脊椎动物细胞动粒及其在有丝分裂中的作用

摘要

在从传统固定细胞上切下的切片的电子显微照片中，脊椎动物的动粒表现为圆盘状结构，可以分化为四个结构域(图1). 厚度为35–40 nm的外板由厚度为15–35 nm的透光电子中心区与与着丝粒异染色质表面相关的不太显眼的内板分开（参考文献。1). 外板由10–20纳米纤维组成的致密但松散组织的网状结构组成，丝状“电晕”材料延伸至距此结构约0.1–0.3微米的位置。动态纺锤体微管（MT）plus-ends的一个子集，称为动粒微管（K-MT），终止于或位于该板块上。动粒含有MT运动蛋白，包括CENP-E和细胞质动力蛋白，参与其附着和运动。它们还包含非运动蛋白，其中至少一些（例如Mad2和Bub1）参与调节中期-后期（M–A）转换(图1).

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图1

描述已报道的动粒蛋白的假定位置和可能功能的图表。姐妹着丝粒位于复制染色体着丝粒区域的对侧，它们之间的着丝粒异染色质富含α-卫星DNA及其结合蛋白CENP-B⁶²和内着丝粒蛋白（INCENP）⁶³这可能与维持姐妹染色单体的凝聚力有关。该区域似乎还含有有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（MCAK）¹⁷，如所示爪蟾主轴形成和维护所需的提取物⁶⁴在常规固定和染色制剂切片的电子显微照片中，动粒区本身似乎由四个结构不同的区域组成。内板与着丝粒异染色质密切相关，并含有CENP-C，其存在是维持功能性动粒所必需的⁶⁵，也许还有MCAK。内外板之间的区域（中间区域）似乎包含3F3/2磷酸表位，该表位被提议通过感应张力来控制中期-后期（M–A）转变⁴⁷，并且MCAK也可能位于该区域。动粒微管（MT）加上ends附着在外板内的不同高度并终止，据报道外板内含有CENP-F²²（也称为丝裂原），CENP-E^18——20，ZW10²³可能还有细胞质动力蛋白及其相关的动力蛋白复合物¹⁶纤维冠从外板延伸，仅在未附着的动粒上可见。它包含CENP-E²⁰，ZW10²³和细胞质动力蛋白（参考文献。16)后者可能参与MT连接和极向力生产。未连接（但未完全连接）的动粒也包含Mad2²⁴和Bub1²⁵已知在调节M–A转换中起重要作用的蛋白质。问号表示蛋白质的位置是通过免疫荧光显微镜推断出来的，而不是通过免疫电子显微镜确定的。

每个脊椎动物动粒都包含多个功能亚单位，它们具有完整的动粒功能分子机制（参考文献。2). 尽管这些单元的结构基础未知，但每个单元都可能定义一个MT结合位点。萌芽酵母动粒与单个MT结合，但在后期，姐妹动粒没有在纺锤赤道上对齐，它们表现出与脊椎动物动粒相似的运动行为^三在脊椎动物中，姐妹动粒的MT-结合能力相似，并与直径有关，尽管直径在基因组的染色体之间可能有所不同，但与染色体大小的相关性很弱⁴在大多数生物体中，动粒直径在0.1–0.5μm之间，结合10–45 MT¹.

这篇文章的重点是动粒在脊椎动物细胞有丝分裂过程中的作用。我们讨论了它们如何将染色体连接到纺锤体上，以及它们如何控制染色体定位和后期的开始。我们还审查了有关这些主题的新信息，包括它们的结构和组成如何随着K-MT的形成而变化，并强调了需要额外工作的领域。

动粒将姐妹染色单体附着在纺锤体的相反两极

在纺锤体形成过程中，染色体上的一个动粒附着在一个纺锤体极上并朝向（即面向）一个纺锤体极，而另一个则附着在相反的极上并指向相反的极(图2). 这种“双极性”的附着和取向对于两个染色单体在随后的后期忠实分离至关重要。

