c-MYB是ESPL1公司/在中分离BCR-ABL公司-阳性慢性粒细胞白血病

摘要

背景

ESPL1公司/Separase是一种半胱氨酸内肽酶，是染色体分离和中心体复制的关键酶。在有丝分裂后期，它完成了凝集素的蛋白水解裂解，凝集素是一种“胶”多蛋白复合体，负责姐妹染色单体和母子中心粒的凝聚力，是中心体垂直定向的核心结构[1–三]。通过建立准确的染色体分离，适当的分离酶蛋白水解活性的时间和空间激活保证了染色体的保真度[4]。此外，这是半保守中心粒复制的必要前提，因为母子中心粒的分离使中心体的细胞周期相关复制得以实现[5]。否则将导致染色单体过早分离和/或从滞后染色体形成后期桥[6]。此外，Separase的非计划（细胞周期非耦合）激活可导致中心体数量异常增多（即中心体扩增），继而导致有丝分裂纺锤体缺陷[7]。这两种缺陷都会导致出现异常核型（非整倍体），这是大多数晚期人类恶性肿瘤的标志[8–10]。在染色体分离和中心体复制与细胞周期紧密耦合的非恶性细胞中，Separase在中期到后期的过渡中暂时激活[11,12]。分离在翻译和翻译后两个层面上都受到严格的调控。后者包括结合Securin结合、CyclinB1/CDK1特异性丝氨酸残基磷酸化（pSer1126）、自催化裂解和依赖PP2A稳定Separase结合的Securin的多种抑制机制。所有这些机制共同防止细胞内Separase-分子的异位和计划外活化[13–16].

在人类癌症中，西班牙语1/Separase经常过度表达，由此产生的蛋白水解酶活性失调与多余中心体、染色体错位和非整倍体的发生有关[6,9,13,17]。MMTV乳腺中Separase的过度表达-ESPL1公司小鼠模型导致高度非整倍体乳腺癌的发生，其染色体高度不稳定性和侵袭性疾病表型[18]。因此，Separase被确定为一个非整倍体启动子，当其过度表达和过度激活时，可作为癌基因发挥作用，使细胞不仅容易受到染色体错位诱导的非整倍性的影响，还容易受到DNA损伤和与肿瘤发生和疾病进展相关的关键抑癌基因位点的丢失[18–20].

慢性粒细胞白血病（CML）也是如此，这是一种造血干细胞克隆性肿瘤性疾病，由基因组相互易位t（9；22）（q34；q11）引起，导致费城染色体的形成。融合产物BCR-ABL酪氨酸激酶（TK）是CML发病机制中的关键参与者，具有解除TK活性的调节作用。它通过重新编程造血干细胞和早期祖细胞的先前血统承诺来影响各种下游信号通路[21]。BCR-ABL癌蛋白包含细胞行为的多个方面，包括增殖、凋亡、细胞间信号传导和分化，触发异常克隆造血，并推动疾病从慢性期（CP）向完全转化的急变表型（BC）发展[22]。伊马替尼（IM）是一种选择性TK抑制剂（TKI），是目前CML一线治疗药物之一[23,24]。尽管在IM长期治疗下骨髓室中BCR-ABL mRNA水平显著降低，但BCR-ABI表达低且对IM治疗不敏感的残留CML克隆的持续存在使得通过TKI治疗根除疾病的可能性不大[13,25,26]。最近的证据表明，TKI治疗可以抑制CML干细胞中BCR-ABL癌蛋白的激酶活性，而不会影响CML干电池的存活[27,28]。显然，额外的细胞机制可以促进CML干细胞的存活和维持，使这些细胞对TKI具有抵抗力，并最终促进复发[29,30]。大约35%的慢性胰腺炎患者对IM产生耐药性或不耐受，并经常经历克隆进化[31]。克隆进化表示BCR-ABL阳性造血干/祖细胞中克隆分子变化的异质实体，已分别在约30%和80%的加速期（AP）和BC患者中描述[32]。染色体数目改变，统称为非整倍体，涉及额外的衍生22号染色体、17号染色体异常、8号三体，与预后不良有关[33,34].

