Formononetin是一种新型FGFR2抑制剂，在临床前模型中有效抑制血管生成和肿瘤生长

formonetin抑制HUVECs对FGF2的反应

检测芒果苷的抗血管生成作用在体外首先检测FGF2诱导的HUVEC增殖。如图所示​图2A，2年在25～150μM的剂量范围内，FGF2刺激的内皮细胞增殖明显降低。此外，在没有FGF2的情况下，formonetin对HUVECs增殖的抑制作用不明显。为了验证formononetin是否会对HUVEC产生毒性作用，进行了LDH细胞毒性试验。如图所示​图2B，2B型与对照组相比，Triton X-100显著增加了LDH的释放，而formononetin对HUVEC的毒性作用很小。

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图2

formononetin对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和侵袭的影响

答：。芒柄花素以剂量依赖性的方式显著降低FGF2刺激的HUVEC增殖，而芒柄花素对未被FGF2激活的HUveC几乎没有抑制作用。B。施用Formononetin未导致LDH释放，表明formononentin对HUVEC的毒性作用很小（数据以平均值±SD表示，n个= 6, **对与对照组相比<0.01）。C、。在伤口迁移分析中，formononetin对HUVECs细胞迁移的影响（比例尺代表100μm）。D。Formonetin以剂量依赖性的方式减少侵袭细胞的数量（比例尺表示50μm）。E.公司。Formonetin可以剂量依赖性地抑制FGF2刺激的HUVEC的毛细血管长度（比例尺代表50μm）。数据以平均值±SD表示，n个= 6, *对< 0.05, **对与FGF2单独治疗相比，<0.01。

细胞迁移和侵袭对HUVEC的血管生成至关重要。我们进行了伤口愈合试验（图​（图2C）2摄氏度)研究芒果苷对细胞迁移的影响，并观察到芒果苷强烈抑制FGF2刺激的HUVEC迁移。我们还进行了跨孔侵袭试验，以评估HUVEC在不同浓度的芒果柄素存在下通过Matrigel的能力。如图所示​图2D，二维，formononetin以浓度依赖的方式显著抑制FGF2刺激的HUVECs的侵袭活性。为了阐明血管生成抑制的可能机制，对血管生成过程中的关键步骤内皮细胞的成管能力进行了评估在体外如图所示​图2E，第二版6小时内，溶媒组HUVECs粘附在Migtrigel表面形成毛细血管样结构。然而，用设计浓度的芒柄花素处理强烈抑制HUVEC的管形成。

Formonetin抑制FGF2诱导血管生成在体外和体内

为了进一步评估芒硝素对血管生成的潜在影响，我们使用了两种成熟的血管生成模型——鸡CAM和大鼠artic环试验体外和体内我们测定了芒硝素对微血管发芽的影响体外采用大鼠主动脉环实验。我们的结果表明，芒果苷几乎完全抑制了FGF2诱导的主动脉环萌芽（图​（图3A）。3A级). 此外，在CAM试验中，FGF2可以显著诱导新生血管，而用芒果苷治疗可以有效抑制FGF2诱导的新生血管（图​（图3B3B公司).

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图3

formonetin抑制FGF2诱导血管生成在体外和体内

答：。Formonetin剂量依赖性地抑制大鼠主动脉环器官型模型上的芽形成。比例尺表示1厘米。B。CAM分析。典型实验的象形图，显示不同治疗中的血管生成模式。比例尺代表1 mm。数据以平均值±SD表示，n个= 3, **对与FGF2单独治疗相比，<0.01。

