硬化水凝胶用于研究肌成纤维细胞激活过程中肝星状细胞机械转导的动力学
,1 ,2 ,1 ,2 ,1 ,1,三 ,2和a、,1
史蒂文·卡利亚里
1宾夕法尼亚大学生物工程系,费城,PA 19104,美国
玛丽娜·佩雷佩柳克
2宾夕法尼亚大学医学系,费城,宾夕法尼亚19104,美国
布莱恩·科斯格罗夫
1宾夕法尼亚大学生物工程系,费城,PA 19104,美国
谢农·蔡(Shannon J.Tsai)
2宾夕法尼亚大学医学系,费城,PA 19104,美国
李吉云
1宾夕法尼亚大学生物工程系,费城,PA 19104,美国
罗伯特·莫克
1宾夕法尼亚大学生物工程系,费城,PA 19104,美国
三宾夕法尼亚大学矫形外科,费城,PA 19104,美国。
丽贝卡·G·威尔斯
2宾夕法尼亚大学医学系,费城,PA 19104,美国
杰森·伯迪克
1宾夕法尼亚大学生物工程系,费城,PA 19104,美国
1宾夕法尼亚大学生物工程系,费城,PA 19104,美国
2宾夕法尼亚大学医学系,费城,PA 19104,美国
三宾夕法尼亚大学矫形外科,费城,PA 19104,美国。
2015年8月24日收到;2016年1月22日接受。
- 补充资料
补充电影S1
制导:4A00FD63-EB1F-4985-AB9F-713A4613AA20
补充信息
GUID:116C92BB-DEEC-48F0-947C-3CBA27C7969A
摘要
在发达国家,组织纤维化导致将近一半的死亡,其特征是基质逐渐硬化。尽管如此,几乎所有在体外疾病模型是机械静态的。在这里,我们使用可见光介导的硬化水凝胶来研究疾病相关系统中的细胞机械转导。原代肝星状细胞接种水凝胶硬化就地在稍后的时间点(在分离后恢复阶段之后),肌成纤维细胞分化的早期(Yes-associated protein/transcription coactivator with PDZ binding motif,YAP/TAZ)和晚期(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)标记物的信号动力学均加快,导致时间进程与观察到的相似体内激活动力学。我们进一步验证了该系统,结果表明,在基底硬化后α-SMA抑制导致星状细胞活化减弱,YAP/TAZ核穿梭和牵引力生成减少。总之,这些数据表明,与静态底物相比,硬化水凝胶可能是研究肌成纤维细胞活化的更可靠模型,并可能为疾病治疗学的发展提供信息。
在发达国家,组织纤维化导致将近一半的死亡1许多组织(包括胰腺、肺、肾和肝脏)受到广泛损伤后会发生纤维化2,三周细胞和成纤维细胞分化为纤维原性肌成纤维细胞是纤维化发展的核心,并导致异常的细胞外基质(ECM)合成和重塑,进而导致组织硬化和器官功能丧失。肝星状细胞是肝纤维化中肌成纤维细胞的主要来源4以及原发性肝癌(通常与纤维化相关),每年在全世界造成170多万人死亡5.
人们越来越认识到局部力学特性在肝纤维化等病理学的发生、发展和进展中所起的作用,尤其是最近有证据表明,组织硬化通常被视为疾病的结果,可能是纤维化发展和肿瘤形成的重要因素6,7,8水凝胶生物材料越来越多地被用作模型微环境,以探索细胞行为,并通过开创性研究确定基质刚度的作用9,几何图形10和降解性11调节细胞命运。使用几种水凝胶平台研究了力学在星状细胞分化中的作用,表明肝星状细胞在柔顺(弹性模量)上培养(E类)或刚度<3 kPa)刚度水平与健康肝脏相似的基质保持表型静止,而星状细胞培养在刚度水平类似于患病肝脏的较硬基质上(E类 > 20 kPa)经历肌成纤维细胞分化12,13,14.