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图2

纺锤结构和染色体行为。脊椎动物细胞中的有丝分裂纺锤体包括两个重叠的极性微管（MT）阵列，其中一些已经从中心体释放，所有这些微管的“正”（+）端位于远端，负端位于极点附近。这张图说明了脊椎动物细胞染色体在有丝分裂期间经历的典型事件序列。最初，染色体上的一个动粒附着在单个MT（a）的表面上，并迅速向极地滑动（长箭头）。在这种向极地运动过程中，现在单方向染色体上附着的动粒获得额外的MT，这些MT终止于外板（b）。然后，它开始围绕极点和纺锤赤道之间的位置在向极点和远离极点的运动状态（短双箭头）之间振荡。当该染色体上未附着的动粒遇到从远端生长的MT时，染色体会在一个称为聚集（c）的过程中移动到纺锤形赤道。由于聚集，染色体在纺锤形赤道附近采用了一个平均位置，围绕该位置振荡，随着时间的推移，姐妹动粒获得了相似数量的MT（d）。在后期，染色单体分离（e），尽管每个染色单体上的单个动粒仍然表现出一种改良的方向不稳定行为，但每个动粒都向各自的纺锤极净运动。未连接的动粒（红色标签）对参与附着和运动的蛋白质，如CENP-E和细胞质动力蛋白/动力蛋白，以及参与控制中期-后期转换的检查点的Mad2、Bub1和3F3/2表位进行了强烈染色。经许可，修改自参考。5.

染色体获得双极附着和取向的步骤是已知的(图2; 在参考文献中进行了审查。5). 当定义主轴极的两个径向MT阵列分离时，它们远离极的MT plus-end以动态不稳定的方式增长和缩短。这为动粒附着提供了一种有效的“搜索和捕获”机制⁶当MT的壁或生长端与动粒接触时发生⁷(图2a). 然而，由于这种机制的随机性，姐妹动粒很少同时附着。相反，在核膜破裂期间，最靠近并面对极的一个通常首先附着，并且，正如它所做的那样，染色体向接触MT的负端发起极向运动。这种运动使动粒朝向极，其速度（25–55μm min⁻¹; 裁判。7)可以接近产生的在体外MT减去末端定向运动细胞质动力蛋白。随着现在的单取向染色体向两极移动，其附着的动粒遇到并结合更多的MT plus ends，并将其捆绑成动粒纤维（K纤维；图2b). 在此过程中，染色体的极向速度减慢至1.5–2.5μm min⁻¹序列切片分析表明，在其姊妹染色体附着且染色体移到纺锤形赤道之前，单取向染色体上附着的动粒不会获得其完整的K-MT补体⁸原因尚不清楚，但似乎与紧张局势无关⁹稳定昆虫精母细胞中K-MT的附着¹⁰然而，这可能是由于这样一个事实，即尽管MT的密度在两极附近最高，但大多数MT加en位于远离动粒的纺锤形赤道附近(图2)¹¹.

最终，从远端极生长的MT与单取向染色体上未附着的动粒接触，并开始其K纤维的形成(图2c). 这种双指向染色体并导致一个称为集合的过程，使其在纺锤形赤道上对齐(图2d). 在纺锤体形成的早期阶段，姐妹动粒有时附着在同一个极上，或者一个动粒可以附着在两个极上¹²这些错误定向是不稳定的，通常在后期之前通过未知机制进行纠正。一种假设是，定向不良动粒上的MT不稳定，因为其末端经历异常张力或机械应力^10,12.

值得注意的是，K-MT缩短和生长，因为动粒在动粒外板内通过MT亚基的缺失和添加而向极点移动和远离极点(图3)和K-MT无需频繁分离¹³虽然许多MT的负端从中心体释放¹¹，那些与动粒相关联的极地MT似乎与极地保持着更稳定的连接¹⁴因此，K-MT的半衰期（5–9分钟）远大于带有自由脉冲发动机的锭子MT的半衰期（0.3–1分钟）¹⁵.