Formononetin抑制HUVECs中FGFR2的活性

无论是否存在细胞外FGF2，其受体FGFR2和FGFR1在HUVEC上的表达保持不变(补充图1). 然而，FGFR2与FGF2及其下游蛋白激酶结合后的磷酸化刺激血管生成。为了研究formonetin是否降低FGF2与FGFR2的结合，我们进行了在体外使用HUVEC的免疫沉淀western blot分析显示，formonetin似乎降低了FGF2与其受体FGFR2的结合（图​（图4A）。4A级). 采用相同的方法评估FGF2与FGFR1的结合以及芒果苷的作用(补充图2). 为了验证免疫沉淀western印迹结果，我们使用分子模型研究确定了芒果苷与FGFR2的结合(补充图3). 然后，我们研究了formononetin对HUVEC中FGFR2信号通路的影响。如图所示​图4B4B类和​和4C，4摄氏度，formononetin明显减少了FGF2刺激的FGFR2磷酸化，而不是抑制FGFR1活性(补充图4). Formonetin还以浓度依赖的方式明显降低了HUVEC中FGF2刺激的FGFR2下游PI3K和Akt的磷酸化（图​（图4D）。4D（四维）). 相比之下，PI3K和Akt的总水平不受formonetin治疗的影响。同时，非芒柄花素不抑制PI3K和Akt mRNA（图​（图4E）。第四版). 上述结果表明，formononetin抑制在体外血管生成通过直接靶向HUVEC表面的FGF2-FGFR2轴，并进一步抑制FGFR2相关信号通路。

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图4

formonetin减弱FGFR2活性和FGFR2信号通路

答：。使用HUVECs进行免疫沉淀western blot分析表明，芒果苷似乎降低了FGF2与FGFR2的结合。B。通过Western blotting检测，Formonetin在体外抑制FGFR2磷酸化。C、。Formonetin抑制HUVEC中FGF2触发的FGFR2的激活（比例尺代表50μm）。D。Formonetin抑制HUVEC中FGFR2下游信号通路PI3K-Akt。印迹是三个实验的代表。每个都有GAPDH作为内部控制的表达。E.公司。用芒果素处理的HUVEC中PI3K-Akt mRNA的表达。数据来自三个独立的实验，平均值±SD。

formonetin抑制FGF2刺激的STAT3转录活性

为了确定formononetin靶向的转录因子，我们评估了它对几个在HUVECs增殖和迁移中起重要作用的转录因子的转录活性的影响。有趣的是，formonetin强烈抑制FGF2刺激的STAT3活性（图​（图5A）5A级)而不是c-Jun和NF-κB p65(补充图5). 为了进一步研究介导STAT3表达的信号通路，我们通过western blotting评估了用formonetin处理的HUVEC中总STAT3和磷酸化STAT3的表达。我们发现，在芒果柄素治疗后，STAT3总表达水平保持不变，而STAT3磷酸化被芒果柄碱抑制（图​（图5B）。5亿). 然而，芒果苷不能抑制FGF2刺激的c-Jun和NF-κB p65活性(补充图6). 此外，STAT3的活性也受到亚细胞定位的调节，因此我们试图探索马齿苋素在不同细胞组分中的作用。实验表明，formononetin明显消除了HUVEC细胞核STAT3磷酸化（图​（图5C）。5摄氏度). STAT3的活性也受到亚细胞定位的调节，因此我们试图通过免疫荧光染色和共焦显微镜来探索STAT3在亚细胞中的分布。如图所示​图5D，第五天FGF2处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）用芒果柄素（25μM）处理后，STAT3的广泛核转位几乎没有减少，而FGF2则使STAT3稳定，核分布广泛。为了进一步研究formonetin能否抑制与HUVEC迁移和侵袭相关的STAT3下游靶点的转录，我们对STAT3靶基因进行了定量实时PCR（qRT-PCR）分析，如MMP-2/9、转化生长因子-β1（TGF-β1）、CD31、COX-2和Ang2。qRT-PCR分析表明，formonetin降低了STAT3靶基因的mRNA表达水平（图​（图5E）。第五版). 与qRT-PCR结果一致，甲单花素也显著降低了这些基因的蛋白质水平（图​（图5F）。5楼). 这些发现表明，formonetin抑制STAT3靶基因转录。