尽管如此,仍然缺乏在体外能够再现疾病期间力学时间动力学的模型系统;以前对肝星状细胞在肌成纤维细胞激活过程中的研究都是在机械静态底物上进行的。不幸的是,这些静态材料可能无法复制观察到的变化体内当原代细胞从组织中消化并直接接种到基质上,而不是经历逐渐或延迟的硬化。尽管肝星状细胞体内在纤维化诱导后数小时内上调纤维生成蛋白,如结缔组织生长因子和β-血小板衍生生长因子受体15,16,许多新分离的原代细胞(包括星状细胞)显示整合素和其他表面蛋白的表达发生改变17,18这可能会减弱他们对早期机械刺激的反应,突显出机械信号的定时对于在体外疾病模型。此外,随着新的分子靶点的发现,在与体内设置。例如,Hippo相关转录共激活因子与PDZ结合基序的Yes相关蛋白/转录共激活因子(YAP/TAZ)已被鉴定为参与干细胞分化的重要机械传感调节因子19,20并且最近被证明对动态机械载荷有响应21然而,YAP/TAZ在机械性纤维化进展中的作用尚未在力学变化的背景下进行研究16,22.
各种加固系统已被用于研究干细胞命运决定23,细胞扩散24,心肌细胞成熟25心脏病患者的肌成纤维细胞表型26总之,这些研究表明,机械信号的大小和时间对于研究复杂细胞行为(如干细胞分化和肌成纤维细胞激活)中的机械转导信号动力学是重要的。然而,以前的方法不能提供机械信号的精确时间控制25或受到使用紫外线(UV)的限制23,26可能对某些细胞类型(包括星状细胞)有害27). 在这项工作中,我们旨在开发一种适合于就地研究硬化事件如何影响星状细胞肌成纤维细胞分化中早期(YAP/TAZ核移位)和晚期(肌动蛋白细胞骨架成熟)事件的动力学。
结果
可见光介导的二次交联使MeHA水凝胶变硬
我们观察到,与可见光(蓝光)或无照射相比,紫外线照射显著降低了肝星状细胞的存活率,增加了核p53的积累(补充图1). 基于这些结果,我们设想了一种用甲基丙烯酸透明质酸(MeHA)制备硬化水凝胶的方案(). 这种方法结合了初始Michael型加成反应形成软凝胶,然后在用户定义的时间点进行可见光介导的未反应甲基丙烯酸酯的自由基聚合,以硬化基底(). 虽然我们考虑了几种引发剂(例如Eosin Y、,补充图2),酰磷酸锂(LAP)28被认为是最有希望的,因为即使在高LAP浓度(6.6 mM)或LAP(6.6 m M)和可见蓝光照射(5 min,10 mW cm−2,峰值波长~470 nm)(补充图3). 通过流变仪测量,蓝光曝光和二次交联LAP的结合使基底显著硬化()和原子力显微镜(). 使用这种方法,我们制作了两种“软”基板(E类 = 1.75±0.02 kPa,对应健康肝脏硬度)和二级交联“刚性”底物(E类 = 33.0±3.2 kPa,纤维化肝僵硬度)。
可见光介导的MeHA凝胶硬化。(a) 用甲基丙烯酸酯对透明质酸进行改性,以实现加成和自由基交联。(b条)含有RGD的肽与MeHA偶联,然后进行初始Michael型加成反应,形成软凝胶。可见蓝光和光引发剂LAP存在下的自由基聚合使基底变硬。(c)显示MeHA在蓝光(3 mW/cm)下硬化的流变剖面2,15分钟,阴影)。闭合圆表示存储模量(G'),开放圆表示损耗模量(G“)。(d日)AFM测量软硬(蓝光:10 mW/cm2,5分钟,LAP:6.6 mM)水凝胶弹性模量(n个 = 每组3粒凝胶,误差条代表标准偏差。)***P(P) < 0.001.
肝星状细胞在对就地加固
利用这种动态水凝胶系统,我们研究了星状细胞对就地二次交联(). 接种在软基质上的肝星状细胞保持圆形并保留脂滴,而培养在硬基质上的星状细胞在几天内逐渐扩散,失去脂滴,呈肌纤维母细胞样形态(). 同时,星状细胞最初培养在软凝胶上就地二次交联对底物硬度的变化反应迅速(约18–24小时),类似于在刚性静态底物上培养的细胞的形态(,补充电影1). 为了确保观察到的细胞形态结果是由于基质硬度的变化而不是自由基的产生29制备了软MeHA凝胶,其中剩余的甲基丙烯酸酯用硫醇覆盖,因此在光引发剂存在下的光照射导致自由基生成,但不会增加交联。与软水凝胶上的细胞相比,水凝胶弹性模量或细胞扩散面积没有差异,这表明自由基生成不会诱导星状细胞扩散(,补充图4).