最近，我们报道了接受长期IM治疗的CML患者获得性染色体畸变、克隆进化和快速疾病进展（到BC的时间）的增加与各自的Separase蛋白水解活性增强相关在体外模型[35]。从机制上讲，这与BCR-ABL依赖的调节反馈机制有关，该机制在IM诱导b3a2-BCR-ABL融合型CML细胞系中Separase表达降低后，翻译后刺激Separase-蛋白水解活性[35]。到目前为止，尚不清楚BCR-ABL阳性细胞中Separase表达的IM依赖性调节可能涉及哪些潜在的转录或翻译机制。

已知转录因子c-MYB在BCR-ABL依赖性白血病发生中起重要作用。BCR-ABL增强c-MYB的表达[36–38]。C-MYB是一种75 KDa核蛋白和亮氨酸拉链转录因子，由原癌基因编码c-MYB公司在正常髓系祖细胞的增殖、存活和分化中起关键作用[39]。有条件淘汰c-MYB公司成人造血干细胞中的表达由于增殖受损和加速分化而导致自我更新能力丧失[40]。另一方面c-MYB公司在髓系和红系细胞系中，已经证明可以阻断分化并防止成熟相关的生长停滞[41]。异常（增强）c-MYB公司已在多种人类恶性肿瘤中发现表达，包括T细胞白血病和急慢性髓细胞白血病[42]。此外，已经报道了影响人类白血病中c-MYB活性的各种遗传损伤，如染色体易位、基因重复和截断[39,43,44]。然而，在CML细胞中c-MYB公司据报道，该基因是完整的，但蛋白质水平通常会增加，部分原因是通过BCR-ABL调节的PI-3K/Akt/GSKIIIß依赖性途径增强了蛋白质稳定性[36]。这种改变的调节机制被认为可以解释为什么白血病原始细胞似乎比正常细胞更依赖高c-MYB表达水平[45]。ChIP-Seq实验对c-MYB的功能研究表明，c-MYB作为造血主调节器发挥作用[46]。它直接与793个基因附近或内部结合，从而影响2300多个基因，这些基因构成了正常和白血病干/祖细胞和髓系发育的基因特征。尽管c-MYB通常被认为是一种反式激活因子，但它也能够通过正转录和负转录调节直接抑制许多靶基因，这些靶基因在骨髓生成和白血病发生中起着重要作用[47]。例如，c-MYB调节CD34、c-Kit、c-Myc、Flt-3和Bcl-2都对造血细胞的增殖和存活起着重要作用[38]。此外，c-MYB直接调节CyclinB1的表达，并有助于控制G2/M细胞周期相[48,49]从而直接控制Separase的关键翻译后抑制剂之一[13,14].

在本研究中，我们开始研究c-MYB在调节ESPL1公司/CML中的分离酶表达。我们报告称，c-MYB与位于ESPL1公司启动子，并作为ESPL1公司/分离酶表达如c-MYB公司-定向siRNA沉默。此外，IM治疗导致c-MYB和ESPL1公司/分离CML细胞系和原代细胞中的酶表达水平。

结果

为了寻找能够解释IM相关的Separase蛋白水平下调的转录机制，我们分析了c-MYB表达、Separase和IM治疗之间的条件背景。确认并扩展了之前发表的工作，我们在四个人类细胞系上进行了细胞培养实验[13,35]。其中，U937细胞是白血病但BCR-ABL阴性细胞的模型。所有细胞系均按我们之前的研究中所用的治疗剂量IM（1至5μM）进行治疗[13,50–52]。根据关于IM的剂量依赖性效应和时间动力学的广泛研究数据，我们对白血病衍生的p210BCR-ABL阳性细胞（LAMA-84和K562）应用较低的IM剂量（范围：1至2.5μM），而对p210BCR-ABL阴性细胞（U937，5μM）则应用较低IM剂量[53,54]。IM剂量高于2.5μM的CML细胞株处理24小时以上的时间阻碍了收集足够的活细胞用于Western blot分析（数据未显示）。