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图5

Formononetin减弱FGF2诱导的HUVECs STAT3激活

答：。将生长至70-90%融合处的HUVEC与p-STAT3-TA-Luc和肾小球荧光素酶（每孔总计0.1μg质粒DNA）共转染18 h，然后用FGF2和formononetin共刺激6 h。通过DLR分析进行细胞裂解，并测定萤火虫荧光素酶与肾小球荧光素酶（相对荧光素素酶）活性的比率。对于所示的比较*对< 0.05, **对< 0.01.B。formonetin对FGF2刺激的STAT3蛋白表达的影响。在FGF2作用下，用不同浓度的芒果柄素处理HUVEC细胞。western blots分析STAT3蛋白表达。C、。用formonetin处理后，制备细胞质（Cyto.）和细胞核（Nu.）提取物，然后进行western blot检测STAT3磷蛋白水平^泰尔705和总计STAT3。D。用免疫荧光染色法分析formonetin对HUVEC细胞内STAT3表达的影响。细胞在FGF2下用芒硝素处理。STAT3检测到绿色，而细胞核使用DAPI用蓝色进行复染（比例尺代表50μm）。E.公司。在FGF2下，formonetin对STAT3靶基因mRNA水平的影响。在FGF2作用下，用不同浓度的芒果柄素处理HUVECs细胞，实时荧光定量PCR检测蛋白mRNA水平。F、。HUVEC在FGF2存在的情况下暴露于formonetin。然后，通过western blots分析蛋白表达。G.公司。FGF2存在下转染formonetin的HUVEC中MMP-2/9活性的定量。条形图表示为平均值±SD。n个= 3, **对与单独使用FGF2治疗的FGF2相比，<0.01。

考虑到MMP-2和MMP-9等MMPs可能参与多种人类恶性肿瘤的发生，基底膜和细胞外基质中IV型胶原的降解促进肿瘤的进展，包括侵袭、转移和血管生成，我们分析了它们的活性。采用荧光分析法对MMP-2和MMP-9活性进行定量，结果表明，在用芒果苷处理的HUVEC中，细胞外MMP-2与MMP-9的活性显著降低（图​（图5G5克).

formonetin抑制乳腺癌细胞增殖和FGFR2信号转导

为了研究芒果柄素的抗乳腺癌活性，选择了4株人乳腺癌细胞株T-47D、SK-BR-3、MCF-7和MDA-MB-231，以及人乳腺细胞Hs 578Bst。所有乳腺癌细胞都分泌大量的FGF2，并表达比FGFR1更高的FGFR2蛋白，并且该水平远高于Hs 578Bst细胞(补充图7). 如图所示​图6A，6A级，我们发现formononetin以剂量反应的方式抑制乳腺癌细胞增殖。计算了每个细胞系的IC50值，我们注意到在高微摩尔浓度下对Hs 578Bst的抑制作用比在乳腺癌细胞中等量的芒硝素的抑制作用强。然而，根据图，四种乳腺癌细胞系对芒果苷的敏感性与FGFR2水平无关​图6A6A级和补充图7我们还通过DNA片段分析和PARP裂解分析研究了芒果苷对MDA-MB-231和MCF-7细胞凋亡的影响。与生长抑制作用不一致的是，formonetin对MDA-MB-231和MCF-7细胞的凋亡均无影响(补充图8). 同时，经芒果柄素处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞中，PARP的分裂表达轻微(补充图8). 总的来说，这些数据表明，马齿苋素在乳腺癌细胞中具有普遍的抗癌活性，特别是抑制MDA-MB-231细胞的增殖。

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图6

芒果柄素对肿瘤细胞的抑制作用

答：。将乳腺癌细胞暴露于指定浓度的芒柄花素24小时。通过单溶液细胞增殖试验测定细胞活力。数据以平均值±标准差表示。数值表示为活细胞百分比，标准化为0.5%二甲基亚砜处理细胞中活细胞的百分比。B。Formonetin抑制MDA-MB-231细胞的非锚定生长。MDA-MB-231细胞在含有载体或formonetin的0.25%琼脂糖凝胶中培养3周。计算直径大于2 mm的菌落数量，数据表示三个独立实验的平均值±SD，每个实验重复进行*对< 0.05, *对与车辆相比<0.01。比例尺：1 mm。C、。Formonetin以剂量依赖性方式抑制FGFR2下游信号分子，包括p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt。印迹是三个实验的代表。每个都有GAPDH作为内部控制的表达。条形图表示为平均值±SD，n个= 5, **对与未经处理的细胞相比，<0.01。D。Formonetin抑制FGF2刺激的FGFR2下游信号分子。印迹是三个实验的代表。每个都有GAPDH作为内部控制的表达。条形图表示为平均值±SD，n个= 5,^**对与未经处理的细胞相比<0.01，^## 对与FGF2处理的细胞相比，<0.01。

