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癌症研究。作者手稿；2017年3月1日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
癌症研究2016年3月1日；76(5): 1031–1043.
2015年12月16日在线发布。 数字对象标识：10.1158/0008-5472.CAN-15-2001
预防性维修识别码：项目经理4775348
美国国立卫生研究院：尼姆斯745548
PMID：26676749

识别诱导头颈癌PD-L1表达的EGFR和IFNγ下游的细胞内和外途径

费尔南多·康查·贝纳文特,1 拉格文德拉·M·斯利瓦斯塔瓦,2 苏米塔·特里维迪,2 于磊,三 乌玛·钱德兰,4 拉贾·西塔拉,5 戈登·弗里曼,6和罗伯特·L·费里斯1,2,7
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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补充资料

摘要

许多癌症类型，包括头颈癌（HNC），表达程序性死亡配体1（PD-L1）。PD-L1及其受体程序性死亡1（PD-1）之间的相互作用抑制激活的T细胞的功能，并导致免疫抑制微环境，但诱导PD-L1表达的刺激没有很好的特征。干扰素γ（IFNγ）和表皮生长因子受体（EGFR）分别利用Janus激酶2（JAK2）作为共同的信号节点来传递肿瘤细胞介导的外源性或内源性信号。在这项研究中，我们研究了这些因子在JAK/STAT通路激活、Th1炎症和HPV状态下上调HNC细胞中PD-L1表达的机制。我们发现野生型、过度表达的EGFR与大量HNC标本中JAK2和PD-L1的表达显著相关。此外，PD-L1的表达是以EGFR-和JAK2/STAT1依赖的方式诱导的，特异性JAK2抑制可阻止肿瘤细胞中PD-L1上调并增强其免疫原性。总之，我们的研究结果表明JAK2/STAT1在EGFR-介导的免疫逃逸中具有新的作用，针对该信号轴的治疗可能有助于阻断在大部分HNC肿瘤中发现的PD-L1上调。

关键词：JAK2、HPV、EGFR、STAT1、PD-L1

简介

癌症免疫编辑提示淋巴细胞成功抑制肿瘤生长(1). 然而，肿瘤细胞免疫逃逸最终可能通过下调HLA I类抗原处理而发生(2)或通过提供抑制信号(三) (4). 程序性死亡-1（PD-1）是一种由肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）表达的免疫检查点受体，它限制活化T淋巴细胞的功能(三,5). 其同源配体，程序性死亡配体-1（PD-L1）在多种癌症中表达(5). 事实上，针对PD-L1/PD-1通路的阻断抗体试验显示了令人鼓舞的结果，肿瘤PD-L1的表达丰富了临床应答者(6——10). HPV的发病率+肿瘤正在迅速增加(11)而且这些肿瘤对肿瘤治疗更敏感，肿瘤治疗可能部分是免疫介导的(12——14). 以前的一份报告表明PD-L1的表达有助于HPV的免疫抵抗+HNC公司(15). 相反，PD-1+CD8（CD8）+具有活化表型的T细胞可能是HPV的良好预后生物标志物+病人(16). 因此，在HNC中诱导PD-L1表达的刺激和信号通路可能允许更有效的治疗方法。

肿瘤细胞中PD-L1的表达可能由两种主要机制调节。首先，一种“外源性”机制，其中由自然杀伤细胞（NK）和CD8驱动的抗肿瘤细胞免疫反应+TIL产生IFNγ，进而诱导肿瘤细胞PD-L1表达。其次，可能存在一种“内在”机制，其中肿瘤细胞内的结构性致癌信号通路导致PD-L1过度表达。在胶质母细胞瘤中，PTEN缺失促进PI3K-AKT介导的PD-L1过度表达(17)而EGFR突变的肺癌细胞与PD-L1过度表达有关(18,19). 与肺癌相比，在HNC环境下，EGFR突变极其罕见，而野生型EGFR在大约80-90%的肿瘤中过度表达(20). 我们假设HNC细胞中参与PD-L1表达的靶向信号分子可能与当前的抗EGFR抗体靶向免疫疗法（如西妥昔单抗）协同作用，西妥昔单抗已知可激活NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）(21). 然而，由于活化的NK细胞和T细胞分泌IFNγ，这是一种已知的PD-L1表达刺激物，因此了解调节PD-L1的复杂信号通路至关重要。由于外源性（IFNγ介导）和内源性（EGFR介导）机制可能协同促进PD-L1上调，我们研究了介导IFNγ和EGFR诱导的肿瘤细胞PD-L1下调的信号通路。这些发现与西妥昔单抗的免疫治疗组合有关，西妥昔单抗可以通过激活NK细胞和CTL阻断EGFR信号传导并刺激IFNγ分泌(21——23).