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图3

附着的动粒在恒速极点运动状态和中性状态之间突然切换，这允许以恒定速度远离极点。这两种运动或活性状态都与相对固定的动粒微管（K-MT）的正末端相关。附着的动粒以1.5–2.5μm min的速度向极地移动⁻¹在这段时间里，它拉扯其相关的MT，从而将着丝粒区域从其静止长度（a）拉伸。极向运动的力可能涉及位于动粒日冕或外板（参见图1)以及MT plus-ends上末端微管蛋白亚基的分离，这可能在这个过程中展开。随着K-MT plus-ends的缩短，这些电机还可以调节速度并保持MT–动粒连接。一旦动粒上的张力（拉伸）达到临界水平，和/或当动粒用完产生极向力的关键部件时，它就会切换到中性状态（b），从而使其能够远离极。这种远离极的运动与K-MT的伸长有关，并且是允许的。在单向染色体上，它可能由与近端纺锤体极相关的MT产生的顶射力驱动，将染色体及其臂推离极。在双向染色体上，远离极点的运动被认为是由近端顶射力和相反的姐妹动粒向极点的移动驱动的。在远离极点的运动过程中，K-MT随着GTP-微管蛋白亚基在动粒内生长的plus端添加到GTP-细管蛋白的稳定帽中而伸长。在上限之下，GTP在MT晶格中水解为GDP。远离极点的运动减少了着丝粒上的张力（拉伸）。主动MT+定向发动机和/或未知附着分子的组合可能会保持对MT生长端的附着，并调节远离磁极的运动速度。缩写：OP，动粒外板；IP，动粒内板。

我们开始了解动粒是如何以动态方式与MT plus-ends结合并保持连接的。这些过程可能涉及几个MT马达和辅助蛋白^*包括细胞质动力蛋白及其动力蛋白结合复合物（参考文献。16)以及运动蛋白相关蛋白MCAK¹⁷和CENP-E^18——20其中两个（动力蛋白和CENP-E）位于日冕和/或外板中(图1)并且似乎形成了由电晕马达和非马达蛋白组成的“天线复合体”，用于捕获极性MT plus ends并将其插入外板的结合位点。动态蛋白50-kDa亚基的过度表达¹⁶或将抗肌动蛋白抗体微量注射到脊椎动物细胞中²¹，抑制染色体聚集，但不一定是动粒附着。然而，由于在这些条件下无法形成正常的双极纺锤体，并且由于染色体行为尚未被跟踪体内动力蛋白在脊椎动物动粒功能中的作用尚不明确。迄今为止，该马达参与动粒附着的最佳证据来自四膜虫（S.Lee、J.C.Wisniewski和D.J.Asai，公共图书馆）。当编码细胞质动力蛋白的基因被敲除出该生物体时，微核中的染色体无法附着到核内有丝分裂器上，因此，当纺锤体在B后期伸长时，会沿着纺锤体随机扩散。当脊椎动物细胞中的CENP-E功能因抗体注射或过度表达突变蛋白而受损时，染色体至少会与纺锤体形成单极连接¹⁸然而，即使主轴看起来是正常形成的，但双向定向以及因此的会聚经常受到抑制。MCAK的作用¹⁷和已知的动粒相关非运动蛋白（例如CENP-F²²，ZW10²³)尚不清楚，但它们可能具有重要的结构或调节功能，以确保适当的染色体双向定向。

阐明动粒附着过程中发生的分子变化对于理解这些细胞器如何实现其各种功能至关重要。我们知道，随着动粒与MT结合，外板的直径减小，其日冕变得不那么明显¹在此期间，内板似乎在着丝粒异染色质的表面上形成（或变得更加明显）。当附着的动粒获得更多的MT时，冠层相关的动力蛋白–dynactin、CENP-E和ZW10的浓度似乎降低并重新分配到K纤维中^16,20,23如下文所述，随着K-MT形成，运动浓度的这些变化可能会使双向染色体聚集偏向纺锤形赤道。此外，参与调节M–A转换的其他动粒蛋白的浓度随着附着而降低^24,25这些蛋白质的活性和浓度如何与那些负责附着和运动的蛋白质相关尚待确定。