肝星状细胞扩散并呈现肌成纤维细胞形态,以应对就地变硬。(一)的示意图就地加固过程。(b条)软、硬静态基板以及动态硬化软到硬基板上星形细胞的相位对比图像(就地加固在第4天进行)。比例尺:50μm。(c)24小时后典型星状细胞扩散面积定量就地第4天变硬(n个 = 每组3个细胞,每个形状代表一个细胞,其扩散面积每15分钟监测一次)。在软静态组和硬静态组中扩散面积相对恒定,但在软到硬组中稳定增加,尤其是在最初的12小时内(d日)为了确保星状细胞随着刚度而不是自由基的产生而扩散,制备了软的MeHA凝胶,其中剩余的甲基丙烯酸酯被硫醇覆盖,以便在光和引发剂存在下会产生自由基,但不会发生二次交联(硬化)。典型的相位对比图像显示,各组之间的细胞扩散区域没有差异。比例尺:50μm。(e(电子))细胞面积量化证实各组间扩散面积无差异(n个 > 每组22个单元格/时间点,误差条代表标准偏差)。
延迟硬化促进更快速的YAP/TAZ核移位和α-SMA应力纤维组装
我们假设在坚硬的基底上观察到细胞在几天内逐渐扩散(补充图5)这是由于分离后的恢复阶段,星状细胞的机械感应减弱。为了研究这一点,我们在恢复前(第1天)或恢复后(第6天)的早期时间点硬化凝胶,并与软凝胶和硬凝胶相比,评估星形细胞在培养的14天内的扩散情况。早期硬化(第1天)的星形细胞扩散面积很大程度上反映了静态硬化水凝胶观察到的趋势。有趣的是,观察到星状细胞在后期硬化(第6天)和48小时内“追赶”早期硬化组后扩散更快(补充图5和6). AFM评估表明,14天后,无论加固时间点如何,所有加固基板都具有相似的弹性模量(补充图7). 而之前的研究表明,当将肝星状细胞置于坚硬的培养基上时,其在几天内逐渐扩散14,30在这里,我们发现在软环境中培养几天后,可以恢复表面蛋白的表达,如血小板衍生生长因子受体β(β-PDGFR)和β1整合素(补充图8)星状细胞的扩散和激活速度更快,以响应刚度的逐步增加。
接下来,我们进行了一系列实验,以阐明在隔离后恢复时间点的早期(第1天)或晚期(第6天)硬化后机械传导事件的时间动力学。僵硬后1-72小时评估扩散面积、YAP/TAZ易位(早期标记)、α-SMA表达(晚期标记)和F-actin组织。将结果与静态软凝胶对照(虚线、,). 在第1天和第6天的静态软性对照组(虚线)之间,未观察到任何测量结果的显著差异。早期和晚期硬化后,YAP/TAZ核强度逐渐增加,尽管在后期硬化后1小时,YAP/TAZ核强度变化更快,大约相当于早期硬化后72小时(,补充图9和10). 在随后的1小时内硬化后,观察到YAP/TAZ核强度和F-actin应力纤维组织显著升高(,补充图9和10)α-SMA应激纤维组织测定的肌成纤维细胞成熟度落后于这两个指标(,补充图9和10). 大多数星状细胞在早期硬化后72小时内仍呈弥漫性α-SMA染色,而α-SMA应力纤维组织在后期硬化后逐渐增加,并且在24-72小时时显著高于早期硬化。当这些实验延长到总培养时间的14天时,所有硬化基底上的星状细胞(静态硬化、早期(第1天)和晚期(第6天)硬化)均显示YAP/TAZ核强度、F-actin(更具体地说是α-SMA)应力纤维形成和成纤维基因表达水平显著升高学报2和第1a1列(分别编码α-SMA和I型胶原)与软凝胶上的星状细胞的比较(补充图11和12).
