图4。

USP15促进β-catenin稳定性和成骨细胞分化。(A类)USP15或载体对照与TOPflash-luciferase和雷尼利亚β-catenin的缺失或存在。转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚.P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）Bonferroni修正学生的值t吨测试：**P（P）< 0.01. (B类)C3H10T1/2细胞感染表达对照或使用15shRNAs，并用Flag–β-catenin、TOPflash-luciferase和雷尼利亚存在或不存在MEKK2 WT或KD突变体。转染48小时后测量荧光素酶活性，并将其归一化为雷尼利亚.P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）Bonferroni修正学生的值t吨测试：*P（P）< 0.05. (C类)将Flag–β-catenin与载体或USP15一起转染HEK293细胞，通过脉冲相标记法测定β-catentin的稳定性[³⁵S] 蛋氨酸然后放射自显影。数字表示相应波段的密度测量值与时间=0时的值之比。(D类)HEK293细胞感染表达对照或使用15shRNA。用Flag–β-catenin和MEKK2转染产生的细胞，并用[³⁵S] 蛋氨酸然后放射自显影。(E类)人骨髓间充质干细胞感染指示慢病毒，并在成骨细胞分化条件下培养6天，然后进行免疫印迹。(F类)使用重组蛋白进行β-连环蛋白的体外泛素化测定。激活的His–β-catenin与重组SCF孵育^SKP1系列复合物、泛素、ATP、E1和E2，无论是否存在重组MEKK2或USP15。免疫印迹证实了MEKK2对S675β-catenin的磷酸化。(G公司)使用重组蛋白进行了泛素化β-连环蛋白与USP15的体外相互作用分析。在有或无重组MEKK2的情况下，将标记的泛素化β-连环蛋白与重组USP15孵育，用标记抗体-琼脂糖免疫沉淀，并用指示抗体免疫印迹。MEKK2介导的β-连环蛋白S675磷酸化通过抗磷酸化β-连环素（S675）抗体免疫印迹证实。(H（H）和我)人骨髓间充质干细胞感染表达对照或使用15shRNAs，在成骨细胞分化条件下培养21天(H（H）)茜素红染色测定成骨细胞矿化活性。(我)培养10天后，用RT-PCR分析成骨细胞标记基因的表达。对于每个图形，P（P）单因素方差分析结果<0.05。P（P）Bonferroni修正学生的值t吨测试：*P（P）<0.05**P（P）< 0.01; ***;P（P）< 0.001.