动粒为极性染色体运动产生大部分力

现在几乎可以肯定的是，动粒为染色体向极运动产生了大部分力。高（25–55μm min⁻¹)附着动粒的极向速度⁷这意味着在这一运动中，快速动粒相关的MT减去末端定向运动，而这种运动，即细胞质动力蛋白，在有丝分裂期间存在于动粒上。据报道，CENP-E是一种快速MT减端向电机²⁶，但是，当在细菌中表达时，该分子的运动结构域表现出缓慢的（2-4μm分钟⁻¹)MT加发动机定向运动¹⁹因此，尽管CENP-E对正常动粒功能显然是必要的¹⁸鉴于相互矛盾的数据，其作用尚不明确。

初始附着后，动粒极向速度减慢至1.5–2.5μm min⁻¹光活化研究表明，微管蛋白亚基持续添加到动粒内的K-MT plus-ends中，同时从固定在两极的负端移除¹³虽然这种沿着K纤维的极向MT“通量”对脊椎动物体细胞的动粒施加持续的极向力²⁷，其速率仅占向极地移动的动粒的25%。另75%的向极运动力产生于动粒，它将染色体“拉”向其K-MT的负端。在向极运动期间，K-MT通过在动粒处解体而缩短(图3a; 参考文献中审查。28). 当动粒向两极移动时，传递给染色体的拉力取决于动粒伸展其下着丝粒的程度(图3a). 然而，无论极向力的大小或着丝粒对拉伸的阻力如何，动粒的极向速度保持不变（参考文献。29).

我们仍然不完全理解动粒是如何产生它们在向极力中所占的份额，或者它们的运动速度是如何被控制的。虽然细胞质动力蛋白在细胞的粘附和向极运动中起着重要作用四膜虫染色体（S.Lee、J.C.Wisniewski和D.J.Asai，pers.common.），酵母中的染色体分离不需要染色体分离（主要由中心纺锤体伸长引起）^三,30目前，也没有直接证据表明细胞质动力蛋白在脊椎动物产生动粒向极运动的力中至关重要。中断CENP-E功能的观察结果不会影响动粒运动，也不会影响向极点和远离极点的运动速度¹⁸，表明该分子在极向力产生中也不是必需的。然而，如果任何与动粒相关的MT马达被其他多余的力产生机制所掩盖，那么它在驱动染色体运动中的作用可能很难确定。潜在候选基因包括未知的动粒相关蛋白和/或其他机制，如K-MT分解²⁸或K纤维内的弹性组件³¹.

与动粒产生的极向拉力相反，离开极的动粒不会对PtK1细胞的染色体施加推力³²在蝾螈细胞中很少⁹相反，当不处于向极地运动状态时，动粒处于中性状态(图3b)这使得他们能够在伸长的K-MT末端从附着的杆上被拖走³²远离极点的运动细胞以恒定的速度移动（同样，1.5–2.5μm min⁻¹)即使它们的相关染色体臂用微针从极点高度伸展²⁹因此，就向极地运动而言，远离极地的运动速度是可以调节的，并且与作用在动粒上的力无关。调节运动速率并在K-MT plus-ens伸长时保持其运动的分子尚不清楚。CENP-E可能会扮演其中一个或两个角色，特别是当其最终被确定为MT+定向发动机时体内(图3b).

Kinetochores在极移和中性状态之间切换

当在延时电影中观看时，在发育中的脊椎动物纺锤体上看到的许多单方向染色体表现出向相关极的振荡运动。在这种行为中，这些染色体上唯一附着的动粒在向两极和远离两极的运动周期之间不断自主地进行转换^32,33,35(图2和​和3），三)在这些运动中，K-MT保持相对静止¹³由于动粒不会产生离开极点的运动力（见上文），振荡的这一分量被认为是由于与最近极点相关的弹射力，该弹射力将整个染色体推离极点（见下文）。虽然在一些昆虫精母细胞中没有发现这种振荡行为，但从扁虫到蝾螈的其他精母细胞也发现了这种振荡行为（参考文献。5). 这种“动粒方向不稳定性”的一个显著特征是，向极点和远离极点的运动在速度上是相似的，除了在集合期间，在持续时间上也是相似的^32,33切换通常会突然发生（在6秒内），这意味着该机制会诱导所有K-MT脉冲在缩短（极点）或增长（远离极点）阶段之间快速变化。脊椎动物动粒的多个亚单位之间如何协调这种转换，从而使动粒作为单个单位向极地移动并远离极地，这是一个尚未解决的重要问题。

