雄激素受体（AR）调节参与男性表型发育和维持的基因，也在前列腺癌（PCa）的生长和生存中发挥作用。AR是一种配体激活的转录因子，属于核受体超家族的I类亚群1在缺乏激素配体（睾酮和二氢睾酮）的情况下，未刺激的AR优先位于细胞质中。在那里，AR与热休克蛋白和各种共同伴侣形成复合物，使AR保持能够与配体结合的构象，并保护受体免受蛋白水解2经激动剂配体结合激活后，主要是细胞质AR易位到细胞核，其中AR-甘氨酸复合物结合多个靶基因的基因启动子和增强子区域中的雄激素反应元件三,4随后，AR复合体启动特定转录共调节因子的招募，这些共调节因子改变局部染色质结构以增强转录启动，并诱导靶基因的转录5.
AR与DNA和蛋白质的相互作用，以及分子拥挤和细胞内结构屏障，可以以配体依赖的方式引起AR的复杂动力学行为。AR核/细胞质定位的改变及其与其他分子的相互作用与PCa的生长、进展和耐药性密切相关6紫杉烷微管靶向剂，包括多西紫杉醇和紫杉醇，在治疗转移性PCa方面取得了成功，是去势耐受性转移性PCa的一线治疗选择。紫杉烷已被证明能与微管结合并阻止其分解，从而抑制微管动力学并导致有丝分裂阻滞和凋亡7这被认为是紫杉烷在PCa中作用的唯一机制，直到最近，研究表明紫杉烷也可能通过抑制AR核转位的机制发挥作用8,9这表明对AR的直接抑制作用也有助于紫杉烷的功效10最近的几个临床观察结果支持了这一观点，即激素治疗和基于紫杉醇的化疗在去势耐药前列腺癌中的交叉耐药性，表明这一表型可能是一个共同的罪魁祸首11,12,13,14,15结合显示动力蛋白介导AR转运的报告，紫杉烷处理后AR的深层细胞质隔离暗示了微管在AR从细胞质穿梭到细胞核中的作用8然而，在活细胞中仍缺乏这种机制的证据。揭示AR动力学的细节可能有助于指导前列腺癌治疗策略的发展。
最近发展的显微镜技术大大提高了我们对核受体动力学的理解，包括AR4,5,16,17,18,19,20探测分子动力学的一种常见方法是通过光浸出后的荧光恢复（FRAP）18,19,20它通过选择性地漂白细胞区域并观察荧光回到该区域来测量荧光粒子的扩散系数。然而，由于大量的实验变量、多种分析方法以及FRAP在短时间间隔内的不准确，这些量化结果未能对转录因子的流动性及其与DNA相互作用的性质和时间提供一致的观点21其他小组已实施荧光相关光谱（FCS）方法4,5这是一种既可以评估扩散又可以评估结合的方法。然而，FCS仅测量单个位置的波动。此外，大多数研究都集中于核内AR动力学。目前还缺乏跨不同细胞隔室AR的动力学图像，并且就我们所知，尚未讨论各向异性AR运动的潜在存在。
成像相关光谱（ICS）是一种在宽时空尺度上探测细胞内动力学的有吸引力的方法。它能很好地与基因编码的荧光蛋白一起工作，并且对生物系统的扰动最小。我们专门应用了光栅图像相关光谱学（RICS）22,23通过利用共焦成像光栅图像扫描的像素采集时间结构，RICS可以测量微秒到毫秒的时间尺度上的分子动力学。与RICS相比，FRAP绘制扩散系数的能力有限，因为只能测量少数预选区域。
虽然RICS提供各向同性扩散信息，但为了进一步研究AR动力学的各向异性和较慢分量，我们需要一个额外的维。为此，我们开发了一种新的技术，称为多模态图像相关光谱（mICS），通过将相关性拟合到一个双分量函数，从图像堆栈中提取各向同性和各向异性AR运动。mICS分析基于时空图像相关光谱（STIS）24捕捉速度较慢、可能各向异性的运动。自引入以来，STIS方法主要用于蛋白质定向运动的1秒时间尺度上的帧速率25,26,27STICS的扩展，包括iMSD和相关技术28,29,30,31,32最近开发的，用于通过拟合一系列相关函数来提取蛋白质扩散规律，以均方位移-时滞图的形式。将不同滞后时间的时间轨迹关联起来，得到一条衰减曲线，该曲线可以用模型函数拟合，以提取分子动力学信息。我们基于iMSD的思想开发了mICS，并将其推广到包括各向异性组件。
在本研究中，我们结合RICS和mICS分析，定量测量了细胞内AR动力学以及由于激动剂配体结合引起的变化。我们观察到AR在细胞质和细胞核内扩散、受限运动和结合。结合我们的实验数据和模拟，我们的发现表明，随着细胞质中扩散的存在，AR穿过核膜的概率是决定AR易位的关键因素，与细胞质中功能性直接运输的存在无关。这表明，紫杉醇诱导的AR易位阻滞可能涉及除阻止达因介导的AR转运以外的机制。