材料和方法

肿瘤细胞系

人乳头瘤病毒−HNC细胞系（JHU020、JHU022、JHU 029、PCI13）和HPV+（SCC2、SCC47、SCC90、93VU）在IMDM完全培养基（Mediatech、Herndon、VA）中培养。JHU020、JHU022和JHU092006年1月由詹姆斯·罗科博士（俄亥俄州立大学）赠送。通过外植体/培养法从匹兹堡大学治疗的患者中分离出SCC90和PCI13，并通过STTR分析和HLA基因分型进行验证(24,25). SCC2和SCC47是托马斯·凯里博士于2005年12月（密歇根大学）赠送的礼物，93VU是亨宁·比尔博士于2013年10月（德国慕尼黑科技大学）赠送给的礼物。HNC线每6个月测试一次支原体感染。

抗体和治疗

抗PD-L1单克隆抗体（克隆405.9A11）先前经过验证(26)Gordon J.Freeman博士（马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所）使用抗pJAK2（Y1007和Y1008）（英国剑桥Abcam）进行IHC染色。抗PD-L1-PE（BD Pharmingen，加利福尼亚州圣何塞）抗HLA-ABC-FITC mAb（克隆w6/32，E-biosciences，加利福尼亚州圣地亚哥）、IgG1-PE同型对照、pSTAT1-Tyr701-PE、STAT1-PE和STAT3-PE（BD Bioscience，加利福尼亚州圣何塞）、phospho-AKT（Thre308）-PE和初级抗p44/42 MAPK（Erk1/2）和phosphospho-p44/42 MAPK（Erk 1/2）（Thr202/Tyr204）和二级抗兔-PE抗体（Cell Signaling，Danvers，MA）。WB抗体包括兔抗人JAK2、pJAK2（y1007/1008）、AKT总量、pAKT、pERK和小鼠抗人β-actin（Cell signaling，Danvers，MA）。干扰素γ（明尼阿波利斯研发系统）的使用量为10IU/mL(25)由Bristol-Myers Squibb提供，10uM使用。JAK1/3抑制剂（ZM39923）（Tocris bioscience，Bristol，United Kingdom）之前已进行过表征(27,28)并在上午10点使用。沃特曼（Cell Signaling，丹弗斯，马萨诸塞州）在凌晨1点使用。PI3Kα110亚单位抑制剂（BYL-719）用于1uM，MEK1/2抑制剂（PD0325901）用于5uM（Tocris Bioscience，Bristol，UK）。

流式细胞仪分析

用僵尸水染色法测定细胞活力(29)（加州圣地亚哥Biolegend），然后在4℃下与荧光结合抗体以1:10稀释培养15分钟，然后洗涤两次，再悬浮在2%PFA溶液中，直至分析。进行细胞内流式细胞术(30)并使用LSR Fortessa细胞仪（BD Biosciences）和FlowJo版本10软件（阿什兰，OR）进行分析。减去同型对照MFI后，通过归一化计算的中值荧光强度（MFI）折叠变化。

西方印迹法

如前所述进行蛋白质印迹(2)使用指示的抗体。

siRNA敲除

细胞转染如别处所述(2). 转染48h后，细胞孵育±IFNγ（10IU/mL）或EGF（10ng/mL）48h，然后收获并用FC分析。siRNA STAT1:5-CUACGAACAUGACCUAUTT-3（s）和5-AUAGGGUCAUGUUCGUAGGTG-3（as）siRNA STAT3:5-GCCUCAGAUUGACCUAGATT-3（s）and 5-UCUAGGUCAAUUGAGCCT-3（as）and siRNA non-targeting 5-AGUACAGAACGACG Gtt-3 control:。

定量PCR（qPCR）

如前所述进行qPCR(31). PD-L1（Hs01125301_ml）和GUSB（Hs99999908_ml）的PCR探针（用于TaqMan®基因表达检测的应用生物系统）。GUSB被放大为内部控制。使用ΔCT方法计算目标基因与GUSB控制基因的相对表达：相对表达=2−ΔCT，其中ΔCT=CT（目标基因）−CT（GUSB）。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

细胞在37°C下用IFN-γ（10 IU/ml）孵育30分钟，或在37°C下依次用西妥昔单抗（10 ug/ml）孵育30分钟之前，血清饥饿18小时。然后按照前面所述进行ChIP分析(2)使用Ez-ChIP™试剂盒（Millipore）。纯化的DNA用于定量RT-PCR，使用EpiTect ChIP qPCR（Qiagen）SYBR-绿色Master Mix方法，使用PD-L1启动子引物NM_014143.2（-）16Kb。将qPCR扩增数据归一化并分析为输入的%(32)并表示为相对于输入%的相对富集度。

免疫组织化学（IHC）方案

匹兹堡大学IRB#99-069批准使用临床样本，并获得书面知情同意书。将载玻片脱蜡并重新水化。使用Diva retrieval（加利福尼亚州康科德市Biocare Medical）和124°C下的脱泡室进行抗原提取，3分钟，并冷却10分钟。使用TBST冲洗缓冲液（Dako）将载玻片放在Autostainer Plus（加利福尼亚州Carpenteria市Dako市）上，并使用3%H2O2（宾夕法尼亚州匹兹堡市ThermoFisher Scientific）染色5分钟，CAS Block（Invitrogen，Grand Island，NY）10分钟，PD-L1的一级抗体（克隆405.9A11）(33)以及按照指令使用的pJAK2（Y1007-1008）（克隆E132）。第二次由Envision Dual Link+（Dako）聚合物组成，冲洗30分钟，然后使用TBST保持冲洗5分钟。使用的底物为3,3，二氨基联苯胺+（Dako）7分钟，并用苏木精复染。PD-L1和pJAK2染色通过阳性像素计数v9算法（Aperio）进行量化。一位头颈部病理学家对临床患者数据一无所知，他检查了肿瘤切片。分别通过PD-L1或pJAK2的肿瘤染色百分比来确定评分。肿瘤细胞阳性染色<5%的肿瘤视为阴性。

细胞毒性试验

细胞毒性由51如上所述的铬释放试验(34). 肿瘤靶细胞和NK细胞与西妥昔单抗或IgG1同型（10μg/mL）共同孵育4h。包括自发溶血和最大溶血的对照。比溶解度=（实验溶解度−自发溶解度）/（实验溶解度−最大溶解度”）×100。

