PKD1通过丝氨酸491磷酸化抑制AMPKα2并损伤骨骼肌细胞的胰岛素信号^*

摘要

介绍

骨骼肌负责健康人约80%的胰岛素刺激葡萄糖摄取(1). 因此，严格调节肌肉细胞中的胰岛素信号和葡萄糖摄取对维持正常血糖水平和整体代谢健康至关重要。在胰岛素抵抗的病理环境中，如2型糖尿病（T2D）、，²目前影响全球3亿多人(2). 在细胞水平上，长时间接触过量营养物质，如葡萄糖、亮氨酸和游离脂肪酸（FFA），会损害正常调节葡萄糖摄取的信号传递过程。尽管已经对这些途径进行了详细研究，但更好地了解导致胰岛素信号功能失调的病理变化对于改进治疗策略至关重要。

AMP-activated protein kinase（AMPK）是一种能量敏感酶，被认为是细胞代谢的主要调节器(三). 当细胞能量水平低（AMP:ATP比率高）时，丝氨酸/苏氨酸激酶被激活，其激活信号用于细胞增加分解代谢（能量生成）过程，如葡萄糖摄取和脂肪酸氧化，并抑制合成代谢（能量消耗）过程，例如蛋白质和甘油三酯合成。AMPK通过其对Thr的磷酸化激活¹⁷²及其催化α亚基的变构修饰。活化的AMPK反过来介导运动和药理学激活剂的一些有益代谢作用，如双胍和噻唑烷二酮，它们可以提高胰岛素敏感性。最近的研究表明，Ser^485/491AMPKα1/α2亚基在降低其酶活性中起重要作用(4,–7). 我们最近发现，在培养大鼠趾长伸肌（EDL）时，葡萄糖水平升高（25对5.5米米)在1或2小时内，两种药物都增加了血清中AMPK的磷酸化^485/491并在Thr降低其磷酸化¹⁷²根据SAMS肽分析测定，这两种物质都降低了其酶活性(8). 同样，有报道称，当MIN6胰岛β细胞从低血糖（3 m米)培养基至高糖（25m米)1小时或过夜，在Ser⁴⁸⁵增加，Thr处的磷酸化¹⁷²被削弱了(9).

一些上游激酶被鉴定为磷酸化AMPK^485/491并抑制其在各种组织中的活性。例如，在心脏、骨骼肌和肝脏中，胰岛素和IGF-1通过激活Akt刺激AMPK磷酸化(4,7,10,11). 另外，在下丘脑，达贡等。(4,5)表明p70S6K磷酸化AMPKα2 Ser⁴⁹¹抑制AMPK活性并减少食物摄入。其他研究表明，在小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞中，IKKβ在⁴⁸⁵对脂多糖治疗的反应(12)而ERK1/2通过这种机制在成熟树突状细胞中抑制AMPK，以响应CCR7信号(13). 最后，据报道，蛋白激酶A（PKA）在INS-1细胞中磷酸化该位点以响应forskolin或GIP刺激(14)人二倍体成纤维细胞对溶血磷脂酸的反应(15). 多种激酶通过这种机制抑制AMPK，这表明生物需要严格控制AMPK酶的活性。是否还有其他激酶也在血清中磷酸化AMPK^485/491调节其活性和生物功能尚待确定。