IM治疗下c-MYB和ESPL1表达水平的协同降低

用IM治疗剂量治疗CML细胞株LAMA-84和K562 24小时后，c-MYB和西班牙语1/如典型的Western blot复合图像（图1，表1). 应该强调的是，弱处理方案（24小时≤2.5μM IM）仍能使CrkL磷酸化（图1，下部面板）。因此，与相应的未处理细胞相比，LAMA-84（−25.7±9.6%）和K562（−37.1±9.6%ESPL1公司转录水平分别为−90±3.3%和−25.0±9.7%。有人可能会争辩说，观察到的下降可能是由于细胞周期中IM相关的变化。然而，对受试细胞的FACS分析显示，G2/M细胞比例和凋亡细胞分数（<12%）均无差异，这可以阐明c-MYB和ESPL1公司/分离表达水平（比较图3亿参考文献中[13]). 用IM处理BCR-ABL阴性对照细胞（U937）后，c-MYB蛋白和ESPL1公司/分离表达水平（表1，图1).

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图1

分析c-MYB公司和ESPL1公司LAMA-84的转录水平、c-MYB和Separase蛋白水平(一)，K562(b)和BCR-ABL阴性对照细胞（U937）(c（c）)IM治疗后。按照表中的说明进行治疗（剂量、周期）1液位变化（Δ-值，以%表示）是通过与相应的未处理电池进行比较计算得出的。上部面板。转录水平用qRT-PCR分析，蛋白质水平用Western blot免疫染色密度法分析。下面板显示了具有代表性的Western blot图像。在所有qRT-PCR实验中，家政基因格斯（β-葡萄糖醛酸酶）作为内标物。在Western blot免疫染色实验中，肌动蛋白被用作负荷控制和参考参数。密度测定数据来自至少三次重复的实验，如表所示1.P值在相应列的上方给出。缩写：ns，不重要；nd，未确定

表1

百分比变化（Δ值是平均值之间的差异）c-MYB公司和ESPL1公司/与相应的未处理细胞相比，IM处理下的分离酶转录和蛋白质水平

细胞系、剂量和疗程	c-MYB公司转录水平一	c-MYB蛋白水平b	西班牙语1转录水平一	分离酶蛋白水平b
LAMA-84，2.5μM IM，24小时	−88.8 ± 4.4,对 < 0.0001	−25.7±9.6，对 = 0.0233	−90.3 ± 3.3,对 < 0.0001	−75.8 ± 16.8,对 = 0.0064
K562，1μM IM，24小时	−82.4 ± 4.4,对 < 0.0001	−37.1 ± 9.6,对 = 0.0082	−25.0 ± 9.7,对 = 0.0328	−53.1 ± 4.4,对 = 0.0015
U937，5μM IM，48小时	−9.1 ± 2.9,对 = 0.0363	+9.8±10.2，对 = 0.3942	−8.1 ± 9.5,对 = 0.4198	−10.5 ± 11.2,对 = 0.3775

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^一Δ-值[%]由至少三次qRT-PCR实验计算得出，并归一化为看家基因格斯

^bΔ-值[%]来自至少三次的Western blot免疫染色实验。所有蛋白质值均归一化为肌动蛋白作为负荷控制

缩写:d日天，小时小时，感应电动机伊马替尼；+增加，−减少

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图3

之后的分离酶表达c-MYB公司在BV-173和LAMA-84细胞中通过RNAi沉默。BV-173（面板一)和LAMA-84电池（面板b)用阴性对照siRNA（nc）和c-MYB公司-特异性siRNA（siRNA）。C-MYB公司转录水平通过qRT-PCR（左栏）测量。管家基因格斯（β-葡萄糖醛酸酶）作为内标物。C-MYB和Separase对蛋白质水平的调节在转染后48 h通过定量Western blot免疫染色实验进行测定（分别为中柱和右柱）。相应的代表性Western blot图像显示在A和B的最右侧面板中。肌动蛋白用作Western blot免疫染色的负荷控制。所有密度测定数据均来自至少三次重复的实验

配对临床样本时获得了类似的结果(n个 = 5） 在IM治疗之前（诊断时）和治疗期间，对来自同一CML患者的每一对患者进行比较监测c-MYB公司和ESPL1公司转录水平（图2). 两名女性和三名男性患者，均患有b3a2BCR-ABL公司分析融合类型。中位年龄为58岁（范围为47至78岁）。在IM治疗下实现MMR后，从同一患者的第二个样本诊断到取样的平均时间为3.6年（范围为2至6.5年）。这些实验表明c-MYB和ESPL1公司/IM治疗后的分离表达在体外和体内.