TCGA数据检索和分析

从UCSC癌症基因组浏览器下载查询基因的RNAseq数据(https://genome-cancer.ucsc.edu). 实验测量了500个HNC样本的HNC基因表达谱(35). 用于量化RNAseq表达数据的RSEM单元如前所述(36). 使用Pearson r检验计算TCGA数据的相关性，并使用GraphPad PRISM软件v6绘制线性回归曲线拟合图。

IPA Ingenuity途径软件分析

软件通过匹兹堡大学许可证访问。利用IPA Ingenuity中可用的Path Explorer工具将EGFR和IFNγ途径与PD-L1表达联系起来。

结果

HPV中PD-L1蛋白表达较高+HNC肿瘤标本

肿瘤标本（n=134）的IHC染色显示，59.7%的HNC患者在肿瘤细胞表面表达可检测的PD-L1，这是由>5%的阳性肿瘤细胞确定的(图1A). 此外，当按HPV状态隔离时（n=127，63 HPV−和64 HPV+)，我们注意到PD-L1在HPV中的表达更频繁+样本（分别为70%和43.3%，图1B)HPV中%PD-L1的表达也显著高于+肿瘤(图1C). 有趣的是，PD-L1在细胞膜上的表达比细胞质中的表达更强烈，并且在微环境中不均匀表达，通常形成PD-L1簇+肿瘤细胞簇外围密度较高(图1D和E). 研究PD-L1上调的刺激和途径在体外，我们分析了一组HPV+和HPV−PD-L1表达的HNC株，其表达是可变的(图1F)与IHC的患者肿瘤相似。

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HPV中PD-L1蛋白表达较高+肿瘤标本

答：。HNC肿瘤标本中PD-L1蛋白的表达（IHC，n=134）。当肿瘤染色阈值高于5%时，认为PD-L1阳性。59.7%的肿瘤为PD-L1+.B。HPV中PD-L1的表达−和HPV+肿瘤标本采用与A.70%HPV相同的标准+HPV为43.3%−样本为PD-L1+ C类PD-L1百分比+HPV肿瘤面积−和HPV+试样。虚线代表5%的肿瘤阳性，实线代表中位数。（Mann-Whitney，**P<0.001）。D。代表性高强度，100%PD-L1+，HPV+肿瘤。E.公司。代表性低强度，50%PD-L1+人乳头瘤病毒−肿瘤。左边的插图表示右边的放大倍数（20倍）。F、。HNSCC细胞表达不同水平的PD-L1。

人乳头瘤病毒+肿瘤标本显示较高的Th1型表达谱

然后，我们分析了大量HNC样本中PD-L1的表达，这些样本的基因表达TCGA库数据可用(35). 由于PD-L1的表达与CD8和IFNγ的表达有关(15,23)，我们研究了HPV的Th1 mRNA表达谱+与人乳头瘤病毒−试样。利用热图绘制了88份HNC样本的汇总数据，并根据HPV状态进行了分离(图2A，红色方框表示HPV的高表达+肿瘤）。Th1型表达谱（PD-1、CD8A、CD8B、IFNG和JAK2）在HPV中显著升高+比HPV−肿瘤(图2B)表明活化的免疫效应细胞容易浸润HPV+肿瘤，这可能是重要的PD-L1诱导，因为这个来源的干扰素γ。重要的是，HPV中JAK2的表达（而不是JAK1）也较高+肿瘤(图2B). 因此，JAK2与Th1基因型和PD-L1表达相关，尤其是在HPV中+肿瘤。

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人乳头瘤病毒+标本显示Th1型RNA表达谱较高，PD-L1的表达与JAK2、EGFR和IFNγ的表达相关，与HPV状态无关

A类表达为PD-L1、PD-1、CD8A、CD8B、IFNγ、JAK2、JAK1、STAT1、EGFR、PIK3CA、TORC1、4EBP1和MAPK1（66 HPV）的RSEM单位的RNAseq表达热图−和22 HPV+)TCGA数据库(35)，红色方框强调HPV中Th1基因的高表达+标本和HPV中较高的EGFR表达−对应物（颜色代码，黄色比黑色高10倍，绿松石色比黑色低10倍）。B。人乳头瘤病毒+肿瘤标本显示Th1型表达谱（PD-1、CD8A、IFNγ和JAK2）显著升高。EGFR在HPV中的表达显著增高−肿瘤标本（Mann-Whitney*P<0.05，**P<0.001）。C、。在两种HPV中PD-L1表达与JAK2显著相关−和HPV+样本（皮尔逊r和线性回归曲线拟合，***p<0.0001）。D。HNC标本相邻切片和匹配区域的PD-L1和pJAK2 IHC染色。PD-L1（顶面板）主要在肿瘤细胞膜上表达。Phospho-JAK2（底图）显示出强烈的核染色，偶尔出现弱-中度细胞质染色。PD-L1阳性肿瘤岛对磷酸化JAK2也呈弥漫性强阳性（23个样本中有3个具有代表性）E.公司。PD-L1 mRNA表达与两种HPV的EGFR显著相关−和HPV+样本（皮尔逊r和线性回归曲线拟合*P<0.05**P<0.001）。F、。无论HPV状态如何，PD-L1 mRNA表达均与IFNγ显著相关（Pearson r和线性回归曲线拟合***P<0.0001）。66人乳头瘤病毒−和22 HPV+从TCGA数据库中收集的肿瘤标本。