蛋白激酶C（PKC）是一个丝氨酸/苏氨酸激酶家族，可被二酰甘油（DAG）、磷脂和钙激活²⁺（取决于亚型）。10种已知的PKC亚型中的几种长期以来一直与胰岛素抵抗的发展有关，但除了抑制IRS-1的丝氨酸磷酸化之外(16)，他们这样做的机制尚未完全阐明。蛋白激酶D1（PKD1）（人PKCμ的小鼠同源物）是一种相关的激酶，可以被DAG直接激活，也可以被新型PKC亚型磷酸化激活(17). 激活后，PKD1在Ser^744/748其激活环和Ser的自磷酸化⁹¹⁶在其C终点站。这种最近发现的酶最初被归类为非典型PKC亚型，但后来被确定在结构上与丝氨酸/苏氨酸激酶的钙/钙调素依赖性蛋白激酶（CaMK）组更相似，具有独特的底物特异性(17,18). PKD1的病理性过度激活与某些癌症的侵袭性有关(19)和心脏肥大(20,21)后者常出现在T2D患者中。PKD1表达或活性的改变是否影响AMPK激活尚不清楚。很明显，DAG类似物佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）激活PKC和PKD1以及许多其他信号分子，降低心肌细胞AMPK活性(22)，尽管它这样做的机制尚不清楚。

在本研究中，我们试图确定PKC或PKD1是否参与通过磷酸化抑制AMPK^485/491在骨骼肌细胞中。我们使用佛波酯PMA来确定广泛PKC/PKD1激活对AMPK磷酸化和活性的影响。通过使用非特异性和特异性PKC和PKD1抑制，我们首次证明PKD1在血清中磷酸化AMPK^485/491从而降低AMPK活性。

实验程序

结果

PKC激活剂PMA剂量和时间依赖性刺激AMPK-Ser^485/491C2C12肌管中的磷酸化

用PKC激活剂佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐（PMA）治疗之前已被证明降低心肌细胞中的AMPK活性，如SAMS肽分析所测(22). 我们试图确定PMA在C2C12肌管中是否具有相同的作用，如果是，它是否通过在血清^485/491所有剂量的PMA（10–100 n米)AMPK丝氨酸磷酸化显著增加(图1,A类和B类)PMA治疗30分钟至3小时（50分钟）米) (图1,C类和天). 通过PKC底物的丝氨酸磷酸化（数据未显示）测量的整体PKC活性的增加反映了AMPK-Ser磷酸化的增加^485/491.PKD在Ser的磷酸化⁹¹⁶和Ser^744/748在25 n的剂量下与PMA孵育，其激活环也显著增加米或更高，持续30分钟至3小时(图1,A–D). 由于这两个位点的磷酸化在所有处理中都发生了类似的变化，因此只有Ser的数据⁹¹⁶随后的实验显示磷酸化。值得注意的是，AMPK-Thr的磷酸化没有显著变化¹⁷²(图1,A类和C类)或其下游基板ACC-Ser⁷⁹（未显示数据）。用p-PKC（pan）（βII Ser）测定传统PKC亚型的磷酸化⁶⁶⁰)，以剂量反应方式增加；然而，PMA治疗并未增加非典型PKC的激活（数据未显示）。

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图1。

PMA治疗时间和剂量依赖性地刺激AMPK在Ser的磷酸化^485/491在C2C12肌管中。肌管用10–100 n米PMA持续30分钟(A类,B类)或50 n米PMA持续5–180分钟(C类,天). 细胞被裂解，蛋白质表达和磷酸化被Western blot分析。典型的Western印迹(A类,C类)及其密度分析(B类,天)如图所示。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6次）。所有实验均一式三份。*，第页与对照组相比<0.05。

非选择性PKC抑制剂Gö6983阻止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化^485/491在肌管中

确定血清中AMPK磷酸化是否增加^485/491由于PKC激活，我们使用非选择性PKC抑制剂Gö6983。Gö6983（5μ米)PMA处理前1小时（50 n米，30分钟）显著减弱血清中AMPK的磷酸化^485/491(图2,A类和B类). AMPK-Thr的磷酸化¹⁷²(图2A类)不受PMA处理的影响，但被抑制剂增加。通过PKC底物的丝氨酸磷酸化评估PKC活性，抑制剂降低PKC活性(图2A类)当通过磷酸化PKCβpan和PKD在血清⁹¹⁶(图2,A类和B类)，但不是PKCδ/θ（未显示数据）。