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图2

对比分析c-MYB公司和ESPL1公司CML患者配对cDNA样本中的转录水平(n个 = 5） 在IM治疗之前和之下。百分比变化（Δ-值是平均值之间的差异）与成对样本中的表达水平变化相对应，每对样本来自同一患者在不同时间点（诊断时的样本（IM治疗前）与IM治疗下的主要分子反应（MMR）后的样本）。所有转录水平均归一化为格斯并表示三次qRT-PCR分析的平均值

c-MYB与位于ESPL1公司发起人

这个ESPL1公司该启动子具有两个激素反应元件和两个TP53结合位点，位于预测转录起始位点（TSS）上游12777和16059个碱基[20]。有关详细信息，请访问人类基因组浏览器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene？cmd=Retrieve&dopt=Graphics&list_uids=9700)并在的53662083（+股）位置找到TSS{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NC_000012.11”，“term_id”：“224589803”，“term_text”：“NC_000012.111”}}NC_000012.11号染色体12参考GRCh37.913初级装配。Champion ChIP转录因子搜索门户基于SABiosciences的专有数据库DECODE（DNA元素的解密），用于识别推测的c-MYB结合位点Espl1号机组发起人（有关更多信息，请参阅http://www.sabiosciences.com/chipqpcrsearch.php？app=TFBS). 在TSS上游发现了一个假设的c-MYB结合位点15623个碱基（53646460-53646470），因此位于两个TP53位点之间（见图4a类). 为了确定假定的c-MYB结合位点ESPL1公司启动子实际上可以结合c-MYB蛋白，我们进行了电泳迁移率变化分析（EMSA）。从指数生长的BV-173细胞制备的天然核提取物与FITC-标记的双链寡核苷酸孵育（图4b个通道1）具有c-MYB结合位点ESPL1公司发起人。如图所示4b个左图，将核提取物添加到FITC-标记的寡核苷酸（通道2）中导致寡核苷酸/蛋白质复合物的形成，并延缓电泳迁移（移位）。在孵育混合物中添加100倍摩尔过量的未标记c-MYB结合位点寡核苷酸，成功地与移位信号的形成竞争（通道3）。为了证实c-MYB蛋白结合，在变性条件下对天然琼脂糖凝胶进行印迹，然后用抗c-MYB抗体进行免疫染色（右侧面板）。确认了c-MYB对换档信号（车道2）的贡献。此外，未标记的竞争对手寡核苷酸（第3条通道）作为移位信号出现，也证实了未标记竞争对手DNA对FITC信号（左侧面板，第3条路径）的特定废除。第二条和较低的谱带可能是由于至少一些天然寡聚物/c-MYB复合物在添加了超过100倍的未标记竞争物后的电泳迁移率发生改变。为了证明体内c-MYB蛋白与位于ESPL1公司我们对BV-173细胞进行了ChIP启动子实验。如图所示4厘米当使用c-MYB特异性IgG抗体进行染色质免疫沉淀时，与非特异性Ig G抗体对照相比，观察到ESPL1启动子相关的靶DNA显著富集。总之，我们的在体外和体内数据表明c-MYB直接与ESPL1公司启动子和正向调节ESPL1公司/分离表达。

