手术组相比，GCAS组在第28天的跌倒潜伏期显著缩短，这表明GCAS小鼠在第28天后的运动协调和平衡能力显著受损（图A） ●●●●。同样，与GCAS组第14天和假手术组相比，GCAS组在第28天的钢丝悬挂测试中发现了明显更短的跌倒潜伏期，这表明GCAS小鼠在手术后第28天肌肉力量显著受损（图B） ●●●●。
在旋转试验和钢丝悬挂试验中逐渐颈总动脉狭窄（GCAS）小鼠的运动性能受损。A、 在第14天和第28天进行了5次连续的旋转试验，以测试运动协调性和平衡性。B、 在第14天和第28天通过钢丝悬挂测试测试神经肌肉强度*P（P）<0.01. 所有行为研究均在GCAS公司第14天（n=8）和第28天（n=12）的小鼠，以及假手术小鼠（n=10）。
空间工作记忆和自发活动评估的Y迷宫测试
我们通过Y迷宫测试检查了GCAS小鼠的空间工作记忆和自发活动是否受损。在GCAS组中，与假手术小鼠相比，第28天交替行为的百分比（用作空间工作记忆的指标）显著降低。GCAS小鼠的上臂进入次数（自发活动的标志）与假手术小鼠相当。这些结果表明，GCAS小鼠的空间工作记忆在手术后第28天受损，但在第14天没有受损（图).
Y迷宫试验中逐渐颈总动脉狭窄（GCAS）小鼠的工作记忆受损。在第14天和第28天用Y迷宫测试空间工作记忆和自发活动。全球通用会计准则第28天，小鼠表现出空间工作记忆障碍，但没有自发活动改变。所有的行为研究都是在全球通用会计准则第14天（n=8）和第28天（n=12）的小鼠，以及假手术小鼠（n=10）*P（P）<0.05.
参考记忆评估的莫里斯水迷宫测试
接下来，我们使用Morris水迷宫测试检查GCAS小鼠是否存在空间学习和参考记忆障碍。在整个获取阶段，GCAS小鼠表现出与假手术小鼠几乎相同的逃避潜伏期（图A） ●●●●。在采集阶段，GCAS和假手术小鼠的游泳速度没有差异（图B） ●●●●。在探针试验中，GCAS和假手术小鼠在1区（目标象限）的停留时间显著高于其他象限（图C） ●●●●。探针试验中游泳路径的检查表明，GCAS和假手术小鼠都选择性地搜索了正确的象限（图D） ●●●●。这些结果表明，GCAS小鼠保持了海马依赖性参考学习和记忆，反映出海马受到的损伤最小。
在Morris水迷宫试验中保留了逐渐颈总动脉狭窄（GCAS）小鼠的参考学习和记忆。A、 假手术第1天至第4天逃避潜伏期的时间进程全球通用会计准则小鼠处于获得阶段；两组间无显著差异。B、 两组在获得阶段的平均游泳速度没有差异。C、 显示探针试验中每个象限所用时间的柱状图*P（P）与2区、3区和4区相比，<0.05**P（P）与2区、3区和4区相比，<0.01。D、 探测试验中两组游泳路径痕迹的代表性图像。莫里斯水迷宫测试在全球通用会计准则12只小鼠和10只假手术小鼠。
讨论
我们建立了一种新的长期低灌注小鼠模型（GCAS模型），该模型避免了BCAS模型中观察到的急性CBF下降和由此产生的急性炎症反应。GCAS模型显示28天内CBF逐渐持续下降，伴有WM缺血性损伤，术后32天运动和工作记忆受损，这与VCI的主要特征相同。因此，与BCAS小鼠相比，在C57BL/6J小鼠双侧CCA上应用内径为0.75 mm的AC更准确地复制了慢性脑灌注不足。此外，CCA逐渐狭窄，由于平滑肌细胞迁移和巨噬细胞侵入内膜，AC诱导内膜增厚，随后（≈80%）管腔区域狭窄，模拟早期动脉粥样硬化。综上所述，GCAS模型小鼠复制了颈动脉狭窄导致的低灌注性脑损伤，以及随后在人类VCI中观察到的运动和认知障碍。
迄今为止，许多VCI啮齿类动物模型都是基于外科干预而建立的，例如慢性脑灌注不足模型（例如，大鼠双侧CCA闭塞、沙土鼠双侧CCA狭窄、小鼠单侧CCA闭塞和小鼠BCAS），短暂性全脑低灌注模型（如大鼠4血管闭塞和小鼠或沙土鼠双侧CCA闭塞）和局灶性卒中模型（如小鼠或大鼠大脑中动脉闭塞、内皮素-1注射、光激活血栓栓塞或注射栓子）。7然而，即使是BCAS模型，目前最有希望的VCI模型，8没有充分复制VCI的特征，因为模型显示CCA操作后CBF急性下降，随后CBF自发恢复。因此，目前尚不清楚术后低灌注或缺血性脑损伤（如WM稀疏/胶质增生）和认知功能障碍的病因是否源于急性血流动力学改变或持续但部分恢复的低灌注。相比之下，当前的GCAS模型通过使用内径为0.75 mm的AC，始终显示逐渐持续的CBF减少和持续的“慢性”脑灌注不足。