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图2。

PKD抑制阻止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化^485/491在C2C12肌管中。用非特异性PKC抑制剂Gö6983（5μ米) (A类,B类)或特定PKD抑制剂CRT0066101（10μ米) (C类,天)PMA处理前1小时（50 n米，30分钟）。细胞被裂解，蛋白质表达和磷酸化被Western blot分析。典型的Western印迹(A类,C类)及其密度分析(B类,天)如图所示。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6次）。所有实验均一式三份。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与PMA治疗相比<0.05。

选择性PKD1抑制剂CRT0066101防止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化^485/491

由于PKD激活环在Ser^744/748和Ser⁹¹⁶(图2,A类和B类)对应于血清AMPK磷酸化的变化^485/491，我们研究了PKD的特异性抑制是否可以减弱PMA诱导的AMPK的丝氨酸磷酸化。用特异性PKD抑制剂CRT0066101（10μ米)阻止AMPK-Ser磷酸化^485/491在C2C12肌管中(图2,C类和天). 在Thr下AMPK的磷酸化¹⁷²用这种抑制剂治疗后没有变化(图2C类). 如预期，PMA对PKD Ser的影响⁹¹⁶用CRT0066101治疗可消除磷酸化，用磷酸化-（Ser/Thr）PKD底物抗体检测表明，PMA治疗可使条带数量和条带强度总体增加，而CRT006601预处理可阻止这种增加(图2C类). 该抗体在110 kDa和62 kDa时检测到的条带可能代表PKD（在血清⁹¹⁶)和AMPK。

PMA处理抑制AMPK活性，而Gö6983或CRT0066101预处理会减弱AMPK的活性

最近的研究表明，AMPK-Ser的磷酸化^485/491可以抑制其活性，即使没有降低的Thr¹⁷²磷酸化，通常用作酶活性的替代读数(4,5). 我们试图确定AMPK-Ser磷酸化的变化^485/491PMA和PKC/D抑制剂Gö6983和CRT0066101引起的AMPK活性变化。使用方法部分中描述的SAMS肽分析，我们发现PMA治疗显著降低C2C12肌管中AMPKα2的活性(图3,A类和C类). 此外，用非选择性PKC抑制剂Gö6983预处理显著减弱了酶活性的降低(图3A类)，而特异性PKD抑制剂CRT0066101完全阻止了PMA诱导的AMPK活性下降(图3C类). 尽管AMPK-Thr的磷酸化缺乏变化¹⁷²或ACC序列⁷⁹，我们发现AMPKα2活性与Ser^485/491(图3,B类和天).

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图3。

PMA治疗可降低C2C12肌管中的AMPK活性，而PKC和PKD的抑制或S491A AMPKα2的表达可阻止这种降低。C2C12肌管用非特异性PKC抑制剂Gö6983（5μ米) (A类)或特定PKD抑制剂CRT0066101（10μ米) (C类)PMA处理前1小时（50 n米，30分钟）。通过SAMS肽分析测定AMPKα2活性。B类和天显示AMPKα2活性与血清^485/491磷酸化。E类用FLAG标记的WT AMPKα2或S491A AMPKβ2转染C2C12细胞。48小时后，用PMA（50米，30分钟），然后使用抗FLAG抗体进行裂解和免疫沉淀。蛋白质磷酸化和表达通过Western blot分析。使用SAMS肽分析法测定AMPK活性。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6）。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与PMA治疗相比<0.05。

AMPKα2在Ser上的磷酸化⁴⁹¹对PMA诱导的AMPK活性抑制是必要的

为了确定PMA诱导的AMPK活性降低是否需要丝氨酸磷酸化，用WT AMPKα2或磷酸缺陷的S491A AMPKβ2转染C2C12细胞。正如预期的那样，血清中AMPK的磷酸化⁴⁹¹在基础和PMA处理的条件下，S491A AMPKα2表达细胞受到抑制(图3E类). 虽然PMA显著降低了转染WT-AMPKα2的细胞中AMPKα2的活性，如SAMS肽试验所测，但在表达S491A AMPK？的细胞中未观察到PMA治疗的效果。这些数据表明⁴⁹¹磷酸化AMPKα2是PMA诱导的AMPK活性抑制所必需的。