延迟硬化促进更快速的YAP/TAZ核移位和α-SMA应力纤维组装。(一)实验设计示意图。(b条)星状细胞扩散面积的量化(n个 > 每组12个细胞)(c)YAP/TAZ核质强度比(n个 > 每组29个细胞)(d日)细胞分数显示有组织的α-SMA应力纤维(n个 > 每组20个细胞)(e(电子))和细胞分数显示有组织的F-actin应力纤维(n个 > 每组20个细胞)在早期(第1天)或之后(第6天)硬化后1、6、24或72小时(误差条代表s.e.m.)。((f))第1天或第6天硬化后1小时或72小时细胞的典型相位对比图。(克)代表性免疫染色显示在后期硬化时间点(第6天)YAP/TAZ核移位和α-SMA应力纤维组装更快。虽然在早期硬化(第1天)72小时后YAP/TAZ核定位更为明显,但α-SMA染色仍呈弥散状,且未与F-actin应力纤维共存。相反,在硬化后1小时内(第6天),YAP/TAZ核移位出现,硬化后72小时,大多数星状细胞显示α-SMA应力纤维。所有实验组的代表性免疫染色见补充信息虚线表示第1天(浅蓝色)或第6天(深蓝色)软凝胶上的水平*P(P) < 0.05, **P(P) < 0.01, ***P(P) < 0.001,其中图中所示的比较是第1天和第6天每个后加固时间点的结果(例如,面板内(c)加固后1 h第6天YAP/TAZ核强度比显著大于加固后1小时第1天YAP/TAZ核强度,P(P) < 0.05). 比例尺:50μm。
α-SMA聚合的特异性抑制导致YAP/TAZ核穿梭和牵引力的产生减少
我们使用我们的动态硬化系统来研究早期YAP/TAZ介导的机械传感事件与肌成纤维细胞成熟的后期标志物(如α-SMA组织)之间的联系。我们在恢复三天后变硬的水凝胶上培养星状细胞,然后补充α-SMA阻断肽(BP(+))31并将结果与非治疗对照组(BP(−))进行比较。抑制α-SMA导致几乎完全消除α-SMA染色,而不改变其他F-actin亚型的应激纤维形成(). 然而,α-SMA阻断导致YAP/TAZ核强度显著降低(P(P) < 0.001,). 我们假设YAP/TAZ核转位的减少是由于α-SMA介导的收缩性的机械反馈减少所致。虽然已知肝星状细胞对机械信号敏感,并且在疾病进展过程中具有高度收缩性,但据我们所知,之前的研究没有量化这些细胞施加的牵引力。在这里,我们使用牵引力显微镜(TFM)显示,用阻断肽处理星状细胞不会改变扩散面积,但会显著降低总作用力和平均牵引应力((BP(−)~700 Pa,BP(+)~200 Pa,P(P) < 0.001,).
阻断α-SMA聚合导致YAP/TAZ核穿梭减少。(一)将星状细胞接种在3天后变硬的软凝胶上,并在正常培养基(BP(−))或添加α-SMA阻断肽(25μg/mL,BP(+))的培养基中培养额外4天。阻断肽几乎完全消除了α-SMA的表达,而不影响其他丝状肌动蛋白,但减少了核YAP/TAZ的积累。比例尺:50μm。(b条)免疫染色定量表明α-SMA阻断不会影响显示F-actin应激纤维的细胞比例(n个 > 每组30个单元格,误差条代表s.e.m.)。(c)YAP/TAZ核质强度比的Tukey-box图显示BP(+)组YAP/TAZ核定位显著降低(n个 > 每组30个细胞)***P(P) < 0.001.
抑制α-SMA不会改变星状细胞扩散面积,但会显著减少牵引力的产生。(一)代表性牵引力矢量图和相位对比图显示了BP(−)组中相似但更强的牵引。比例尺:50μm。(b条)细胞扩散面积的Tukey盒图量化(n个 > 每组12个细胞)。(c)每个单元产生的总力的Tukey盒图量化(n个 > 每组12个细胞)。(d日)平均牵引应力的Tukey盒图量化(n个 > 每组12个细胞)***P(P) < 0.001.