PD-L1的表达与JAK2、EGFR、IFNγ和Th1的表达相关，而与HPV状态无关

考虑到JAK2是EGFR和IFNγ途径下游的一个常见信号分子，我们发现PD-L1和JAK2 mRNA表达高度相关（n=500），并且在按HPV状态分离队列时持续存在(图2C). 为了进一步评估JAK2和PD-L1之间的关系体内在蛋白质水平上，我们使用HNC样本相邻切片的IHC测定磷酸化JAK2和PD-L1（n=23）。与我们之前的发现相一致，PD-L1主要在肿瘤细胞膜上表达，而磷酸化JAK2表现出强烈的核染色，偶尔出现弱-中度细胞质染色。PD-L1阳性肿瘤岛对磷酸化JAK2呈强阳性(图2D). 此外，我们还发现EGFR和PD-L1表达之间存在显著相关性，而PD-L1在HPV中的表达较弱−肿瘤(图2E). 同样，无论HPV状态如何，PD-L1表达与Th1型表达谱（IFNγ、CD8A和PD-1）高度相关(图2F和表1A). 此外，EGFR与CD8或JAK2的相关性仅在HPV中显著+肿瘤，因为它们的表达水平高于HPV−肿瘤。然而，这一发现并不排除JAK2对HPV PD-L1表达也很重要的事实−考虑到无论HPV状态如何，它们都是高度相关的肿瘤。

表1

A.HPV阴性和HPV阳性肿瘤中PD-L1、EGFR和IFNG与Th1谱的相关性

无论HPV状态如何，PD-L1 mRNA表达与PD-1和CD8A mRNA表达高度相关。此外，EGFR在HPV中的表达与CD8A或JAK2的表达相关+但不是HPV−肿瘤。正如预期的那样，无论HPV状态如何，IFNγ都与CD8A和JAK2表现出强烈的相关性B.HPV阴性和阳性肿瘤中PD-L1和STAT3、PI3K和MAPK通路成分的相关性。无论HPV状态如何，PD-L1 mRNA表达与STAT3、PI3K和MAPK通路均无明显相关性。（TCGA，66人乳头瘤病毒−和22 HPV+肿瘤标本）。

A类
相关性（XY）HPV阴性HPV阳性
皮尔逊rP值皮尔逊rP值
PD-L1与PD-10.5937<0.0001（***）0.7538< 0.0001 (***)
PD-L1与CD8A0.5157< 0.0001 (***)0.8363< 0.0001 (***)
EGFR与CD8A−0.013680.4566（纳秒）0.47050.0136 (*)
EGFR与JAK20.18530.0681（纳秒）0.4380.0207 (*)
干扰素γvs CD8A0.7747< 0.0001 (***)0.9396< 0.0001 (***)
干扰素γvs JAK20.7264< 0.0001 (***)0.7391< 0.0001 (***)
B类
相关性（XY）HPV阴性HPV阳性
皮尔逊rP值皮尔逊rP值
PD-L1与STAT30.25030.0427（*）0.38670.0754（纳秒）
PD-L1与AKT1−0.20480.099（纳秒）0.005680.98（纳秒）
PD-L1与TORC1−0.27430.0258 (*)−0.1973年0.3787（纳秒）
PD-L1与4EBP1−0.24880.044 (*)−0.22060.3238（纳秒）
PD-L1与MAPK1−0.16590.1832（纳秒）0.078620.728（纳秒）

STAT1而非STAT3、PIK3CA或MAPK1在肿瘤组织中的表达较高，并且与PD-L1、EGFR和IFNγ密切相关，无论HPV状态如何

由于PD-L1表达与肿瘤微环境中Th1型表达谱密切相关，我们假设PD-L1可能依赖于STAT1激活，STAT1是一种已知的Th1型转录因子。事实上，当使用先前验证的转录因子结合预测（MATCH）和途径探索（Ingenuity IPA）软件时，STAT1成为与PD-L1启动子区域结合的高度预测转录因子之一，与EGFR和IFNγ途径共同存在(37). 鉴于之前的报告显示STAT3、PI3K和MAPK可能参与其他肿瘤类型中PD-L1的表达，我们将其纳入我们的研究。我们汇总了46个配对肿瘤和匹配正常粘膜标本的RNAseq数据，发现肿瘤组织中STAT1（而非STAT3、PIK3CA或MAPK1）显著上调(图3A). 此外，STAT1的表达与TCGA中PD-L1的表达高度相关（n=500），当按HPV状态分离时，这种表达被保留(图3B). 与TCGA数据一致，我们发现STAT1蛋白在HNC肿瘤组织中广泛表达，PD-L1阳性肿瘤岛对总STAT1染色也呈强阳性(图3C，圆圈区域突出显示共同本地化，100X插图）。有趣的是，STAT1的表达也与EGFR的表达密切相关(图3D). 正如所料，STAT1肿瘤的表达也与IFNγ的表达密切相关(图3E). 值得注意的是，STAT3和PI3K通路成分（AKT1、TORC1或4EBP1）与HPV中的PD-L1没有相关性+肿瘤，仅在HPV中较弱−HNC公司。同样，在这两个队列中，MAPK1与PD-L1的表达均不相关(表1B). 总之，我们的研究结果表明，JAK2/STAT1通路可能是HNC肿瘤中EGFR-和IFNγ介导的PD-L1表达的重要共同介导物，而与HPV状态无关。