为了验证formonetin是否能抑制MDA-MB-231细胞的凤尾鱼非依赖性生长，我们进行了软琼脂集落形成试验。Formonetin以剂量依赖性的方式大大减少了在软琼脂中生长的MDA-MB-231细胞的菌落数量和大小。（图​（图6B），6亿)，表明formononetin抑制在体外MDA-MB-231细胞的转化能力。由于PI3K和Akt是FGFR2的下游信号，也参与肿瘤生长，我们通过western blot和RT-PCR检测了PI3K与Akt。结果显示，给药后PI3K和Akt活性显著降低（图​（图6C）。6摄氏度). 为了确认formonetin靶向FGFR2，我们进一步分析了FGFR2-PI3K-Akt信号在FGF2存在下的表达。如图所示​图6D，第6天，formononetin显著抑制FGFR2磷酸化及其下调PI3k、Akt活性。然而，FGFR1及其下游调控蛋白对乳腺癌细胞没有影响(补充图9).

formonetin抑制乳腺癌生长和血管生成体内

测试芒果苷的抗血管生成作用体内，我们利用乳腺癌异种移植模型来评估formononetin是否能够抑制肿瘤诱导的血管生成。先前的研究表明，由于MDA-MB-231细胞系具有高度侵袭性，因此通常是选择靶向治疗的首选临床前模型在体外或体内因此，携带MDA-MB-231异种移植物的免疫缺陷小鼠通过灌胃给药每天用或不用甲素（100mg/kg）处理25天。治疗25天后，处死小鼠，取出肿瘤组织进行进一步分析。带有MDA-MB-231异种移植物和肿瘤块的代表性小鼠如图所示​图7A。第7章研究发现，formononetin显著抑制肿瘤体积（图​（图7B）7亿)与溶媒组相比，formonetin治疗组的肿瘤重量受到显著抑制（图​（图7C）。7摄氏度). 此外，formononetin治疗耐受性良好，并且溶媒组和formononentin治疗组之间的体重没有显著差异（图​（图7D）。第7天). 此外，在接受过formononetin治疗的小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑中未观察到任何损伤（数据未显示），这表明formononein治疗具有良好的耐受性。

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图7

formonetin抑制MDA-MB-231乳腺癌异种移植物的生长和血管生成

答：。MDA-MB-231异种移植物和肿瘤块的代表性小鼠。比例尺：1厘米。B。-C、。与车辆治疗的对照小鼠相比，formononetin治疗可显著抑制肿瘤生长。数值代表平均值±SD，n个= 6, **对与车辆组相比，<0.01。D。formonetin和溶媒处理小鼠的体重变化。formonetin治疗组和溶媒治疗组的体重无显著差异。E.公司。用抗p-FGFR2抗体制备肿瘤组织进行免疫组化检测^蒂尔463，p-STAT3型^727系列和CD31。右侧阳性细胞和微血管的统计结果（数据以平均值±SD表示，n个= 3, *对< 0.05, **对与车辆组相比<0.01）。比例尺表示50μm。F、。Western blot显示，formonetin治疗组PI3K、Akt和STAT3磷酸化下调。formononetin治疗组MMP-2和MMP-9也下调。数据来自三个独立的实验，平均值±SD。n个= 3, **对与对照组相比<0.01。

为了进一步研究芒果苷是否可以通过抑制血管生成来抑制乳腺癌的生长，用CD31、p-STAT3的特异性抗体对肿瘤组织进行染色^727系列和p-FGFR2^Tyr463型分化簇（CD31）是一种广泛使用的内皮标记物，通过计算微血管密度（MVD）来量化血管生成。用抗CD31抗体染色的肿瘤切片显示，formononetin抑制MVD（图​（图7E）。第七版). Formononetin治疗的小鼠也表现出p-FGFR2的显著减少^蒂尔463-肿瘤中的阳性细胞。如图所示​图7E，第七版，formononetin还降低了MDA-MB-231异种移植瘤中STAT3的磷酸化，这与结果一致在体外此外，formonetin治疗还导致FGF2Rα下游分子磷酸化下调，包括PI3K、Akt、STAT3和MMP-2/9（图​（图7F）。第7页). 所有结果表明，芒果苷至少部分通过FGF2/FGFR2信号通路抑制血管生成。