结果
扩散有助于GFP-AR在细胞中的分布
我们使用稳定表达GFP-AR的克隆PC3细胞系作为我们的模型系统，研究AR激动剂的存在导致的AR动力学变化。PC3是一种低AR表达的转移性前列腺癌细胞系，本研究支持限制非荧光内源性AR的干扰。为了验证我们模型系统的功能，我们分析了我们细胞系中AR表达水平和AR依赖性基因转录。Western blot定量显示，与LNCaP细胞系内内源性AR相比，我们的PC3 GFP-AR细胞系中AR的过度表达为2倍（参见补充图S1a)，表明我们的模型系统不包含非生理水平的AR。荧光素酶分析证实了含有雄激素反应元件的基因的配体刺激激活，证明了GFP-AR的生理功能（参见补充图S1b). 对于配体刺激，我们选择了合成的AR激动剂Cl-4AS-1，因为它具有很高的光稳定性。许多常用的AR激动剂（如R1881）是可光解的，因此不适用于延时荧光成像。我们通过时间推移成像和量化细胞质和细胞核中AR强度的变化，建立了Cl-4AS-1诱导AR易位的时间尺度。对瞬时表达GFP-AR的HeLa细胞进行了相同的测量。PC3和HeLa细胞之间类似的强度变化模式表明，GFP-AR易位动力学在不同的细胞系中是可比较的(). 在PC3和HeLa细胞系中，易位可以在20到30分钟内看到，与以前的报告类似三,33.
扩散有助于GFP-AR在细胞中的分布。(一)用Cl-4AS-1处理0分钟后表达GFP-AR的PC3细胞的延时图像。GFP-AR在20分钟左右显示出从细胞质到细胞核的明显易位。请注意，即使存在激动剂，GFP-AR在细胞质中的分布也相对均匀。(b条)用Cl-4AS-1处理0分钟后表达GFP-AR的HeLa细胞的延时图像。GFP-AR易位动力学类似于(一). 比例尺：10μm。(c（c）,d日)GFP-AR细胞质（红线）和细胞核（黑线）随时间推移的归一化总强度变化(一,b条). 分别在15s/帧和20s/帧下采集图像。(e（电子）)表达GFP-AR的PC3细胞用SiR-tubulin染色，突出微管，用Cl-4AS-1刺激24分钟。SiR-tubulin呈纤维结构，GFP-AR则均匀分布于细胞质中。(（f）)与自相关不同，自相关表示0像素偏移时100%的共定位（皮尔逊相关系数（r第页 = 1） GFP-AR和SiR-tubulin的互相关在-4和4之间的所有像素移动均未显示出强相关性，表明SiR-tuublin和GFP-AR没有明确的共定位(克)测定配体（Cl-4AS-1）处理前后的GFP-AR扩散系数。这些组之间未检测到显著差异，表明AR激动剂的加入对扩散型GFP-AR的流动性没有显著影响（1向方差分析，p值=0.58）。(小时)RICS测量的GFP-AR核扩散系数（D=9.25±5.27μm2/s） 和细胞质（D=9.72±7.3μm2/s） ●●●●。GFP-AR在细胞质和细胞核中的扩散率无显著差异（双侧t检验，p值=0.76）。
AR和微管先前通过固定细胞免疫训练显示有部分共定位8为了观察AR的空间分布是否与活细胞中的微管位置相关，我们用SiR微管蛋白对活PC3-GFP-AR细胞进行染色，以观察内源性微管。GFP-AR和SiR-tubulin显示出不同的模式()：前者在整个细胞中均匀分布，可能是由于扩散，而后者如预期的那样，局限于纤维中。我们通过计算空间互相关来估计共定位的程度34细胞质和细胞核中的GFP-AR和SiR-微管蛋白(、红框和白框）。GFP-AR和SiR-tubulin的相互关系表明，在−4和4之间的所有像素位移都没有很强的相关性，42 nm/像素（r第页 < 原子核和r为0.02第页 < 细胞质0.14，无可识别的相关峰）。我们的结论是，大多数GFP-AR不与微管结合，很可能在细胞质中自由扩散。AR的相对均匀分布持续存在于激动剂刺激的AR易位过程中，如，进一步表明AR扩散是恒定存在的。