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STAT1，而不是STAT3、PI3KCA或MAPK1在肿瘤组织中的表达较高，并且与PD-L1、EGFR和IFNγ的表达密切相关，而与HPV状态无关

答：。与匹配的对照粘膜相比，肿瘤标本中STAT1而非STAT3、PIK3CA或MAPK1的表达显著增高（TCGA、46例HNC肿瘤标本和匹配的对照，Mann-Whitney，***P<0.0001）。B。STAT1表达与PD-L1无复发性HPV状态密切相关（Pearson r和线性回归曲线拟合，**P<0.001***P<0.0001）C、。PD-L1型+肿瘤岛在HNC标本中STAT1蛋白也呈强阳性。HNC样本的代表性切片共染PD-L1（棕色色原）和STAT1（红色色原）。插图表示肿瘤区域放大，黄色圆圈表示共定位。D–E型STAT1的表达与EGFR和IFNγ的表达相关，而与HPV状态无关。（皮尔逊r和线性回归曲线拟合，**P<0.001***P<0.0001）。

IFNγ介导的PD-L1上调依赖JAK2/STAT1

基于我们的TCGA分析和之前在mRNA水平将IFNγ与PD-L1表达联系起来的报道，我们研究了IFNγ上调PD-L1的信号通路在体外的确，一组HPV+和HPV−干扰素γ治疗后HNC细胞株上调PD-L1表达(图4A). 鉴于IFNγ介导的PD-L1上调与PI3K途径激活有关(17)我们测试了沃特曼（pan-PI3K抑制剂）或BYL-719（PI3Kα110亚单位特异性抑制剂）是否可以阻止IFNγ介导的PD-L1上调。在这些抑制剂有效阻止AKT磷酸化的条件下，PI3K途径抑制不会诱导PD-L1下调(补充图1 A–D). 由于IFNγ信号通过JAK1和JAK2传递，我们使用了一种临床级别的选择性JAK2抑制剂BMS-911345（JAK2i(38)，发现在所有测试的细胞系中，在mRNA和蛋白质水平上，IFNγ介导的PD-L1上调被消除(图4A和4B,补充图1E–F). 有趣的是，特异性JAK1/3抑制（JAK1/3i）并未显示出IFNγ介导的PD-L1蛋白表达的显著下调(图4C). 然后我们使用IFNα，它通过JAK1和TYK2发出信号，但不通过JAK2。干扰素α治疗没有上调PD-L1的表达(图4D)但在所有测试的细胞系中仍然诱导pSTAT1上调，尽管程度低于IFNγ。此外，JAK2抑制并不影响HLA-ABC的上调(补充图2A-B)这表明干扰素α诱导的pSTAT1与PD-L1启动子结合的动力学因HLA-ABC而异。

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IFNγ介导的PD-L1上调依赖JAK2/STAT1

答：。JAK2抑制剂BMS-911345（JAK2i）可消除IFNγ介导的PD-L1蛋白上调，而与HPV状态无关。用溶媒对照、JAK2i（10uM）、IFNγ（10IU/mL）或两者联合处理HNSCC细胞48h，收获后用流式细胞术（FC）检测PD-L1的表达B。JAK2i消除IFNγ介导的PD-L1 mRNA上调。细胞株用载体对照、IFNγ（10IU/mL）或JAK2i（10uM）或两者联合处理24h；通过qPCR测定PD-L1 mRNA，并以载体折叠变化的形式表达C、。JAK1/3抑制不能阻止IFNγ介导的PD-L1上调。处理细胞株JAK1/3i（10uM）、JAK2i（10uM）、IFNγ（10IU/mL）或联合处理48h，通过FC测定PD-L1的表达（方差分析，ns=不显著）D类IFNα没有上调PD-L1的表达。细胞与干扰素α（1000 IU/mL）、JAK2i（10uM）及两者的组合培养48小时。干扰素γ（10IU/mL）用作阳性对照。PD-L1表达由FC测定（ANOVA，ns=不显著）。E.公司。当STAT1而非STAT3沉默时，IFNγ介导的PD-L1上调被废除。用STAT1 siRNA、STAT3 siRNA或对照siRNA（10nM）培养细胞48小时，然后不处理或用IFNγ（10IU/mL）处理额外48小时，收获细胞，并用FC测定PD-L1的表达。F、。经干扰素γ处理后，pSTAT1而非pSTAT3与PD-L1启动子区域结合，如ChIP分析所示。细胞未经处理或用IFNγ（10IU/mL）或IFNγ+西妥昔单抗处理30分钟，ChIP测定显示PD-L1启动子中pSTAT1富集（黑条）。PD-L1富集度以输入DNA的百分比计算（参考材料和方法）（方差分析*P<0.05，**P<0.01）。G。西妥昔单抗介导的EGFR阻断下调IFNγ介导的PD-L1 mRNA上调。细胞系用载体、IFNγ（10IU/mL）、西妥昔单抗（10ug/mL）或IFNγ+西妥昔单抗处理24 h，收获后用qPCR定量mRNA，并以载体的倍数变化表示（方差分析，*P<0.05，***P<0.0001）H。西妥昔单抗介导的EGFR阻断下调IFNγ介导的PD-L1蛋白上调。将细胞系作为G处理48小时，然后通过FC测定PD-L1蛋白的表达（ANOVA，***P<0.0001）

为了确定IFNγ介导的PD-L1上调是否仅依赖于STAT1，我们使用siRNA技术沉默每个转录因子（敲除效率为80-90%，补充图3A). STAT1而非STAT3敲除可显著损害IFNγ介导的PD-L1上调(图4E). 此外，染色质免疫沉淀（ChIP）分析表明，干扰素γ治疗后，pSTAT1而非pSTAT3与PD-L1启动子区域结合(图4F). 有趣的是，西妥昔单抗介导的EGFR阻断分别在mRNA和蛋白质水平下调了IFNγ诱导的pSTAT1与PD-L1启动子的结合，并显著下调IFNγ介导的PD-L1上调。(图4G–H和补充图3B).