我们最近建立了一种WM梗死损伤模型，称为ACAS（不对称CCA手术）模型，方法是在右侧CCA上放置内径为0.5 mm的AC，在左侧CCA上放内径为0.18 mm的微线圈。18ACAS模型比GCAS模型表现出渐进但更深刻的CBF降低。因此，根据我们的研究目的，我们可以交替使用两种不同的小鼠模型，它们具有由CBF逐渐减少引起的不同程度的WM损伤。此外，这两个模型可以互补使用，以反映VCI的异质性。正如中风治疗学术行业圆桌会议所建议的那样，一种药物应至少在2种动物模型中有效，以便于将药物从试验台转化为临床试验。因此，使用GCAS和ACAS模型的临床前实验可以为VCI的临床试验提供科学证据和理论基础。
将ID为0.5 mm的较小AC双侧放置在CCA上会导致CCA逐渐闭塞，CBF显著减少，并出现多发性脑梗死，这意味着术后1个月死亡率达到≈60%。该模型模拟了人类颈动脉闭塞性疾病，在该疾病中会出现多发性脑梗死以及运动和认知障碍，因此有助于探索严重颈动脉疾病的新治疗方法。2,15另一方面，放置内径为0.75 mm的AC仅导致CCA狭窄，面积狭窄≈80%，但在GCAS后1个月未闭塞。这些结果表明，使用内径较大的ACs逐渐持续降低CBF成功地诱导双侧CCA逐渐狭窄，具有早期动脉粥样硬化的组织学特征。
已经建立了许多动脉粥样硬化疾病的动物模型，最广泛使用的是转基因载脂蛋白E缺乏小鼠模型，在该模型中，靶向性删除了载脂蛋白E该基因导致严重的高胆固醇血症和自发性动脉粥样硬化。然而，载脂蛋白E缺乏小鼠的CCA没有显示动脉粥样硬化病变或壁增厚，尽管主动脉弓和颈外动脉自发发生明显病变。19低密度脂蛋白受体缺陷小鼠发生动脉粥样硬化，尤其是在喂食高脂饮食时。然而，它们不会自发地在动脉中形成明显的结构变化，并且需要放置血管周围颈动脉颈圈以形成颈动脉狭窄。20其他手术诱导的模型包括放置在动脉周围的血管周围颈动脉颈圈和充气气球诱导的内腔损伤小鼠。这些手术程序在植入血管周围颈动脉颈圈后会导致急性动脉狭窄，或在球囊扩张后立即导致中层和弹性层突然机械损伤，这并不总是模拟人类动脉粥样硬化的逐渐发展和由此产生的狭窄。21虽然GCAS小鼠的CCA中没有显示泡沫细胞或钙化，但观察到随着AC的外部放置，内膜逐渐增厚，伴随着脑部血液动力学变化的放射学、组织学和行为学发现。在未来的研究中，通过喂食高脂肪饮食的小鼠或放置AC的载脂蛋白E缺乏小鼠，可能会产生更精确的模型。
VCI的临床表现通常包括运动障碍和执行功能障碍的特征，如工作记忆。执行功能障碍可归因于缺血性改变引起的前额叶-皮层下回路中断，主要由广泛的不完全性WM梗死或脑白质疏松症引起，其原因是小动脉闭塞/狭窄和脑灌注不足，22临床上称为宾斯旺格病。GCAS小鼠经历了工作记忆障碍，组织学表现为WM稀疏和胶质增生。GCAS小鼠保留的参考记忆是海马相对保留的结果，这与AD早期观察到的变化形成对比。因此，GCAS模型特别模拟了脑灌注不足导致的VCI的临床表现。
总之，我们制作了一种新型的VCI小鼠模型，将AC放置在CCA上，显示由于颈动脉狭窄病变，CBF逐渐持续减少。这与随后的低灌注性脑损伤，尤其是WM，以及运动和认知障碍有关。我们相信，该模型可用于未来VCI治疗的开发。
资金来源
这项工作得到了卫生、劳动和福利部（Ihara，No.0605-1）、教育、文化、体育、科学和技术部（Ihra，grant-in-Aid for Scientific Research（B），No.23390233；Hattori，《挑战性探索研究资助》，第26640034号；Enmi，科学研究资助（C），第25461867号）和武田科学基金会（Ihara）。
支持信息
视频S1。泪囊缩窄器（AC）的外科植入。通过颈部中线切口，露出左侧颈总动脉（CCA），并将其从鞘层（包括左侧迷走神经）中分离出来。CCA周围放置4‐0丝线。该缝合线轻轻地将动脉提起，将AC手术植入CCA，然后移除缝合线。
致谢
我们感谢Ahmad Khundakar博士编辑手稿，并感谢Takako Kawada女士和已故的Yoko Okamoto博士在染色和组织切片方面提供的出色技术援助。我们还感谢Masako Kunimi支持磁共振成像实验。
工具书类
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