为了测量GFP-AR的扩散系数，我们在AR易位的不同阶段在细胞质和细胞核内应用RICS。AR扩散系数在Cl-4AS-1处理过程中无明显变化(，单向方差分析，p值=0.58，N：细胞数）；平均扩散系数为7.2～11.8μm2/第条。AR在细胞质或细胞核中的扩散率也没有显著差异(，双侧学生t检验，p值=0.76）。总的来说，使用RICS测量的AR扩散系数为9.2±6.2μm2/s、 扩散AR存在于易位的各个阶段，包括细胞质和细胞核。一些测量结果显示扩散系数要高得多（)可能是由于子蜂窝位置的不同周围环境造成的。作为对照，我们使用相同的实验装置测量了eGFP在PC3细胞中的扩散。胞质eGFP扩散系数为30.8±6.3μm2/s、 与先前报道的真核细胞浆中GFP扩散系数（27μm2/s在CHO细胞中）35我们的结果表明，GFP-AR扩散速度约为荧光蛋白单独扩散速度的三倍。如果AR在细胞质中的扩散遵循Stokes-Einstein方程36与内源性AR相比，GFP分子（27kDa）与AR（110kDa。
mICS分析方法概述
虽然RICS提供各向同性扩散信息，但为了进一步研究AR动力学的各向异性和较慢分量，我们开发了mICS分析。此方法的概述如所示本研究所述分析与原始STICS和iMSD方法的主要差异在于拟合步骤和数据解释。为了更准确地描述由各向同性运动（扩散和结合）和各向异性运动（受限运动和潜在直接输运）组成的AR动力学的复杂性质，我们实现了明确提取这两个特征的双分量高斯拟合。此外，我们保留了空间动态信息和细胞内的异质性。通过这一分析阐明了多个层次的动力学方面：形状来自STIS，它指示各向异性运动的方向和程度；各向同性和各向异性种群的相对丰度；给出扩散/结合速率信息的时间延迟相关图。
运动测量的mICS分析工作流程。为了分析GFP-AR各向异性运动及其较慢的动力学，我们实现了mICS分析。图像采集：首先，以256×32像素格式采集图像，以捕获细胞质和细胞核部分，同时使用常规共焦显微镜将采集速度保持在接近50毫秒/帧。每次测量获得1000帧。固定部分去除：对获取的时间堆栈进行了校正，以进行光浸出并去除不动部分，从而使相关性仅由像素强度波动组成。时空图像相关性：mICS应用于32×32像素窗口，将时间序列（t=1至1000）转换为像素移位相关的时间延迟序列（τ=1至20，对应于时间延迟=50ms至1s）。相关图像拟合：然后用两个二维高斯函数拟合时间延迟序列，以提取各向同性扩散/结合以及定向受限粒子运动。信息提取：给出了拟合结果的示意图，以说明其大小和各向异性方向性，并详细显示了τ的变化。有关详细说明，请参见方法：mICS分析.
在mICS中，帧速率充当一个时间滤波器，用于区分快速扩散分量和慢速运动。我们模拟了具有不同扩散系数的粒子，以显示我们的测量参数可以捕捉到的动态范围（参见补充图S2a). 在50 ms/帧时，快速扩散（D>1μm2/s） 导致弱相关性，而较慢的扩散在相关性图像中产生各向同性分量，并且该各向同性分量的振幅随着延迟时间的延长而减小。我们进一步证明了与细胞内自由GFP扩散、甘油溶液中扩散的荧光珠以及与细胞核内DNA强结合的Hoechst染料（参见补充图S2b). 为了理解各向异性相关性的可能起源，我们还模拟了不同的各向异性运动（参见补充图S3)结果表明，各向异性分量可以来自振荡边界或具有各向异性形状的振荡结构。仅仅存在边界（例如核包络）不会对各向异性分量产生影响。
mICS分析显示的细胞内GFP-AR动力学
将mICS应用于GFP-AR动力学，我们不仅看到了各向同性结合，而且还识别了多个细胞位置的各向异性成分(). 这里我们用圆的大小表示扩散程度，用十字表示各向异性分量的主轴。在细胞核内，GFP-AR显示出一个显著的转变，即从Cl-4AS-1处理前没有可检测到的相关性，这表明大多数GFP-AR在添加配体后是扩散性的，到长期一致的相关性。这种AR激动剂诱导的核内结合在其他研究中已有报道19,20,37在细胞质内，GFP-AR在Cl-4AS-1处理后扩散减弱。细胞质中有更多的异质性，我们发现细胞质中存在各向同性和各向异性运动。注意，各向异性分量在延迟时间内显示出一致的振幅，表明在第二个时间尺度上存在稳定的限制。然而，我们没有检测到定向运动（如微管运输），这将通过高斯中心位置的移动来指示。