讨论
在这项工作中,我们开发了一种细胞相容性方法来制造就地使水凝胶变硬,以重现在疾病(如肝纤维化)开始和进展过程中发生的机械信号的变化。这是一种不可逆的技术,硬化过程的大小和时间随光照参数而改变。用RGD肽修饰水凝胶以促进细胞粘附;然而,在这个系统中可以研究一系列ECM蛋白和肽。然后我们发现,肝星状细胞在恢复后延迟硬化的反应中激活得更快,这让人想起体内激活与早期硬化相比。我们进一步证明了该系统的独特能力,表明在基底硬化后抑制α-SMA聚合会降低YAP/TAZ核定位和牵引力的产生。总的来说,这些数据表明,硬化水凝胶在研究疾病中机械传递的动力学方面可能优于静态培养基,并且可以为确定治疗干预的靶点提供信息。
我们以前开发了就地依靠紫外光照射将二次交联引入水凝胶的硬化水凝胶系统23虽然该系统有许多显著的特点,可以实现我们的目标,但以前的报告表明肝星状细胞对紫外线敏感27可能是由于含有维生素A的脂滴的存在32在静止的星状细胞中。作为另一种方法,我们证明可见光介导的二次交联导致水凝胶硬度的病理相关增加,而不会损害星状细胞的活性。
利用这个机械动力学模型系统的力量,我们假设不仅硬化事件本身,而且硬化的时间也会影响早期(YAP/TAZ)和晚期(α-SMA)标记中显示的星状细胞肌成纤维细胞表型。YAP/TAZ是Hippo相关转录共激活物,主要与TEAD相关转录因子相互作用,以调节广泛下游过程中的基因表达。虽然YAP/TAZ在发育和疾病(如癌症)期间参与器官生长的(失调)调节是很有特点的33,其在肝纤维化进展中的显著作用直到最近才被阐明16大量YAP/TAZ靶基因,如结缔组织生长因子(细胞生长因子)促进纤维化反应,包括增加α-SMA表达34是肌成纤维细胞表型的标志。我们发现,在培养的第一周内,由于YAP/TAZ核转位加快,随后的硬化导致星状细胞扩散加快,α-SMA应力纤维形成加快。
在后期硬化后观察到的更快的活化与肝星状细胞活化动力学一致体内其中YAP/TAZ靶基因,如细胞生长因子以及β-PDGFR等成纤维蛋白在损伤后数小时内上调15,16早期和晚期硬化之间观察到的信号动力学差异可能是由于隔离后恢复阶段,最初延迟星状细胞以病理相关的方式对机械输入作出反应的能力。培养的活化细胞(包括各种表面蛋白和细胞骨架成分)中的肝星状细胞基因表达谱与体内活化星状细胞18虽然简化了在体外激活可能是这些差异的部分原因,这些标记的表达也可能受到蛋白酶依赖性细胞分离程序的影响。事实上,我们观察到,与新分离的细胞相比,在软凝胶培养6天后,星状细胞中β1整合素的表达显著增加,并且在数天的恢复期后,β-PDGR恢复到基础水平。至关重要的是,在细胞分离和随后的基质硬化后观察到的信号动力学差异在传统细胞培养平台上是不可能的。先前研究软支架和硬支架上星状细胞激活的工作强调了力学的作用,并建议在软的和生理上坚硬的基质上培养,而不是在塑料上培养,是了解正常星状细胞功能和激活的最佳方法。本文提供的数据进一步表明,在标准塑料支持物上的培养歪曲了活化的动力学,并且最佳细胞培养需要分离后的恢复期以及机械生理底物。满足这两个要求的硬化水凝胶可能是理想的在体外用于研究发育和疾病中僵硬介导事件的模型,包括但不限于α-SMA表达的时间和相关性。
总的来说,我们的研究结果表明,虽然软基质上的初始星状细胞培养抑制了肌成纤维细胞表型的许多典型指标,包括扩散和α-SMA应激纤维组织,但星状细胞在从分离过程中恢复过来后,仍可能会被激发以更快地激活。尽管之前有一份关于肺成纤维细胞机械记忆的报告发现,在软基质上延长培养(约2周)可以防止僵硬介导的肌成纤维细胞活化35,我们的数据得到了在Matrigel上培养的肝星状细胞的研究的支持,该研究表明短期培养(~1周)不会阻止激活36同样值得注意的是,在上述研究中,细胞被蛋白酶处理(类似于细胞分离过程)并转移到不同的底物,可能会改变机械反应时间轴35,36我们的系统定位独特,允许细胞在分离后恢复,而不暴露于任何异常的机械信号(例如,组织培养塑料),然后在用户定义的时间点引入病理学相关的机械输入。我们的结果表明,与传统的静态培养基相比,这种方法可以更忠实地捕捉疾病中机械转导信号事件的动力学。更广泛地说,我们的结果可能对其他应用具有启示,包括使用软和/或硬培养基作为工具来防止或指导特定分化命运。