敲除PKD1阻止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化^485/491

为了证实使用药物抑制剂获得的结果，该药物抑制剂表明PKD1参与PMA诱导的AMPK-Ser^485/491磷酸化(图2)，我们使用siRNA来降低PKD1 mRNA，从而降低蛋白质水平。正如预期的那样，用PKD1（基因名PRKD1）转染C2C12细胞导致磷酸化PKD1减少(图4,A类和B类). 与中显示的数据一致图2，PKD1敲除阻止了PMA诱导的AMPK-Ser增加^485/491磷酸化。这些数据提供了进一步的证据，证明PKD1与PMA诱导的Ser对AMPK的抑制有关^485/491磷酸化。

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图4。

PKD1敲除阻止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化^485/491在C2C12肌管中。用打乱或PKD1 siRNA转染C2C12肌管。48小时后，用PMA（50 n）处理肌管米，30分钟）。细胞裂解，蛋白质表达和磷酸化通过Western blot分析。典型的Western印迹(A类)以及他们的密度计分析(B类)如图所示。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6次）。所有实验均一式三份。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与PMA治疗相比<0.05。

抑制Akt、P70S6K或ERK不能阻止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化^485/491

如前所述，激酶Akt、P70S6K和ERK1/2已被证明在Ser^485/491对其他细胞类型的各种刺激作出反应。排除这些激酶参与PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化^485/491，我们使用了每种激酶的抑制剂。PI3K/Akt抑制剂沃特曼（100 n）预处理C2C12肌管米)不影响PMA刺激的AMPK丝氨酸磷酸化(图5A类). 正如预期的那样，PMA治疗并没有增加Akt磷酸化，但p-Akt-Ser⁴⁷³沃特曼处理降低了磷酸化。接下来，我们使用mTOR抑制剂雷帕霉素测试P70S6K是否参与。尽管P70S6K Thr³⁸⁹PMA处理、雷帕霉素（100n米)治疗不影响PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化^485/491(图5B类). 同样，用ERK抑制剂U0126（5μ米)对AMPK丝氨酸磷酸化没有影响(图5C类)尽管可以抑制PKD下游的ERK磷酸化。

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图5。

抑制Akt、S6K或ERK不能阻止PMA诱导的AMPK-Ser磷酸化^485/491.用PI3K/Akt抑制剂沃特曼（100 n）处理肌管米) (A类)mTOR/P70S6K抑制剂雷帕霉素（100 n米) (B类)或ERK抑制剂U0126（5μ米) (C类)PMA处理前2小时（50 n米，30分钟）。细胞裂解，蛋白质表达和磷酸化通过Western blot分析。显示了典型的Western blot及其密度分析。结果为平均值±标准误差(n个=每治疗3–6次）。所有实验均一式三份。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与PMA治疗相比<0.05。

PMA治疗通过Akt抑制胰岛素信号传导，而Akt通过Gö6983或CRT0066101预处理或PKD1敲除而减弱

为了测试PMA诱导的变化是否与胰岛素信号受损有关，我们测量了胰岛素刺激的Akt磷酸化。PMA处理（50 n米)30分钟内，胰岛素刺激的Akt-Ser减少⁴⁷³磷酸化(图6,A类和B类). Gö6983或CRT0066101预处理通过Akt恢复胰岛素信号。由于胰岛素和PMA都独立刺激AMPK-Ser^485/491分别通过Akt和PKD进行磷酸化，胰岛素和PMA的所有组合（有抑制剂和无抑制剂）都显著增加了AMPK的丝氨酸磷酸化(图6,A类和B类). 同样，siRNA介导的PKD1敲除也通过Akt恢复胰岛素信号(图6,C类和天). 然而，PKD1的敲除并不能阻止PMA诱导的IRS-1丝氨酸磷酸化，而IRS-1的丝氨酸磷酸化会损害胰岛素信号传导。因此，这表明PKD1的激活通过一种新的机制损害胰岛素信号传导，而不依赖于IRS-1磷酸化。