EGFR-介导的PD-L1上调依赖于JAK2/STAT1

由于EGFR与TCGA标本中PD-L1的表达密切相关，先前的报告显示EGFR激活突变可诱导肺癌中PD-Ll的表达(18)我们假设野生型EGFR在80–90%的HNC中过度表达，可能促进PD-L1上调。所研究的8个HNC品系中，有7个系的EGF处理诱导PD-L1蛋白上调，但上调幅度小于IFNγ诱导的上调幅度(图5A). 在mRNA水平上也可以观察到这种影响(图5B). 虽然EGFR激活了多种下游通路，包括PI3K、MAPK和JAK/STAT通路，但TCGA分析显示PD-L1与PIK3CA或MAPK1之间的相关性较弱(表1A). 然而，观察到与JAK2和STAT1的相关性很强(图2C和​和3B3B公司分别）。鉴于JAK2是IFNγ和EGFR通路的共同信号分子，我们研究了EGF介导的PD-L1上调是否依赖JAK2和/或STAT1。事实上，JAK2下调了HNC细胞系中PD-L1的基础表达，但JAK1/3的抑制没有下调(图5C). 此外，EGF诱导JAK2磷酸化(补充图4A)并上调PD-L1的基础表达(图5D). 此外，特异性JAK2而非JAK1/3的抑制阻止了EGF诱导的PD-L1上调(图5D和补充图4B). 有趣的是，EGF介导的PD-L1上调在EGFR表达较高的细胞系中较高（JHU029和JHU02 vs 93VU和SCC90）。同样，JAK2抑制更强烈地下调EGFR中基础和EGF介导的PD-L1表达高的细胞系(图5D、JHU022和JHU019）。

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EGFR-介导的PD-L1上调依赖于JAK2/STAT1

答：。EGF上调PD-L1蛋白表达。细胞未经处理或用EGF（10ng/mL）处理48h，IFNγ（10IU/mL）作为阳性对照。收集细胞，通过FC测定PD-L1表面表达B。EGF治疗上调PD-L1 mRNA表达。细胞按照A类在24小时内，通过qPCR测定收获物和PD-L1 mRNA的表达，并表示为与载体对照组相比的折叠变化（ANOVA，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。C、。JAK2而不是JAK1/3抑制下调PD-L1的基线表达。用JAK1/3抑制剂（JAK1/3i，10uM）或JAK2i（10uM。D。JAK2而非JAK1/3抑制可阻止EGF介导的PD-L1上调。用JAK1/3i（10uM）或JAK2i（10u M）处理细胞48小时，通过FC测定PD-L1表达水平（ANOVA，ns=无显著性**P<0.001**P<000001）。E.公司。EGF诱导pSTAT1y701上调。用EGF（10ng/mL）处理细胞1、2、4、24和48小时，收获、固定和渗透，用ICF测定pSTAT1y701或总STAT1的表达。F、。STAT1沉默可防止EGF诱导的PD-L1上调。用对照siRNA或STAT1 siRNA（10nM）和EGF（10ng/mL）处理细胞48h，收获细胞并用FC测定PD-L1表达（ANOVA，***P<0.001）。

由于EGFR激活PI3K和MAPK通路，我们测试这些是否介导了EGFR刺激后PD-L1的上调。我们发现沃特曼介导的PI3K抑制和MEK1/2介导的MAPK抑制都不能阻止EGF诱导的PD-L1上调(补充图4C-D). 然而，这些抑制剂分别有效地抑制了AKT和ERK磷酸化(补充图4E–F). 根据这一结果以及EGFR和STAT1之间的正相关性，我们假设EGF可能激活了JAK2介导的STAT1磷酸化。事实上，EGF诱导的STAT1（酪氨酸701）磷酸化在24小时达到最大峰值，而总STAT1水平保持稳定(图5E). 此外，siRNA-靶向STAT1敲除可有效抑制总STAT1水平(补充图5)以及显著消除EGF诱导的PD-L1上调(图5F).

JAK2抑制抑制肿瘤PD-L1表达并增强西妥昔单抗介导的NK细胞毒性

因为JAK2在EGFR（内源性）和IFNγ（外源性）途径的PD-L1上调中起着关键作用在体外，我们测试了JAK2抑制是否通过抗体依赖性细胞杀伤（ADCC）增强了NK介导的杀伤(21)针对PD-L1+HNC细胞。当NK细胞与HNC靶细胞和西妥昔单抗共同培养时，活化的NK细胞以IFNγ依赖的方式上调肿瘤PD-L1的表达(图6A，打开的条形图）。作为对照，在NK细胞上不与CD16结合的EGFR特异性单抗panitumumab（IgG2同型）没有诱导PD-L1上调，很可能是因为缺乏NK细胞活化和IFNγ分泌(39). 重要的是，当用JAK2抑制剂（左面板，封闭栏）预处理HNC细胞时，IFNγ介导的PD-L1上调被阻止，而用JAK1/3特异性抑制剂（右面板，封闭条）则无法阻止。因此，我们验证了这样一种假设，即在PD-L1表达降低的情况下，NK细胞将更有效地裂解JAK2抑制剂预处理的肿瘤细胞。事实上，NK细胞表现出约25%的比用JAK2抑制剂预处理的HNC细胞高的特异性溶解(图6B). 总的来说，这些结果证实JAK2是HNC肿瘤细胞PD-L1表达的重要调节器，其抑制作用可逆转PD-L1介导的肿瘤细胞从西妥昔单抗介导的ADCC中逃逸。