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图4

使用合成物的电泳迁移率变化分析（EMSA）ESPL1公司启动子衍生的c-MYB结合位点探针和染色质免疫沉淀（ChIP）。一描绘ESPL1公司分离酶启动子和预测调控DNA基序的位置（图中未按比例绘制）（Pati 2008）。箭头显示预测的转录起始位点（TSS）。缩写：TATA，TATA盒子；孕酮反应元件；雌激素反应元件；p53、p53结合元件；c-MYB，预测c-MYB结合元件。数字表示相对于TSS的上游距离。bFITC-标记的双链DNA寡核苷酸对应于推测的c-MYB结合位点ESPL1公司启动子与天然BV-173核提取物孵育。DNA/蛋白质复合物在0.5%TBE 1.0%天然LE/GTG琼脂糖凝胶上溶解。左侧面板（色调反转）显示了印迹前凝胶的FITC-相关荧光信号，右侧面板显示了相应的抗c-MYB蛋白印迹免疫染色。这些通道代表：通道1，DNA靶点（FITC-标记的寡核苷酸），无核提取物；第二道，DNA靶核提取；通道3，以核提取物和100倍摩尔过量的类似未标记寡核苷酸作为结合竞争物的DNA靶向。c（c）BV-173细胞的ChIP分析。用qRT-PCR扩增抗c-MYB IgG和非结合对照IgG免疫沉淀的DNA片段。结果表示为输入百分比（平均值）。ChIP结果来自至少三次qRT-PCR测量

讨论

寻找可能解释先前观察到的CML中与IM相关的Separase蛋白水平下调的转录机制[13]接下来是翻译后Separase蛋白水解活性的过度激活，我们分析了c-MYB表达、Separase和IM治疗之间的条件关联。我们发现转录因子c-MYB是Separase表达的直接阳性调节因子，已知其在正常髓系祖细胞的增殖、存活和分化中起关键作用。具体而言，我们通过EMSA（图4b个)以及c-MYB与位于ESPL1公司发起人。事实上，在所有测试的CML细胞系（K562、LAMA-84、BV-173）和CML患者的原代细胞中，c-MYB和ESPL1公司/分离酶表达水平与治疗（IM）和沉默（siRNA）条件无关（图1,​,22和​和3）三)观察到。这表明ESPL1公司启动子受转录因子c-MYB的转录控制，这与Kohmura及其同事先前的研究结果一致，他们发现用IM孵育后K562细胞中c-MYBmRNA水平下调[55].

我们的结果进一步与先前的研究一致，即p210BCR-ABL作为c-MYB表达的增强剂发挥作用，并且在BCR-ABL-依赖性白血病发生中发挥重要作用，因为白血病母细胞似乎比正常祖细胞更依赖高水平的c-MYB蛋白[37,45]。此外，c-MYB促进中心粒复制，当突变时，可以导致中心体扩增，如小鼠和果蝇模型系统所示[56,57]。先前的微阵列数据表明c-MYB是与CML进展相关的调控网络的一部分，包括克隆进化和遗传不稳定性[58,59].

c-MYB对ESPL1公司/分离酶的表达很好地解释了Patel和Gordon的观察结果，他们发现慢性和急变期CML细胞中的分离酶表达水平与正常CD34+细胞相比异常高。然后推测BCR-ABL表达可能上调ESPL1公司/分离并影响中心体畸变的发生[60].

我们的数据首次证明了BCR-ABL、c-MYB和西班牙语1/对BCR-ABL如何触发CML中心体-中心体周期和细胞周期之间的错位，从而导致克隆进化和基因组不稳定性进行分离并给出合理的机制解释。IM的治疗性给药使c-MYB蛋白水平“正常化”，如LAMA-84和K562细胞所示（图1)-通过减缓c-MYB公司或通过PI-3 K/AKT途径拮抗BCR-ABL诱导的增强的c-MYB蛋白稳定性[36,55]。IM治疗后c-MYB蛋白水平的预期下降也与Flamant及其同事的数据一致，他们证明该药物导致调节性microRNAs（如miR-150）的表达快速增加，miR-150是c-MYB蛋白质表达的强负调控因子[61,62].

结论

总之，我们的数据表明ESPL1公司/分离酶是c-MYB的调节靶点，c-MYB的表达受IM治疗的调节。因此，已知c-MYB是BCR-ABL依赖性造血祖细胞转化和白血病发生所必需的，也可能影响Separase相关的蛋白水解事件，如染色体分离和中心粒复制，其有序过程对维持中心体和基因组稳定性至关重要。

方法

致谢

缩写

脚注

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