mICS分析显示细胞内GFP-AR动力学。我们对Cl-4AS-1处理下表达GFP-AR的PC3细胞的图像进行了mICS分析。沿256×32像素图像堆栈应用步长为16像素的32×32像素分析窗口（半分析窗口重叠）。在每个分析窗口，我们用以下符号将τ=1处的动力学特征覆盖到原始图像上：各向同性扩散/结合表示为红色圆圈，其中直径对应于各向同性高斯拟合的半高宽；各向异性受限运动表示为十字，其中高斯长轴和短轴的半高宽对应于黄线的长度。圆/线厚度基于这些组件的相对振幅。对选定位置的时间延迟序列进行了描述，以显示动力学时间刻度。根据Hessian矩阵计算误差线。在细胞核内，GFP-AR表现出从Cl-4AS-1治疗前无可检测到的缓慢运动到长时间持续结合的显著转变。在细胞质内，GFP-AR表现出更多的异质性。注意，各向异性分量在τ上显示出一致的振幅，表明约束在第二时间尺度上是稳定的。
在配体刺激的细胞中，虽然在细胞尺度上很明显存在从细胞质到细胞核的定向AR易位，但核转运的动力学要快得多（报告的转运时间在1–30 ms范围内）38检测需要比50毫秒/帧更短的采集间隔。然而，与配体处理前相比，我们观察到GFP-AR沿核膜显示出强烈的各向异性相关性(). 为了排除这一观察结果仅仅是核运动的结果，我们同时从NLS-RFP中获得了信号，NLS-RFP包含核转运序列并定位在细胞核中，但没有结合结构域。在未经处理和配体处理的细胞中，NLS-RFP没有表现出与GFP-AR相同的显著受限定向运动。
各向异性GFP-AR运动是结构限制和慢动力学的结果。在加入Cl-4AS-1之前，GFP-AR沿核膜没有明显的方向性。经Cl-4AS-1处理后，GFP-AR表现出与核膜平行的强方向性。相反，同时获得的NLS-RFP信号在激动剂治疗前后的细胞中显示出较低的相关性，因为它具有快速扩散的特性。请注意，核膜边界和强度差异并不是观察到的受限各向异性运动的唯一原因，因为NLS-RFP和GFP-AR都显示出不同的细胞质/细胞核分布。
为了测试激动剂治疗后细胞核内GFP-AR的各向异性运动是否可以通过其与结构（DNA）的结合来解释，该结构在mICS检测到的时间尺度上移动，我们同时从GFP-AR、Hoechst（指示DNA位置）和NLS-RFP获取信号(). 追踪任一DNA的几个小组发表了染色质运动39或核小体40,41。报告的运动范围为10–100 ms和100 nm，属于我们的方法可检测的范围（50 ms/帧，100 nm/像素）。明确证明DNA结合是这种效应的起源将使用一种不与DNA结合的AR作为阴性对照。然而，这种AR变异体在细胞质中聚集42因此可能不适合进行实验。相反，我们选择使用赫斯特和NLS-RFP分别作为阳性和阴性对照。GFP-AR和Hoechst在细胞核中均显示点状图案，核仁中不存在，而NLS-RFP则均匀分布于整个细胞核(). 与NLS-RFP相比，Hoechst和GFP-AR的mICS相关图像显示出更强的各向同性相关性，表明存在一个束缚成分(). Hoechst和GFP-AR的各向异性分量虽然不相同，但也具有NLS-RFP中未发现的相关图像形状相似性。由于整体核运动会在所有三个荧光通道中产生相同的各向异性模式，并且受限扩散模型也会影响NLS-RFP，因此该观察结果表明GFP-AR的各向异性成分至少部分是由于其结合的DNA的结构运动。描述了跨核GFP-AR、Hoechst和NLS-RFP的mICS分析的两个示例，GFP-AR和Hoechs特之间的总体相似性较高。
Cl-4AS-1处理后来自GFP-AR、Hoechst和NLS-RFP的各向异性运动的比较。(一)STICS检测到的各向异性相关性可能是由于细胞迁移、受限扩散或结构运动所致。请参见补充图2用于模拟每个场景(b条)在存在激动配体的情况下，GFP-AR与染色体上的某些位置结合，这与在细胞核中扩散的NLS-RFP（Pearson系数=0.13）相比，与Hoechst染色（Pearson's系数=0.33）更相似。(c（c）)同时采集的图像的GFP-AR、Hoechst和NLS-RFP相关性的两个示例。由于配体的存在，GFP-AR和Hoechst在细胞核中表现出相似但不同的相关模式。另一方面，NLS-RFP由于扩散速度快，相关性很弱。(d日)两个跨细胞mICS分析的例子显示GFP-AR和Hoechst染色之间具有更高的动力学相似性。