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图6。

PMA刺激PKD1损害胰岛素信号。 A类和B类，C2C12肌管接受或不接受Gö6983（5μ米)或CRT0066101（10μ米)PMA处理前1小时（50 n米，30分钟），然后进行胰岛素刺激（100 n米，15分钟）。C类和天用打乱或PKD1 siRNA转染C2C12肌管。48小时后，用PMA（50 n）处理肌管米，30分钟），然后进行胰岛素刺激（100 n米，15分钟）。细胞被裂解，Akt、AMPK、PKD1和IRS-1磷酸化通过Western blot分析。代表性斑点(A类,C类)和量化(B类,天)如图所示。*，第页与对照组相比<0.05；†，第页与胰岛素治疗相比<0.05。

S491A AMPKα2的表达通过Akt预防PMA诱导的胰岛素分泌损伤

为了评估AMPK是否参与PMA治疗后胰岛素刺激的Akt磷酸化降低，我们用磷酸缺陷的S491A AMPKα2转染细胞。而PMA治疗显著降低胰岛素刺激的Akt-Ser⁴⁷³在表达WT AMPKα2的细胞中磷酸化，在表达磷酸缺陷AMPK(图7). 这些数据表明AMPK Ser⁴⁹¹PMA需要通过Akt损害胰岛素信号。

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图7。

S491A AMPKα2的表达通过Akt阻止PMA诱导的胰岛素信号损伤。用WT-AMPKα2或S491A AMPKα2转染C2C12细胞。48小时后，用PMA处理细胞（50 n米，30分钟），然后进行胰岛素刺激（100 n米，15分钟）。然后对细胞进行裂解，并在Ser⁴⁷³Western blot分析。显示了具有代表性的印迹和定量。结果为平均值±S.E(n个=每治疗3–6）。*，第页与WT+胰岛素相比<0.05。

重组PKD1磷酸化物AMPKα2⁴⁹¹在无细胞条件下

为了确定PKD1是否直接磷酸化AMPK或是否需要中间信号分子，我们测试了重组PKD1在无细胞系统中是否磷酸化AMPK。与单独的AMPKα2相比，重组PKD1与AMPKβ2共同孵育可导致AMPKγ2在血清中磷酸化⁴⁹¹(图8A类). 作为阳性对照，Akt与AMPK的孵育也导致血清⁴⁹¹磷酸化。这些数据表明PKD1直接磷酸化AMPK。评估AMPKα2 Ser⁴⁹¹是PKD1的良好底物，我们将PKD1底物一致序列与Ser之前的残基序列对齐⁴⁹¹AMPKα2。虽然AMPKα2在−5位置具有脯氨酸而不是PKD1首选亮氨酸，但在−3位置的精氨酸确实排成一行(图8B类). 这与Akt相似，后者在−5和−3位置都喜欢精氨酸。

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图8。

重组PKD1在血清中磷酸化AMPK^485/491在无细胞分析中。重组AMPKα2/β1/γ1与重组PKD1或重组Akt孵育，如“实验程序”所述⁴⁹¹Western blot检测。所示的代表性图像来自一个凝胶/曝光。A类，PKD和Akt的共有底物基序与AMPKα2的486–491残基排列(B类).n个=每组3人。所有实验均一式三份。