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抑制JAK2可防止NK介导的PD-L1对肿瘤细胞的上调并增强西妥昔单抗介导的NK细胞的细胞毒性

答：。当与西妥昔单抗激活的NK细胞以IFNγ依赖性方式共同培养时，肿瘤细胞PD-L1表达上调（左面板，开条）。JAK2i对肿瘤靶点的预处理阻止了PD-L1的上调（左侧面板，封闭栏）。相反，在相同条件下（右侧面板，封闭栏），JAK1/3抑制并不能阻止PD-L1上调。将肿瘤靶细胞在单独的培养基或JAK2i（10uM）补充的培养基中孵育48小时，然后单独或在西妥昔单抗（10ug/mL）、帕尼妥单抗（10ug/mL）或西妥昔单抗+抗IFNγ阻断抗体（50ug/mL）存在下与NK细胞共培养24小时，收获并通过FC检测PD-L1在肿瘤细胞上的表达。具有相似结果的两个独立实验的数据表示B。较高的NK-cetuximab介导的JAK2i预处理靶点的裂解（闭合黑条，5:1和20:1效应器：靶点比率）。用JAK2i（10uM）预处理肿瘤细胞48小时，然后用51Cr与纯化NK细胞+培养基、IgG1对照组（10ug/mL）或西妥昔单抗（10ug/mL）共培养4h（ANOVA，*P<0.05，***P<0.0001）。

讨论

鉴于HPV感染在HNC病因学中的重要性，一些研究试图将PD-L1表达与HPV状态相关联。最近的报告显示HPV中PD-L1的表达更高+肿瘤(15,16,40,41). Lyford-Pike等人(15)在一个小群体（n=9）HPV中，PD-L1阳性率仅为29%−HNC患者，而Malm等人报告80%(41)这使得PD-L1表达与HPV状态的相关性备受争议。在我们134名患者的大型系列中，大多数（约60%）是PD-L1+最重要的是，我们发现了HPV+肿瘤PD-L1阳性率更高（70%，n=64），PD-L1的面积和强度明显更高。重要的是，之前的一项研究表明，PD-L1与CD3在56%的肿瘤中共同定位，而44%的肿瘤呈弥漫型，没有发现共同定位(41)提出了PD-L1在这些肿瘤中是如何调节的问题。因此，PD-L1的表达可能是由分泌IFNγ的TIL“外源性”诱导的（其中发现了共定位），尤其是在HPV中+肿瘤和通过内源性EGFR信号“内在”诱导的肿瘤（没有发现共定位），特别是在HPV中−肿瘤。

自HPV以来+肿瘤表现出较高的PD-L1蛋白表达体内为了扩展先前报道的结果，我们利用了TCGA中可用的RNAseq表达数据（n=500）。人乳头瘤病毒+肿瘤中Th1型蛋白的表达显著增高，包括CD8A、PD-1、IFNG和JAK2(图2A-B). 我们的发现与之前的报告一致，其中HPV+HNC肿瘤显示更多PD-1+CD8（CD8）+T细胞浸润，与良好的临床结果相关(16). 这些数据表明PD-1表达细胞具有生物学相关性，并可能在HPV中发挥关键作用+疾病和PD-L1诱导。重要的是，我们报道了PD-L1的表达与JAK2在mRNA（TCGA）和蛋白质水平上的表达高度相关体内（IHC）。此外，我们发现pJAK2染色在HPV中显著升高+比HPV−样本（未显示数据）。有趣的是，无论HPV状态如何，PD-L1也与Th1型密切相关，这表明PD-L1/PD-1轴在HPV阴性和阳性肿瘤中都代表着免疫逃逸的重要机制，例如HPV−肿瘤可能更多地依赖于肿瘤固有的（EGFR-driven）PD-L1表达，而HPV+肿瘤更多地依赖肿瘤外源性IFNγ介导的Th1样反应。

与配对的自体正常粘膜相比，在HNC肿瘤中STAT1上调，并且无论HPV状态如何，STAT1都与PD-L1表达显著相关。值得注意的是，其他信号通路的成分，如PI3K和MAPK，之前与其他类型癌症中PD-L1表达相关(17,28)与HPV中PD-L1的表达没有显著相关性+肿瘤或诱导PD-L1。事实上，HNC独特的生物学、突变景观和主要的信号通路可能解释PD-L1表达的差异。最近有报道称，PTEN功能丧失突变在胶质母细胞瘤中很常见（31.9%的标本，TCGA数据）(42). 此外，胶质母细胞瘤细胞系PTEN缺失/PI3K激活后PD-L1上调，提示胶质瘤可能更依赖于此信号通路(17). 同样，在非小细胞肺癌患者中，PD-L1蛋白在EGFR/RAS/MAPK途径激活突变后上调。事实上，非小细胞肺癌中HRAS和EGFR突变的频率远高于HNC（2-5%）(43,44). 因此，突变型EGFR可能比野生型EGFR诱导更强的MAPK通路激活。另一方面，PTEN或PIK3CA突变在HNC中相当罕见，分别为7%和8%(44). 因此，在HNC的背景下，内在致癌信号主要依赖于过度表达的野生型EGFR刺激，并表现为这类癌症的独特特征，其中JAK/STAT3致癌途径最具特征性(45). 重要的是，在我们的研究中，STAT3与HPV中PD-L1的表达没有显著相关性+肿瘤与HPV相关性较弱−肿瘤，很可能是因为EGFR在这些肿瘤中的表达高于HPV+个。