用多模式动力学模拟AR易位
根据我们对扩散AR、AR结合的观察，以及之前报道的AR微管转运8在细胞质中，考虑到这三种运动模式，我们对AR易位进行了一维蒙特卡罗模拟，特别关注AR在细胞质的分布(). 在这个简化模型中，我们并不打算捕获所有可能的AR分子事件（例如配体结合和二聚），而是关注其运动特性。正如我们在配体刺激之前在PC3细胞中观察到的那样，每个模拟都以空间均匀的细胞质AR分布开始。为了模拟核膜处的易位，我们引入了一个核渗透因子，这是细胞质AR分子在位于核膜处时进入细胞核的每时间步长的概率。模拟的原子核充当单向AR汇。在模拟过程中，我们记录了AR的空间细胞质分布及其在细胞质和核室中的相对比例的变化。我们改变了模拟参数，以评估AR传输模式和核渗透性对AR动力学的影响。我们用于模拟的参数列于补充表1.
用多模式动力学模拟AR易位。(一)根据文献和我们的观察，假设细胞质中存在三种可能的AR动力学模式（扩散、直接运输和结合），我们对AR细胞质到核的易位进行了Monte-Carlo模拟，特别关注AR细胞质随时间的分布和细胞质-核浓度的变化。(b条)从与显示了加入激动剂后AR在细胞质中的分布变化。发件人(c（c）,e（电子）)，我们指定AR到达核膜位置时被转运到核内的恒定概率（核渗透性）。(c、 d日)仅扩散模型和仅直接传输模型均显示AR能够在30分钟内传输到核。值得注意的是，在纯扩散情况下，AR细胞质分布更接近于实际测量中观察到的均匀分布（参见)而在纯转运的情况下，AR在细胞质中形成一个陡峭的梯度，最高强度出现在核膜处，靠近细胞膜的空间显示出AR的缺失(e（电子）)扩散、直接运输和结合以不同比例混合改变AR易位的平均时间。然而，变化斜率保持不变，AR细胞质浓度在开始时下降较快。(（f）)与中所示的实际测量值相比，一个考虑了核渗透性线性增加的模型更接近观察结果，其中AR细胞质部分的减少较慢。请参见方法模拟：AR多模易位有关模拟详细信息和补充表1用于所使用的参数。
为了与模拟结果进行比较，我们使用如所示的相同数据集生成了从核膜到核膜的波形图。在AR易位期间，我们没有观察到明显的朝向细胞核的细胞质GFP-AR强度梯度()，与以前的报告一致33,8。我们的模拟表明，需要扩散运动分量来保持这种空间均匀性。相反，在仅有活性转运的情况下，AR导致了随时间增加的急剧细胞质浓度梯度()在细胞中未观察到。这一比较与我们的RICS测量结果一致，在RICS测量中，弥漫性AR运动持续存在于配体诱导的易位过程中(). 此外，模拟结果表明，无论是细胞质扩散还是单独的活性转运都可能导致核AR易位().
观察细胞质和细胞核的强度动力学显示实验之间存在差异()和恒定核渗透率下的模拟(). 在核渗透性固定的情况下，细胞质中的主动运输、结合和扩散的所有组合都会导致暂时凹陷，在早期时间点细胞质AR会迅速耗尽。相反，在体外实验导致AR浓度变化相对延迟。然后我们模拟了随时间线性增加的不同的核渗透性()，并发现所得凹度与实验结果更具可比性。这些结果表明，AR的核通透性可能不是恒定的，而是在暴露于激动剂配体后逐渐变化。这种延迟的渗透性可能归因于一个多步骤的生物过程，如AR配体结合，然后发生构象变化和与不同结合伙伴的解离/结合，以促进核运输。
讨论
解剖AR动力学带来了混合运动模式、高度空间异质性（细胞质与细胞核）以及激动剂-配体结合的独特反应的挑战。在本研究中，我们在多个时空尺度上实施了不同的成像技术来评估AR细胞内运动，并将其与模拟相结合，以在分子尺度上提供AR易位的动态图像。我们检测到AR的扩散和结合成分的存在，以及在存在激动剂配体的情况下结合和限制运动的增加。我们估计RICS和mICS捕获了大约65%–75%的AR种群，而其余种群在测量时间范围内（约1分钟）相对静止（参见补充图4).