讨论

更好地了解AMPK在分子水平上是如何调节的，对于改进T2D的药物靶向策略至关重要。AMPK在Thr上的磷酸化¹⁷²激活环的激活通常被认为是激活AMPK所必需的，并且经常被用作其活动的读数。然而，我们的数据增加了越来越多的研究表明，AMPK在Ser^485/491可以抑制AMPK活性，即使p-AMPK-Thr没有变化¹⁷²(4,5). 这些数据表明，AMPK在Ser^485/491可以独立于p-AMPK-Thr的变化来抑制AMPK活性¹⁷²以及对p-AMPK-Thr的抑制¹⁷²Ser不需要^485/491磷酸化诱导AMPK活性的抑制。我们还首次表明，PKD1激活可以刺激AMPK-Ser的磷酸化^485/491骨骼肌细胞中，导致胰岛素信号受损。除了识别一种新的激酶，它可以通过Ser抑制AMPK^485/491磷酸化，这些研究提出了AMPK可能被过量营养物质抑制的可能机制，因为已知DAG（激活PKD1）会因高糖和高脂而增加。

2012年，筑屋等。(22)证明60分钟的PMA处理（1μ米)通过SAMS肽分析测定，心肌细胞中AMPK活性抑制约33%。他们发现，非特异性PKC抑制剂双吲哚酰马来酰亚胺I（BIM I）和ERK抑制剂U0126可以阻止这种抑制，这使他们得出结论，PMA通过涉及PKC和ERK途径的机制抑制AMPK。随着AMPK活性的降低，能量状态（AMP/ATP比率）没有明显变化。据我们所知，这是首次报道PMA治疗导致AMPK抑制；然而，在Thr时AMPK磷酸化¹⁷²或Ser^485/491未测量。与这些结果一致，我们发现PMA治疗显著降低了C2C12肌管中AMPK的活性(图3A类,​，3C）。三C） ●●●●。然而，我们发现只有50 n的剂量米30分钟后，AMPK活性下降50-60%，几乎是心肌细胞的两倍。此外，我们的结果表明ERK不参与AMPK在Ser^485/491由PMA诱导。这些差异可能是由于单元类型或方法的差异造成的。

据报道，有几种激酶在血清中磷酸化AMPK^485/491.我们(4)和其他(7)研究表明，Akt在肌肉、肝脏和心脏的这个部位磷酸化并抑制AMPK，以响应胰岛素。据报道，在下丘脑中，mTOR/p70S6激酶途径可引起瘦素的抑制反应(5)，这一作用对于调节瘦素的厌食作用至关重要。在小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞中，Park等。(12)表明IKKβ在血清中磷酸化AMPK⁴⁸⁵对成熟树突状细胞中LPS治疗的反应。ERK1/2最近被证明在这个丝氨酸残基上磷酸化AMPK(13)，这可能是CCR7信号传导促进细胞生存机制的重要部分。此外，据报道，蛋白激酶A（PKA）是AMPK-Ser的上游激酶^485/491INS-1细胞对forskolin或GIP刺激的反应(14)人二倍体成纤维细胞对溶血磷脂酸的反应(15). 我们排除了Akt、S6K和ERK是AMPK-Ser的上游激酶^485/491磷酸化对PMA处理的反应(图5); 然而，我们已经确定PKD1是一种新的酶，将被添加到越来越多的激酶中，这些激酶通过Ser抑制AMPK^485/491磷酸化。此外，我们发现AMPK活性和Ser^485/491在这些条件下，表明PKD1在这种情况下负责丝氨酸磷酸化和AMPK的抑制(图3,B类和天). 磷酸缺陷S491A AMPKα2突变体的表达阻止了PMA诱导的AMPKα2活性的降低，这一事实证实了AMPKα2在Ser⁴⁹¹是PMA诱导的AMPK激酶活性抑制所必需的。