与其他类型的癌症一样，IFNγ在我们的研究中测试的所有HNC细胞系中诱导PD-L1上调，但其上调并不像胶质瘤、淋巴瘤或肺癌那样依赖PI3K(28,46,47). 我们相信，这是首次报道，特异性JAK2抑制完全消除了IFNγ介导的PD-L1在mRNA和蛋白质水平的上调。有趣的是，不通过JAK2发出信号的IFNα没有上调PD-L1的表达，证实了JAK2上调PD-Ll的特定作用。同样，我们应该强调IFNα不仅诱导STAT1磷酸化，还诱导STAT2，并在转录因子组装级联中与IRF9复合，形成ISGF3转录复合物，其中IRF9是主要的DNA结合域(48). 相反，IFNγ主要诱导pSTAT1二聚体的形成，直接结合到目标基因的启动子区域，这解释了为什么IFNα虽然仍上调pSTAT1，但可能不会上调PD-L1。此外，并证实了我们的TCGA发现，在体外敲除实验表明，STAT1而非STAT3介导IFNγ诱导的PD-L1上调，ChIP分析进一步支持了这一点，提供了额外的证据，即pSTAT1但非pSTAT3在IFNγ治疗后30分钟就与PD-L1启动子区域结合。我们的研究结果补充了之前的一篇关于肺癌的报告，该报告显示IFNγ治疗后IRF-1与PD-L1启动子结合(49). 有趣的是，我们是第一个报道西妥昔单抗介导的EGFR阻断显著下调IFNγ诱导的PD-L1表达，表明IFNγ和EGFR通路在通过STAT1调节调节PD-L1的表达中存在相互干扰。

EGFR和PD-L1在HPV中表现出较高的相关性+与CD8A、JAK2和STAT1相关性较高的肿瘤。与EGFR在HPV中的高表达相比，PD-L1的表达可能更依赖EGFR/JAK2通路激活的强度，这可能解释了这些与直觉相反的结果−肿瘤，其可诱导STAT1激活增加和PD-L1表达的诱导。或者，浸润肿瘤微环境的其他免疫细胞也可能表达PD-L1，例如树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞以及肿瘤相关的成纤维细胞和基质细胞(26,50). 鉴于EGFR的表达主要在肿瘤细胞上，且TCGA RNAseq值代表未分化肿瘤，因此PD-L1在这些细胞上的表达可能混淆了与EGFR的相关性强度。

因此，JAK2/STAT1信号传导是由IFNγ和EGFR途径驱动的PD-L1转录的主要常见调节因子。由于EGFR突变在HNC中非常罕见（2%）(43)EGFR通路过度激活，而非激活突变，对HNC PD-L1上调更为重要。我们是第一个报道野生型EGFR途径在mRNA和蛋白质水平诱导PD-L1上调，特异性JAK2抑制显著下调基线，EGF诱导PD-Ll上调，虽然不是完全上调，但表明其他替代途径也有助于HNC中PD-L1的表达。值得注意的是，JAK2抑制更有效地下调EGFR中基础和EGF介导的PD-L1表达高的表达细胞系（JHU029和JHU02）。此外，我们首次报道EGFR刺激诱导STAT1磷酸化，进而介导PD-L1上调，因为其沉默完全消除了这种效应，EGFR和JAK2抑制可能协同下调“固有”PD-L1表达。然而，最重要的是推测JAK2抑制与同时阻断“外源性”IFNγ介导的PD-L1上调的潜在附加益处，这似乎在HPV中更为重要+肿瘤。联合使用JAK2抑制和西妥昔单抗介导的EGFR阻断的另一个好处是，JAK2介导的肿瘤细胞PD-L1表达下调将最终增强PD-1的效应物特性+NK细胞在肿瘤微环境中被激活。事实上，我们发现肿瘤靶点中JAK2的抑制在很大程度上增强了西妥昔单抗介导的ADCC，从而逆转了PD-L1介导的肿瘤细胞免疫逃逸对NK细胞的杀伤。此外，JAK2抑制可能通过增强PD-1的ADCC与靶向PD-1和/或CTLA-4的单克隆抗体协同作用+CTL4号机组+淋巴或髓系抑制免疫渗入肿瘤微环境并降低PD-L1表达。

补充材料

1

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2

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致谢

财务支持：国家卫生研究所拨款R01 DE19727、P50 CA097190、CA110249、匹兹堡大学癌症中心支持拨款P30CA047904和P50CA101942（GF）。

脚注

利益冲突：Robert L.Ferris获得了百时美施贵宝（Bristol-Myers Squibb）和AZ/Medimune的研究资助，并曾担任Celgene、默克（Merck）、BMS和AZ-Medimune公司的顾问/顾问委员会成员。Gordon J.Freeman报告称拥有默克、百时美施贵宝、罗氏、EMD Serono、Amplimmune、Boehringer Ingelheim和诺华的所有权（包括专利），以及诺华、罗氏和BMS、礼来和表面肿瘤学的顾问/顾问。

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