最后,我们应用我们的机械动态水凝胶系统证明,基底硬化后阻断α-SMA聚合会降低YAP/TAZ核定位和牵引力生成,表明α-SMA收缩性对肌成纤维细胞成熟过程中YAP/TAZ-介导的机械传递至关重要。重要的是,我们认为这只能通过这里开发的系统进行调查。在这些实验中,硬化时间不太重要,因为细胞在整个硬化时间点范围内进行激活,我们在硬化之前选择了中间恢复时间(3天)进行研究。这在一定程度上是为了确保在进行牵引研究时水凝胶特性保持不变。虽然先前的研究表明α-SMA抑制导致肺的收缩性、运动性和Erk1/2活性降低31和肝脏37据我们所知,在肌成纤维细胞激活中,α-SMA收缩性和YAP/TAZ活性之间的联系尚未建立。所观察到的牵引力产生的减少在功能上很重要,因为激活了星形细胞体内显示牵引力依赖性运动和收缩性增加,导致门静脉血流量受限,并允许释放潜在的ECM隔离的纤维生成细胞因子,如TGF-β38定义良好的细胞培养系统,如这里开发的系统,为我们更好地理解像肝星状细胞这样的机械敏感性细胞如何对其环境的动态变化作出反应提供了平台,并可以为疾病治疗的发展提供信息(例如,抑制YAP/TAZ易位或α-SMA组织)。
方法
MeHA合成
如前所述,水凝胶由甲基丙烯酸透明质酸形成39在pH值8.0–9.5的冰上,将去离子水中的.2 wt%透明质酸钠(Lifecore,75 kDa)与甲基丙烯酸酐(Sigma,5.6 mL/g HA)反应6 h。在室温下,将溶液在去离子水中(SpectraPor,6–8 kDa分子量截止值)透析7 d,然后冻干。改性程度为~90%,测量方法为1核磁共振氢谱(布鲁克,补充图13).
MeHA水凝胶制造
粘附配体RGD(GCGYGRGD公司SPG(GenScript)通过Michael型加成反应与HA上的甲基丙烯酸酯偶联,以实现细胞附着。MeHA和RGD肽在室温下在0.2 M三乙醇胺(TEOA,Sigma)缓冲液中以pH 9的比例振荡培养45分钟,以获得1 mM水凝胶中的最终RGD浓度。软MeHA水凝胶也通过Michael型添加形成。在pH 9下,用二硫苏糖醇(DTT,Sigma)交联3 wt%RGD改性MeHA。用移液管将水凝胶前体溶液(70μL)移入聚二甲基硅氧烷模具(PDMS,Dow Corning,18×18×0.15 mm)并用甲基丙烯酸玻璃盖玻片覆盖40在室温下保持3h,以形成水凝胶膜,附着在功能化盖玻片上。软水凝胶的RGD功能化和交联仅消耗约20%的可用甲基丙烯酸酯基团,留下大量基团用于二次交联。对于TFM实验,在凝胶化之前,将0.2μm直径的荧光珠(Invitrogen)与水凝胶前体溶液以1%v/v的速度混合。
LAP合成
如前所述,合成了酰磷酸锂(LAP)28,41简单地说,在室温下,在恒定搅拌和氮气条件下,等量的二甲基苯基膦酸盐(Sigma)和2,4,6-三甲基苯甲酰氯(Sigma-)反应18 h。将四倍过量的溶解在2-丁酮(Sigma)中的溴化锂(TCI America)加入反应混合物中,并在50°C下加热10分钟,形成沉淀物。沉淀物在2-丁酮中洗涤数次,干燥过夜,并在氮气下于4°C黑暗中保存,直至使用。结构由确认1核磁共振氢谱(布鲁克,补充图14).