在双向定位之后，姐妹动粒在整个聚集期、中期甚至后期的初始阶段可以继续表现出方向不稳定的行为（参考文献。5). 与单取向染色体一样，双取向染色体上远离其极点的动粒似乎被近端极射力推离极点。然而，在双向染色体上，也可以通过其姊妹动粒的向极运动将其从其相关极拉出。

未来的一个重要问题是如何控制切换。时间推移视频³³和激光显微外科³⁴研究表明，在低张力水平下，附着的动粒倾向于向极点移动，而在高张力水平下则转换为中性（并远离极点）。这导致了这样一种观点，即动粒转换只是由动粒上的张力（或动粒-染色体连接处的张力）介导的^33,34然而，动粒转换受张力控制的证据是间接的，其他转换机制也是可能的。当聚集染色体上向极地运动的动粒被激光显微手术突然破坏时，染色体立即停止运动³²。最初离开极点的动粒在进入向极点运动状态之前保持静止（即处于中性）达50秒。因此，如果张力单独控制着动粒的转换，则机制中可能存在大量滞后现象。或者，当张力突然释放时，附着的动粒可以长时间保持静止，这可能意味着它必须在中性阶段度过一段规定的时间，然后才能重新开始向极地运动³²在这个模型中，当向极地运动所需的相关组件耗尽到阈值以下时，动粒切换到中性，然后它可以自由地从极地移开，直到完全“充电”，此时它又切换回向极地移动。耗竭率也可能与极地运动的动粒所经历的张力水平有关。尽管这是推测性的，但这一想法与观察结果一致，即在大多数情况下，随着双向和会聚的染色体从极点移动到纺锤赤道，着丝粒区域至少会经历一次，有时会经历几次振荡³²。如果转换仅仅由向极地移动的动粒上的张力增加来调节，则不会出现这些振荡，因为动粒在到达纺锤赤道之前不应经历额外的张力。这种转换是由两极运动所需的动粒成分的耗竭/再生所控制的观点也可以解释为什么许多双向染色体上的姐妹动粒没有表现出高度协调的行为³².

动粒有助于定位纺锤形赤道上的染色体

假设双向染色体上的每个动粒都可以存在于向极点移动的状态或允许其离开极点的中性状态，那么双向染色体是如何在纺锤形赤道结束的呢？这个古老问题的答案仍然不得而知。我们设想，在每个半纺锤体内产生的力会逐渐阻止染色体向极运动，但不会远离极（参考文献。5). 这个模型背后的想法是，染色体的极地运动受到了抵制，因为它正在进入一个越来越密集的MT阵列，这些MT对它施加越来越强的推力或阻力，使其远离极地（想象一下移动到扫帚的末端！）。事实上，虽然MT和自由MT plus-end的数量在赤道附近最高，但纺锤形MT的密度在两极附近明显最高(图2)^11,35另一个原则是，转换是由张力引起的，和/或当动粒需要对抗高张力水平时，向极地运动所需的关键部件会更快耗尽。在这些条件下，新附着的动粒向两极运动的时间长度会被夸大，因为它在MT高密度区域的对极附近启动这种运动。在初始运动期间，它的张力水平保持低于姊妹动粒的张力水平，因为它正在进入MT密度逐渐降低的区域。

在双向定向过程中，如果附着的动粒的极向力产生电位或极向运动所需因子的浓度最初大于其附着的姐妹动粒的浓度，则附着动粒也会发生极向运动的持续时间过长。有可靠的数据表明，与完全附着的动粒相比，附着动粒确实具有较高的MT运动蛋白浓度（见上文）。很容易设想这样一种特性如何与上述纺锤阻力/动粒张力模型相协调，从而在国会期间偏置姐妹动粒运动的持续时间。