许多上述激酶可以通过Ser介导AMPK抑制^485/491磷酸化与合成代谢或促高营养信号通路相关（Akt，mTOR/P70S6K）。这并不奇怪，因为AMPK通常在有利于分解代谢过程的低能条件下被激活，而在有利于合成代谢过程的能量过载条件下被抑制。与此相一致，PKD1最近被确定具有促高营养功能。例如，哈里森等。(21)据报道，表达心肌特异性、组成活性PKD1突变体的转基因小鼠出现心肌肥大，随后出现心室扩张、室壁变薄和收缩功能障碍。他们还表明，患有心力衰竭的自发性高血压大鼠心肌中PKD1的表达和活性显著增加，胸主动脉环扎进一步加剧了这种影响。此外，PKD1激活在特发性扩张型心肌病患者的心脏中升高(20). 虽然这些结果表明PKD1的激活可能足以诱导病理性心脏重塑，但PKD1在骨骼肌中的作用尚不清楚。麦基等。(25)据报道，肌肉中AMPK的丢失不会导致运动期间HDAC5磷酸化的改变，但PKD激活的代偿性增加约33%，表明这两种蛋白质在运动反应中的功能可能冗余。尽管他们没有研究PKD丢失或激活对AMPK激活的影响，但这些数据以及我们的结果表明，PKD和AMPK可能在骨骼肌中相互负调控。

进一步证据支持AMPK和PKD1之间潜在的功能冗余，至少在运动反应中HDAC5磷酸化方面，事实上，骨骼肌中过表达组成性活性PKD1的小鼠在重复收缩和向I型和IIa型肌纤维转变时表现出抗疲劳能力(26)而骨骼肌中显性负激酶死亡PKD1的表达会导致跑步性能受损，并阻止纤维类型的转换(27). 同样，人们早就知道AMPK介导肌肉对运动的许多适应(28)肌肉中AMPK的缺失会导致跑步能力受损(29).

我们的数据表明，PKD1激活通过Akt损伤C2C12肌管中的胰岛素分泌，这一效应可通过药物抑制和PKD1基因敲除来阻止(图6). 众所周知，PMA激活PKC会通过引起IRS-1的丝氨酸磷酸化而损害胰岛素信号。有趣的是，PKD1敲除并没有减少PMA诱导的IRS-1丝氨酸磷酸化，尽管恢复了胰岛素刺激的Akt磷酸化。这些数据表明，PKD1激活通过IRS-1依赖性机制损害胰岛素分泌，但确切机制尚待确定。此外，我们已经证明AMPKα2 Ser⁴⁹¹虽然需要进一步的研究来确定确切的机制，但胰岛素信号的损伤是必需的(图7). 虽然AMPKα2是骨骼肌中的主要亚型，但AMPK⁴⁸⁵可以解释为什么Akt磷酸化没有完全恢复到控制水平。本研究是PKD1激活导致胰岛素分泌受损的首次报道，其机制尚需进一步研究，尽管我们已经证明其与AMPK有关。

总之，我们已经报道了骨骼肌细胞中PKD1和AMPK之间的一种新的抑制关系，PKD1通过在Ser⁴⁹¹α2亚单位。由于PKD1可能直接被DAG（或DAG类似物PMA）或新型PKC亚型激活，我们还没有排除新型PKC异构体也可能参与PKD1上游的这些过程。同样，尽管我们已经证明PKD1的激活对于AMPK的抑制是必要的，并且AMPKα2 Ser⁴⁹¹是通过Akt损伤胰岛素信号所必需的，需要进一步研究来进一步阐明导致这种损伤的途径。我们的数据表明，PKD1抑制可能是预防AMPK抑制和肌肉胰岛素敏感性受损的一种新策略；然而，根据文献中报道的PKD1在多种组织中的功能不断增加的列表，这种策略必须谨慎对待，并且可能是以高度可控的组织特异性方式。

作者贡献

K.A.C.和R.J.V.设计、执行和分析了实验，K.A.C写下了手稿。K.A.和B.S.S.在进行实验和准备数字方面提供了技术援助。N.B.R.和A.K.S.帮助进行了手稿的实验设计和编辑。Y.D.为中所示的数据提供了试剂和技术指导图3和​和6。6BBK编辑了手稿。所有作者对结果进行了审查，并批准了手稿的最终版本。

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