单溶液细胞增殖试验

细胞活力由CellTiter 96测定^®水单溶液细胞增殖试验（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。简单地说，将细胞接种在96周的细胞培养板中，并用指定的试剂处理。在孵育指定的时间段后，向每个孔中添加20μL One Solution试剂，并继续孵育4 h。使用Synergy™HT多模微孔板阅读器（Bio-Tek，Winooski，VT，USA）在490 nm处测量吸光度。所示药物对细胞存活率的影响被评估为与随机分配100%存活率的经载体处理的对照细胞相比的细胞存活率百分比[16]. 用SPSS统计软件计算抑制对照生长50%的芒硝素浓度（IC50）。

乳酸脱氢酶（LDH）毒性试验

释放到细胞培养物中的乳酸脱氢酶是细胞毒性和评估细胞膜通透性的指标。HUVECs以3×10的密度接种在96 well板中^三每个孔的细胞数。在与载体（0.1%二甲基亚砜）、1%Triton X-100或各种浓度的芒硝素孵育24小时后，收集细胞上清液并使用Keygen biotech的LDH细胞毒性检测试剂盒分析LDH活性。在490 nm处用微孔板阅读器读取形成的甲赞的吸光度[16].

伤口愈合

我们使用创伤愈合试验检测了HUVEC的迁移。简单地说，每个细胞都用各自的培养基在3.5厘米的平板上生长。在生长的细胞层汇合后，我们用移液管尖端在每个板上造成均匀的伤口，并用PBS清洗受伤的细胞层，以清除所有细胞碎片。然后，我们使用明亮视野显微镜在48小时评估闭合情况[17].

侵入试验

使用BioCoat Matrigel侵入室试剂盒（BD Biosciences）中的Matrigel-coated室进行检测。将无血清培养基中含有500μl的细胞添加到上室，并将完整培养基添加到下室。培养24小时后，去除膜上表面的非侵入性细胞，并固定侵入膜下表面的细胞。然后通过显微镜拍摄细胞膜进行细胞计数[18]取五个随机场。

锚定非依赖性生长试验

如前所述进行软琼脂集落形成测定，并进行了微小修改[19]. MDA-MB-231（1×10⁴)将1.5 mL生长培养基中的细胞与1.5 mL 0.5%琼脂糖混合在含有载体（0.1%二甲基亚砜）或formononetin的加热生长培养基上，并在60 mm细胞培养皿中的0.5%碱性琼脂上分层。只添加一次含有东莨菪碱的培养基；随后，每周添加不含芒果苷的培养基，持续21天，直到出现明显的大菌落。细胞用结晶紫染色进行菌落计数。

试管形成分析

使用每孔涂有100μl Matrigel基底膜基质（BD Bioscience）的12孔板进行试管形成分析，并在37°C下聚合30分钟。悬浮在含有2%FBS的M199培养基中的HUVEC以2×10的密度镀在Matrigel上⁵细胞/孔。然后将Formononetin（10和25μM）与FGF2一起加入。6小时后，拍摄Matrigel诱导的形态学变化，并通过测量每个场的总管长来评估毛细血管形成的程度[20].

大鼠主动脉环测定

如前所述进行大鼠主动脉环分析[21]. 简而言之，每孔48个平板涂有120μL Matrigel，并在培养箱中聚合。从6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠分离出的主动脉在低温磷酸盐缓冲盐水中清除外膜周围脂肪和结缔组织，并切割成圆周1～1.5 mm的环状。主动脉环被随机分成小孔，并用100μL的Matrigel覆盖物密封。将500μL无血清M199（含或不含芒硝素）中的FGF2添加到微孔中，每2天交换一次新鲜培养基。6天后，用倒置显微镜（Olympus）固定微血管萌芽并拍照。

鸡绒毛尿囊膜试验

如前所述，进行鸡绒毛尿囊膜（CAM）检测[22].

蛋白质印迹分析

简而言之，用8%SDS-PAGE分离细胞裂解物并转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后将膜与包括指示抗体在内的一级抗体孵育。在4°C下孵育过夜后，用二级抗体孵育膜。然后通过增强化学发光（ECL）检测系统（GE healthcare）显示免疫反应带。

FGFR2激酶抑制试验

使用基于FRET的在体外激酶分析（英国佩斯利Invitrogen的Z'-lyte分析）。分别用20μm或80μm ATP在50 mm HEPES（pH 7.5）、0.01%BRIJ-35、10 mm MgCl2、2 mm MnCl2、1 mm EGTA、1 mm DTT中检测FGFR2的激酶结构域。根据制造商的说明，在384孔板中进行了三次分析[23].