尽管力与脊椎动物纺锤体的极区明显相关，这些极区“推动”染色体远离极和/或阻碍向极运动（参考文献5和35)它们的大小以及它们是如何产生的仍然是个谜。这种力似乎有两个组成部分：基于MT密度对染色体穿透的立体抗性，以及动态纺锤体MT密集排列排除大型物体的趋势（参考文献32和36)，以及染色体臂上的主动推力（综述于参考文献5和35). 后一种成分可能是由染色体上生长的MT末端的影响或由驱动蛋白样MT加上定向运动蛋白（如染色质）产生的³⁷)在染色体表面。然而，没有实验证据表明这些蛋白质参与了纺锤体投射力。此外，至少在脊椎动物中，没有电子显微镜数据表明染色质沿着穿过或横向接触前中期染色体的极性MT明显地从极点伸展开。

Kinetochores控制M–A转换

有丝分裂期间有两个“无返回点”（参考文献。38). 一个是在前期晚期——通过这一点会导致核膜破裂，并承诺进入有丝分裂。另一个是在M–A过渡期，当触发染色单体分离（即后期）和有丝分裂退出（即末期）的途径被激活时。只有一个未附着或弱附着的动粒存在会延迟许多细胞中的M–A转变（参考文献。39). 激光显微外科⁴⁰和微观操作⁴¹实验表明，这种延迟是由负反馈途径介导的&即，未附着或弱附着的动粒产生抑制后期发作的信号。纺锤体形成的持续时间是可变的，动粒开始独立有丝分裂。因此，这个细胞周期检查点并不是为了响应实验干预而突然“激活”的。相反，它似乎是纺锤体形成开始后出现的一种构成机制，抑制触发后期的途径。

我们将控制M–A转换的检查点称为动粒附着检查点⁴²，但也被称为“主轴组件”³⁹，'染色体分布'¹⁴，“有丝分裂”⁴³或者只是“主轴”⁴⁴检查点。我们目前赞成脊椎动物体细胞的动粒附着检查点这一术语，因为一旦承诺进入有丝分裂，动粒附着的某些方面似乎是启动后期之前监测到的唯一事件。尽管抑制纺锤体极的复制/分离、纺锤体形成或纺锤体MT的正常行为不可避免地会导致有丝分裂延迟，但所有这些条件都会影响动粒附着的某些状态。在含有三极或四极纺锤体的细胞中，所有动粒都正确附着，有丝分裂没有延长，这意味着检测纺锤体过多或缺乏双极纺锤对称性的机制不到位⁴⁵.

动粒附着检查点监测微管积聚和/或张力

动粒附着检查点监测的内容尚不清楚，但可能包括K-MT的积累⁴²或动粒与其K-MT和/或染色体之间张力的产生⁴¹这些替代品很难区分，因为MT的获得会对动粒产生张力，从而促进MT的积累¹⁰关于昆虫精母细胞中非天然单价染色体如何通过减数分裂延迟进展的微操作实验清楚地表明，当动粒处于张力下时，抑制信号在某些系统中被消除⁴¹然而，尚不清楚这种张力是通过扭曲动粒/着丝粒复合体中的拉伸或张力敏感酶，还是通过促进K-MT的获得来解除检查点的。当激光显微手术破坏PtK1细胞中最后一个单取向染色体上未附着的动粒时，细胞进入后期⁴⁰(图4a)尽管染色体上剩余的附着着丝点缺乏完整的MT^8,40但（平均）被拉长了⁹紫杉醇处理的中期PtK1细胞在动粒平均被MT饱和但不受张力的条件下，后期也受到抑制（参考文献。44). 然而，基于平均值的结论可能掩盖了一个或多个未被MT饱和的动粒的存在。因此，动粒附着检查点是否监测张力、MT数量或两者都有待解决。