在这篇文章中，我们使用模型系统强调了前列腺癌中多模态AR动力学的存在。我们使用的PC3细胞缺乏内源性AR，来源于转移性神经内分泌癌。因此，将这些结果推广到临床疾病时需要注意。重要的是，使用与前列腺癌不同阶段（例如局限性或雄激素敏感性疾病）相对应的额外细胞系是有保证的。更为复杂的是，即使是广泛使用的AR+前列腺癌细胞株LNCaP也可能有多种AR基因变体，其雄激素反应性对传代数和培养条件敏感43我们测量了GFP-标记的AR而非内源性AR的动力学。虽然已经证明GFP-AR保留AR的基本功能特征，例如激动剂的结合亲和力和转录激活三，GFP-AR和AR之间的动力学可能实际上不同。
除了传统的共焦成像外，本工作中演示的ICS方法还可以应用于研究具有最小扰动的广泛生物系统和常规荧光样品制备。当研究中的标记粒子太暗或太密而无法单独跟踪时，该技术特别有用，并且可以捕获不同性质的运动。我们开发的mICS分析不仅使我们能够更准确地检索各向同性成分，而且还可以破译各向异性成分的生物物理起源。使用共焦显微镜系统，mICS可以实现的时空分辨率由两个主要因素决定：（1）荧光灯亮度和光子收集效率，这决定了像素驻留时间，从而限制了采集速度；（2）空间覆盖和所需的像素分辨率，这决定了需要采集的像素数。展望未来，实现基于摄像头的快速采集和多色采集可能会以更高的时空分辨率，提供AR与不同蜂窝组件交互的更详细视图。
使用多重荧光显微镜分析，Van Royen等。4确定了核内两种类型的AR–DNA结合：非常短暂的相互作用和激素诱导的持久相互作用，特征结合时间为几秒，与我们的mICS结果相当。同样与我们的观察结果类似，布拉柴达等。报告了快速和慢速组件（D=1.8–6.0μm2/s和D=0.05–0.10μm2/s、 维甲酸受体（RAR），一种结构类似的核受体17他们发现，RAR激动剂治疗在将RAR人群转向慢速组分的同时，并没有显著改变快慢组分的活动性17这与我们的RICS数据一致，在RICS数据中，我们显示了配体的存在对扩散系数没有显著影响。
然而，我们没有观察到显性AR微管结合的证据，也没有观察到细胞质中显著的直接转运，尽管以前有报道称AR与动力蛋白相关，并且在配体诱导的AR核易位中AR-dynein相互作用增加8这种差异可以潜在地解释为：（1）与结合和扩散成分相比，经历主动转运的AR的比例可能较小；（2） 微管网络可能不是均匀排列的（如)与单个微管相比，当分析窗口相对较大（3.2μm×3.2μm）时，导致方向性取消；活细胞实验和固定样本/生化方法之间的差异。更高时空分辨率的进一步实验可能揭示AR与微管传输的更多细节。
虽然用动力蛋白抑制剂和紫杉烷治疗都显示出一定程度的AR易位阻滞（参见补充图5，也是Darshan等。8)，我们的结果表明，除了对AR微管转运的影响外，这种阻断可能还涉及其他机制。在达因抑制剂或紫杉醇处理下未显示易位的细胞中，细胞质GFP-AR的强度在空间上保持均匀，在核膜附近没有AR浓度降低的迹象。这进一步表明，除动力蛋白转运外，其他机制也导致了易位的缺乏。如所示考虑到正的核渗透性，仅扩散（尽管是非定向的）就足以进行AR易位。为了改变AR易位在细胞质中普遍扩散的平衡，有必要改变核通透性。一些研究将PCa与细胞核相关蛋白的变化联系起来44,45,46以及针对核转位抑制的新PCa药物正在开发中47对这一对PCa生长和进展至关重要的途径的详细了解将有助于产生新的和需要的新的治疗方法。
材料和方法
细胞培养和试剂