肽合成
α-SMA阻断肽(Ac-EEEDGRQIKIWFPNRRMKWKK)31,42使用标准固体支持的Fmoc保护方法合成。在剧烈搅拌下,将肽在三氟乙酸中裂解4小时,在冷乙醚中沉淀,溶于水中,在−80°C下冷冻,然后冻干。MALDI证实合成成功(补充图15).
现场加固
MeHA水凝胶在细胞培养之前或期间在用户定义的时间点变硬。软水凝胶在含有6.6 mM LAP光引发剂的培养基中在37°C下培养30分钟,然后在10 mW cm下蓝光照射5分钟−2使用牙科治疗灯(ESPE Elipar 2500,3 M)。在光照后,将水凝胶在PBS中冲洗两次,以去除LAP并放置在新鲜培养基中。
水凝胶力学特性
使用流变学和原子力显微镜(AFM)评估水凝胶力学。流变仪实验是在一台AR2000ex(TA仪器)上进行的,其导光板连接到蓝光灯上。允许在pH值为10的条件下通过初始加成反应形成MeHA水凝胶30分钟,然后将其暴露在蓝光下15分钟(3 mW cm−2). 水凝胶薄膜的弹性模量由AFM(Agilent 6000ILM)获得。2×2阵列的力曲线至少在每个水凝胶的3个不同面积上拍摄,SiO为1μm2球形探头(0.06 N/m,Novascan)。使用赫兹压痕模型的Sneddon近似,从力曲线数据中获得弹性模量。
肝星状细胞分离
如前所述,从Sprague-Dawley大鼠中分离出肝星状细胞43.酶消化大鼠肝脏就地用0.4%蛋白酶(罗氏诊断)和0.04%胶原酶II(沃辛顿)治疗。肝浆在最小基本培养基(MEM)中稀释,并通过粗棉布过滤。然后在0.002%DNA酶(沃辛顿)中清洗细胞悬浮液两次。星形细胞通过密度梯度离心法用9%Nycodenz(Sigma)1400 g溶液分离25分钟,在MEM中清洗,并保存在冰上,直到接种到水凝胶上。
在MeHA水凝胶上培养肝星状细胞
在细胞接种之前,水凝胶薄膜在37°C的PBS中培养过夜,然后在杀菌紫外线照射下灭菌2小时。然后,在接种之前,将灭菌水凝胶在培养基中培养至少30分钟。培养基由无酚红M199培养基(Invitrogen)组成,补充有10v/v%胎牛血清(Sigma)、2v/v%.青霉素-链霉素(Invit罗gen)和1v/v%fungizone两性霉素B(Invitorgen)。细胞以5×10的密度接种在6孔板中的水凝胶薄膜上三细胞/厘米2除α-SMA抑制实验外,所有实验均以3.5×103细胞/cm接种2媒体每周更换2-3次。对于α-SMA抑制研究,培养基中添加α-SMA阻断肽(25μg/mL),并每天更换。
定时显微镜
时间推移显微镜(Olympus IX81配备有活细胞成像环境室)用于跟踪水凝胶硬化后星状细胞的实时扩散。培养在软质和硬质静态基质上的星状细胞图像,以及就地每15min捕获一次硬化水凝胶,持续24h。
细胞成像、染色和量化
使用蔡司Axiovert 200倒置显微镜(Hitech Instruments,Inc.)获取水凝胶上星形细胞的相位对比图像。NIH ImageJ用于测量细胞扩散面积。通过在10%缓冲福尔马林中固定细胞15分钟,在0.1%Triton X-100中透化15分钟,并在室温下在PBS中的3%BSA中封闭1小时,制备用于免疫细胞化学的水凝胶。然后将细胞水凝胶构建体与在阻断缓冲液中稀释的针对α-SMA(小鼠单克隆抗-α-SMA克隆1A4-Ab,Sigma,1:400)、YAP(兔多克隆抗YAP,Santa Cruz Biotechnology,1:200)、p53(小鼠单克隆抗p53,Santa Cruz Biotechnology,1:400)、,β-PDGFR(兔单克隆抗PDGF受体β,细胞信号技术,1:200)和/或β1整合素(兔单抗整合素β1,Abcam,1:200。