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图4

（a） 在PtK1细胞中，单个单取向染色体上未附着的动粒足以在数小时内抑制后期的发生。然而，激光显微手术破坏了这个未附着的动粒后不久就发生了后期反应⁴⁰因此，未连接的动粒产生“等待后期”信号。（b） 含有两个独立纺锤体的PtK1细胞可以通过融合相邻细胞而产生⁵³在这些细胞中，即使在一个纺锤体上的单取向染色体上有多个独立的动粒，当其所有的动粒都附着时，也不能阻止相邻纺锤体的后期发病。此外，在可变延迟后，该纺锤体的后期诱导具有单定向染色体和独立动粒的纺锤体中的后期。

虽然不清楚动粒是如何将缺乏张力或未填充的MT-连接位点转换为信号抑制后期的，但在这一途径中涉及到几个动粒蛋白。在PtK1细胞和蚱蜢精母细胞中，3F3/2抗体识别许多蛋白质共同的磷酸化表位，标记为未附着但未附着的动粒（参考文献。10). 将该抗体注射到前中期PtK1细胞中不会抑制染色体的中期排列，但会抑制磷酸表位的去磷酸化并延长中期的持续时间。这表明具有3F3/2表位的动粒蛋白参与调节M–A转换⁴⁷然而，3F3/2表位在动粒附着检查点中的作用尚不清楚，因为有报道称，在蝾螈细胞中，3F2/2抗体在纺锤体形成过程中以相似的强度标记所有动粒⁹.

在大多数单元中，当主轴极无法分离或主轴MT的行为受到干扰时，M–A转换延迟。参与该检查点的酵母蛋白包括由摩洛哥迪拉姆,业务部门和MPS1型基因（参考文献。39). 越来越多的证据表明脊椎动物中的Mad和Bub蛋白同源物参与了动粒附着检查点^24,43,44,46，除少数例外⁴⁸当主轴极无法分离或MT行为受到干扰时，保持激活状态。例如，抗体爪蟾（XMAD2）²⁴和人类（hsMAD2）⁴³酵母Mad2蛋白的同源物染色脊椎动物中未附着但未完全附着的动粒。此外，当添加到爪蟾提取物²⁵或电穿孔进入HeLa细胞⁴³，抗Mad2抗体可防止由抑制MT组装引起的有丝分裂阻滞。类似地，将MAD2抗体微量注射到前中期PtK1细胞或中期阻滞的紫杉醇处理细胞中，可快速诱导早熟后期^44,46Bub1p的小鼠同源物也是未附着但未附着的动粒的组成部分，是延迟M–a转变以响应纺锤体解体所必需的²⁵.

检查点机制

未连接的动粒产生的“等待后期”信号会抑制什么事件？进入有丝分裂与CDK1（cdc2）有丝分裂激酶的激活有关。CDK1随后通过其相关细胞周期蛋白B的泛素化和破坏而失活，这与有丝分裂的退出类似。最初，染色单体分离和有丝分裂的退出都被认为是由CDK1失活同时触发的。然而，我们现在知道这些事件是由不同但协调的途径调节的⁴⁹一个导致染色单体分离，这反过来又允许染色体向各自的两极移动。在酵母中，该途径涉及泛素介导的一个或多个蛋白质的降解，这些蛋白质与细胞周期蛋白没有络合，维持姐妹染色单体的凝聚力（例如，参见参考文献。50). 相反，CDK1失活触发了“出口有丝分裂”途径，并导致末期的标志性特征，包括纺锤体解体、染色体解凝聚、核膜重组和胞质分裂。在酵母中，姐妹染色单体的分离先于CDK1的失活⁵¹类似地，在脊椎动物中，不可降解的细胞周期蛋白B的表达抑制有丝分裂的退出，但不抑制染色单体分离，这表明后者是在前者的上游启动的^49,52因此，由未附着的动粒产生的等待-回相信号可能通过抑制染色单体分离途径起作用。