从ATCC中获得PC3、HeLa和LNCaP细胞系。所有产品均保存在RPMI1640（Corning™，目录号10–040）中，并添加10%热灭活GemCellTM公司牛血清（Gemini生物制品，目录号100-500）和青霉素-链霉素（Gemini-Bio-Products，目录号400-109）。细胞在含有5%二氧化碳的加湿培养箱中保持在37°C。在成像之前，将细胞接种在涂有聚-D-赖氨酸（MatTek）的35 mm玻璃底盘上。在成像前一天晚上，将细胞切换到无酚红RPMI（Biochrom，目录号F1275）培养基，并添加木炭：右旋糖酐剥离的FBS（Gemini Bio Products，目录号100-119）和L-谷氨酰胺（Gemini-Bio Products，目录号400-106）。
为了产生PC3-GFP-AR稳定的细胞系，用pEGFP-C1-AR质粒（来自Michael Mancini博士的礼物，Addgene质粒（#28235））转染PC3细胞48使用FuGENE HD转染试剂（Promega）。48小时后使用300μg/ml G418（Gemini，目录号400-113）施加选择性条件，连续2周每48小时更换一次培养基，此时稳定的克隆明显扩张。通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选EGFP阳性细胞，获得表达GFP-AR的细胞群。用200μg/ml G418维持稳定表达GFP-AR的细胞进行阳性选择。PC3 GFP细胞系是使用MISSION生成的®pLKO.1-puro-CMV-涡轮GFP™阳性对照转导颗粒(SHC003伏，Sigma-Aldrich）来转换细胞，然后是FACS。实验前一天，用pEGFP-C1-AR质粒和FuGENE对HeLa细胞进行GFP-AR瞬时转染。
通过向培养皿中添加100 nM SiR-tubulin（螺旋色素）并培养过夜，进行活细胞微管标记。NLS-RFP转染是通过向培养皿中添加15μl CellLight Nucleus-tagRFP BacMam 2.0（生命技术）并培养过夜来完成的。在最终浓度为1μg/ml的成像前30分钟添加Hoechst 33342（Thermo Fisher）。将合成AR激动剂Cl-4AS-1（Tocris）应用于最终浓度为20 nM的细胞；在最终浓度为10 nM的条件下，施用Ciliobrevin A（Tocris）；紫杉醇（赛默飞世尔公司，目录号P3456）的最终浓度为1μM。
活细胞成像
细胞被保存在显微镜台上的一个温度可控的环境室中，CO2水平和湿度。使用安装在蔡司LSM-780倒置共焦显微镜（卡尔蔡司）上的63×1.15 NA浸水物镜获得图像。Hoechst信号在405nm处激发，在407-485nm处采集；GFP信号在488nm处激发，在495-557nm处采集；NLS-tagRFP信号在561 nm处激发，在567–735 nm处收集；SiR-微管蛋白信号在633 nm处激发，在637–753 nm处收集。
根据所需的空间和时间分辨率，采集参数进行了相应的调整：对于细胞级移位，以15到20秒/帧的速度采集了超过100帧的512×512像素。对于RICS数据采集，100至200帧采集128×128个像素，像素大小为80 nm，像素停留时间为6.3μs；连续采集图像。对于mICS数据采集，1000帧采集256×32像素，像素大小为100nm，像素驻留时间为1.27μs；连续采集图像，帧速率为49.6ms。为了比较Ciliobrevin A和紫杉醇的效果，采集了512×512像素（415nm/像素）的3×3分片扫描。
对于FRAP实验，共采集了30张预漂白图像（592ms/帧，256×256像素，177nm/像素），然后是单正方形光漂白（100%ATOF）。光漂白后立即采集80帧图像。按照Day和Schaufele中的描述确定固定分数49.