免疫荧光分析

用免疫细胞化学方法检测了芒果苷对FGF2诱导的HUVEC中FGFR2磷酸化表达的影响[24]. 在存在FGF2的情况下，用或不用芒果柄素对细胞进行24小时的预处理。用于免疫荧光标记，抗p-FGFR2^蒂尔463抗体作为一级抗体，山羊抗兔IgG-FITC作为二级抗体。在激光扫描共焦显微镜下观察并拍摄荧光细胞（德国曼海姆LEICA TCS SP5）。

免疫沉淀分析

通过加入0.5mL冰冷的RIPA裂解缓冲液在培养皿中裂解HUVEC。上清液通过15000离心收集克在4°C下孵育10分钟，然后在有或无芒柄花素的情况下在4°C下与IgG或FGF2孵育过夜，然后与抗FGF2培养4小时。然后，上清液与蛋白G-Sepharose（Santa Cruz）孵育4小时。通过短暂离心（6000 g）去除上清液后，用裂解缓冲液洗涤蛋白g-Sepharose 3次，然后在加载缓冲液中煮沸5分钟[16]. 免疫沉淀物用抗FGFR2抗体和抗FGF抗体进一步进行免疫印迹分析。

荧光素酶报告基因测定

将0.1μg/孔p-STAT3-TA-Luc报告质粒、p-c-Jun-TA-Luc报告质粒或p-NF-κB p65-TA-Luk报告质粒瞬时转染96孔培养板中的HUVEC（中国海门生物技术公司）。用肾素荧光素酶报告质粒标准化转染效率。转染后18小时后，用指定的试剂处理细胞。使用Glomax 96 Microplate Luminometer（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）通过双核糖核酸酶报告（DLR）分析系统测量相对启动子活性。

定量实时PCR（qRT-PCR）分析

HUVECs细胞与formononetin孵育24小时。根据制造商的说明，使用齐阿唑裂解试剂（美国加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）提取总RNA，并使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Thermo Scientific）反向转录1μg总RNA。对于qRT-PCR，使用Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems，Warrington，UK）和ViiA™7实时PCR系统（Applied Biosystems）使用25-50ng cDNA进行PCR扩增。酸性核糖体磷酸蛋白P0（RPLP0；36B4）用作内部对照[25]. PCR条件和引物序列列于补充表1.

异种移植模型和免疫组织化学检测

3×10⁶将人乳腺癌MDA-MB-231细胞植入雌性BALB/c裸鼠皮下，构建乳腺癌异种移植瘤。将肿瘤大小合适的小鼠随机分为两组，分别为载体治疗组和Formonetin剂量组（100mg/kg/天）。每天通过胃内给药给小鼠注射芒硝素或羧甲基化纤维素（载体）。每3天测量肿瘤体积和小鼠体重。肿瘤体积以mm计算^三=0.5×长度（mm）^三宽度（mm）²[26]. 在第25天牺牲小鼠后，将采集肿瘤和正常组织进行免疫印迹。使用image-J软件量化带强度。用CD31、p-STAT3等特异性抗体对去蜡切片进行染色^727系列和p-VEGFR2^泰尔951用亲和素-生物素-HRP复合物（热科学）和二氨基联苯胺作为显色剂进行检测。用苏木精对细胞核进行复染。对FGFR2^蒂尔463每个切片在五个随机高功率场中对阳性细胞进行计数，并以每个细胞室中阳性细胞的百分比报告。血管的平均积分光密度（平均IOD）符合以下公式：平均IOD=IOD/肿瘤切片面积。所有动物实验均按照山东大学医学院指南进行。

本项目得到了国家科学基金（81402523至WXY，81373990至WXX，81201797至LG）、江苏省自然科学基金（BK20141493（DA14）至XH）（江苏省“六成人才”高峰（2009-D-63至LG，江苏省自然科学基金（BK2009445 to LG）