最近在确定等待后期信号的目标所在的位置方面也取得了进展。在融合的PtK1细胞中，一个纺锤体上的多个未附着的动粒不能抑制缺乏未附着动粒的相邻纺锤体的后期发病(图4b)⁵³因此，由未附着或弱附着的动粒产生的等待相位信号的功能目标与纺锤体有关。这个目标是什么？目前，最有吸引力的候选物是大型（20S）组装体，称为环体或后趋复合体（APCs），免疫荧光显微镜显示它们是纺锤体的组成部分（参考文献。54). APC是泛素连接酶，其功能是选择性地靶向蛋白质进行破坏。对裂变酵母的研究表明，染色单体分离需要APC介导的cut2降解（及其芽殖酵母同源物Pds1p–参考文献。50)这种蛋白质，像APC一样，也与纺锤体有关。显然，确定APC活性是如何调节的，对于阐明动粒附着检查点背后的分子事件非常重要，这方面的工作正在加速。酵母的最新数据（参考文献。55)以及哺乳动物组织培养细胞⁵⁶表明APC活性由Mad蛋白和Cdc20p的复合物介导（裂变酵母同源物为slp1；哺乳动物同源物为P55cdc⁵⁶).

在上述细胞融合实验中，成熟纺锤体的后期启动了含有独立动粒的相邻纺锤体中的后期(图4b)⁵³因此，后期是“主导”有丝分裂状态，因为当在纺锤体内局部触发时，它会在全球传播并覆盖与相邻纺锤体相关联的等待-恢复期信号。这个结论导致了几个可测试的预测。一种是，距离太远而无法连接到纺锤体上的染色体不会抑制后期。另一个原因是，当注射到前中期细胞中时，后期细胞质会迅速而过早地触发M–A转换。最后，它表明缺乏独立动粒的纺锤体内APC的局部激活启动了一个链式反应，通过靶向破坏一种自身抑制APC活性的可溶性因子而在全球传播。

关于动粒附着检查点的一些明显矛盾的结果可以归因于一些胚胎受到检查点挑战这一事实。果蝇属例如，胚胎在第14个有丝分裂周期细胞化之前没有检查点⁵⁷类似地，海胆合子中的M–A转变不会因存在大量未连接的动粒而延迟⁵⁸然而，在海胆中（如爪蟾)如果合子核以及所有的动粒都被移除，M–A转换就会延迟（参考文献。58). 在海胆中，去核诱导的细胞周期延迟似乎发生在“有丝分裂”阶段，因为当纺锤体形成受到抑制或纺锤体被切割成两个单极纺锤体时，对照组也会产生类似的延迟（参考文献。58). 总之，这些数据表明纺锤体的形成在没有染色体的海胆合子中不会发生⁵⁹对于M–A过渡的适当时机至关重要。未附着动粒爪蟾胚胎也可能无法产生操作等待后期信号。之所以使用“可操作”一词，是因为存在足够高密度的精子核（即染色体和/或未附着的动粒）确实会阻止诺卡唑治疗和激活爪蟾减数分裂状态下的卵母细胞提取物⁶⁰显然，控制某些合子M–A转变的规则与体细胞不同，这是未来研究的关键领域。

结束语

动粒是包含MT马达和细胞周期调节蛋白的动态复合物，在细胞分裂期间具有三种功能。它们将每个复制的染色体连接到有丝分裂纺锤体的相反两极，帮助将染色体定位在纺锤体上，然后抑制染色单体分离（和后期发病），直到所有染色体都正确连接和定位。动粒不能正确执行这些功能会导致非整倍体细胞的形成，其中包含异常数量的染色体。当这种情况在发育过程中发生时，就会形成以染色体缺失或额外染色体为特征的出生缺陷综合征的镶嵌体。在成人中，非整倍体细胞的发生被认为是细胞转化的主要机制。事实上，上面讨论的在理解动粒附着检查点如何工作方面的进展已经暗示了BUB1（业务单元1）与结直肠肿瘤发生有关的基因⁶¹很可能将来其他类型的癌症或出生缺陷与动粒功能的额外缺陷有关。

致谢

脚注

参与者信息

康利·里德，美国纽约州卫生部沃兹沃斯中心分子医学部，地址：美国纽约州奥尔巴尼市509号邮箱，邮编：12201-0509。

E.D.鲑鱼，生物系，CB 3280-607 Fordham Hall，University of North Carolina，Chapel Hill，NC 27599-3280，USA。

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