蛋白质印迹
用10%SDS–PAGE（Bio-Rad，目录号4568034）分离含有20μg蛋白质的细胞裂解物，并转移到PVDF膜（Bio-Rad，目录号1704156）。用抗AR（H-280）的多克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，sc-13062）检测印迹。抗兔IgG（GE Healthcare，目录号NA934V）和鼠IgG的辣根过氧化物酶连接羊抗体（GE Hearthcare（目录号NXA931）用作二级抗体。使用增强化学发光检测信号（Thermo Scientific，目录号32106）。使用ImageJ 1.46r进行量化。
荧光素酶报告基因分析
报告者基因检测是使用由Andrea Koehler和Helmut Klocker善意提供的构建物pGL4.72 ARE2 TATA完成的50，根据制造商的说明使用萤光素酶报告物测定系统（Promega，产品编号E1910）。用100 ng DNA/well以96-well格式转染细胞，并将其保存在含有10%木炭剥离FBS（Gemini Bio-Products，目录号100-119）的无酚培养基中，转染后24小时，然后用20 nM Cl-4AS-1处理额外24小时，再在GloMax中测量荧光素酶活性®96微板光度计（Promega）。
数据分析：共校正
对于像素偏移（x）的每个值，皮尔逊相关系数（r第页)根据Steensel计算等。51
其中R我和G我分别是通道R和通道G的像素i的强度值。R（右）av（平均值）和Gav（平均值）是R的平均值我和G我分别是。我们在x和y方向上执行了从−4到4的像素移位。
数据分析：RICS
执行RICS数据采集和分析的详细步骤如前所述23使用simFCS软件包（加利福尼亚大学欧文分校荧光动力学实验室；网址：网址：http://www.lfd.uci.edu). 简言之，我们首先通过从延时图像中减去10帧的移动平均值来对图像进行时间高通滤波，以消除可能由细胞运动引起的缓慢运动。然后，我们使用以下公式计算每个帧内的强度归一化空间相关性：
在这里我是强度，ξ和ψ分别是x和y方向的空间增量，角括号表示所有像素的平均值。我们平均了所有帧中的这些图像相关性，然后将此平均值拟合到2D扩散模型，以检索扩散系数。RICS模型的公式如下：
此处GRICS公司（ξ，ψ）分为两部分：与分子动力学有关的G（ξ、ψ）和与扫描光学有关的S（ξ和ψ），再加上背景项b.否是焦点体积中的粒子数；γ取决于照明体积的形状；D类扩散系数；τ第页像素驻留时间；τ我行与行之间的时间；δr像素大小；和ω0横梁腰部。
数据分析：mICS
mICS分析概述如所示.我们首先使用Ries方法校正漂白的延时图像等。52，保持图像平均值和方差不变52:
其中f（t我)是t=t时的空间平均强度我.
其次，为了关注运动引起的空间波动，我们使用以下方法去除了时间平均图像：
如Hebert所述等。24，时空图像相关函数定义为
式中ξ和ψ分别是x和y空间增量，角括号表示x和y方向上所有可用空间位置的平均值。T型是时间序列中的图像总数。值C表示由∆t（>0）的滞后时间分隔的所有图像对的平均互相关函数。我们使用包含空间均匀噪声项ε：
哪里
具有
该模型包含一个各向异性项，如果运动实际上是各向同性的，则不需要该项。因此，我们首先确定数据是否符合纯各向同性模型。我们对包含和不包含各向异性项的模型拟合进行了单侧似然比检验。如果似然比检验的p值小于0.05，我们将各向异性分量包含在模型中。否则，我们将运动定义为各向同性。
然后，我们评估了最大似然模型的拟合和相关幅度，以确定相关函数是否具有显著的高斯分量。我们应用了两个标准。首先，我们使用决定系数（R2)作为最佳契合度。模型数据与R拟合2 ≤ 0.1通常没有空间结构，我们认为它们是噪音
.当R2 > 0.1我们继续评估高斯分量的振幅（a1和a2). 只有当模型分量的相应振幅大于10时，我们才显示模型分量（各向同性或各向异性）−4.
我们使用Matlab（MathWorks，R2015a版）编写的自定义软件执行了所有数据分析。该软件可根据要求提供。
Kymography记录仪
从32.5分钟的延时图像中提取强度轮廓（512×512像素，142个时间点，1.58 us像素停留时间，15秒间隔）。Matlab脚本使用函数改进文件提取从细胞核边缘到边缘细胞的强度分布。在不同的时间点上重复操作，可以生成强度曲线作为时间的函数。
模拟：AR多模易位
我们设计了AR细胞质到细胞核易位的一维Monte-Carlo模拟，以更好地理解各种分子动力学和核渗透性的作用。
在时间0时（在没有配体存在的环境中），我们假设所有AR都均匀分布在细胞质中。细胞膜到细胞核的距离设置为50μm。在时间步长等于1秒时，总共模拟了500 AR，持续1800秒。我们假设在细胞质中，在每个时间点AR可以选择扩散，静止（由于可能的结合或动力蛋白不足53)或直接运输。扩散遵循正态分布，平均值设置为0，标准偏差√（2D），其中D是扩散系数。直接输送也遵循正态分布，但根据文献中的估计，平均值等于达因速度，标准偏差=（达因速度）/254,55.
注意，对于扩散，AR有可能朝向或远离原子核，而主动传输是单向的，仅朝向原子核（假设动力蛋白传输）8我们分配了AR处于这三种可能模式的不同概率（表1）。当AR到达细胞核时，有一定的可能性AR被转运到细胞核中（核通透性），否则AR将滞留在细胞质中并继续运动。所有仿真都是在Matlab编程环境中进行的。