对于细胞表面蛋白β-PDGFR和β1整合素的染色,省略了通透性步骤。水凝胶在PBS中清洗三次,然后与适当的二级抗体(AlexaFluor)孵育®488山羊抗鼠IgG或AlexaFluor®568羊抗兔(Invitrogen)或罗丹明阴茎肽,在室温下观察F-actin(Invit罗gen,1:200)2小时。然后用PBS清洗水凝胶两次,用DAPI孵育1分钟(1:10000),在PBS中再次冲洗,并在黑暗中4°C保存,直到成像。使用奥林巴斯BX51显微镜(B&B显微镜有限公司)获取荧光图像。在NIH ImageJ中测量YAP/TAZ核和细胞质强度以及相对的β-PDGFR和β1染色强度。
定量聚合酶链反应
使用RNeasy Plus Micro试剂盒(Qiagen)从水凝胶上的星状细胞中提取RNA。使用Super Script III逆转录酶(Invitrogen)将RNA逆转录成cDNA。使用StepOnePlus仪器(Applied Biosystems)对包括β1整合素在内的靶点进行定量PCR(Itgb1号机组),β-PDGFR(Pdgfrb公司),α-SMA(学报2)和I型胶原蛋白(第1a1列). 核糖体蛋白S12(12卢比)和18S核糖体RNA(18秒)用于归一化。引物的序列如所示补充表1.
牵引力显微镜
如前所述,测量肝星状细胞对水凝胶施加的牵引力21如前所述,制备嵌入荧光微球的水凝胶,并用紫外线固化固定剂(NOA68,诺兰产品)固定在培养板上。在DeltaVision反卷积显微镜(GE Healthcare Life Sciences)上以20倍放大率拍摄多个细胞和嵌入珠的相位对比度和荧光图像。在使用十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液进行细胞裂解之前和之后,分别拍摄每个细胞的图像序列。所有成像均在环境室中进行(37°C,5%CO2). 数据分析(堆栈对齐、粒子图像测速和傅里叶变换牵引细胞术)是使用一个免费的ImageJ插件套件进行的,该插件套件由Tseng创建等。44改编自Dembo和Wang45对于傅里叶变换牵引式细胞术,假设水凝胶的泊松比为0.45,正则化参数为10−9已使用。通过分析牵引力矢量图,使用自定义MATLAB脚本确定每个单元产生的平均力。
统计分析
进行了学生t检验(只有两组数据集)或单向方差分析(ANOVA),然后进行Tukey-HSD事后检验(两组以上数据集)。显著性设为P<0.05*,**,或***分别表示P<0.05、0.01或0.001。除非另有说明,否则误差以数字形式报告为平均值的标准误差。
其他信息
如何引用这篇文章:Caliari,S.R。等。用于研究肌成纤维细胞激活过程中肝星状细胞机械转导动力学的硬化水凝胶。科学。代表。
6, 21387; doi:10.1038/srep21387(2016)。
致谢
作者感谢Chris Highley博士、Adrianne Rosales博士和Chris Rodell博士对NMR、MALDI和有益讨论的帮助,以及Claire McLeod对AFM的帮助。大卫和露西尔·帕卡德基金会(JAB)和国家卫生研究院(F32 DK103463,SRC;DK058123,RGW)支持这项工作。
脚注
作者贡献S.R.C.、R.G.W.和J.A.B.设计了研究;S.R.C.、M.P.、B.D.C.、S.J.T.和G.L.进行了研究;B.D.C.和R.L.M.提供了新的分析工具;S.R.C.、M.P.、B.D.C.、R.G.W.和J.A.B.分析了数据;S.R.C.、R.G.W.和J.A.B.撰写了这篇论文。
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