A robust prognostic gene expression signature for early stage lung adenocarcinoma

Marcin Krzystanek; Judit Moldvay; David Szüts; Zoltan Szallasi; Aron Charles Eklund

doi:10.1186/s40364-016-0058-3

生物标记研究。2016; 4分4秒。

2016年2月19日在线发布。数字对象标识：10.1186/s40364-016-0058-3

预防性维修识别码：项目经理4761211

PMID：26900477

早期肺腺癌的稳健预后基因表达特征

马尔金·克兹斯坦尼克（Marcin Krzystanek）, 朱迪特·莫尔德维, 大卫·苏茨, 佐尔坦·萨拉西,和阿伦·查尔斯·埃克隆德

作者信息文章注释版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

背景

I期肺腺癌通常不进行辅助化疗；然而，大约一半的患者活不到5年。因此，早期患者的可靠预后生物标记物对于确定最有可能从早期附加治疗中获益的患者至关重要。一些研究已经在寻找肺腺癌的基因表达预后生物标志物，但这些研究还没有产生一个被广泛接受的预后指标。

结果

我们分析了七个已发表的肺腺癌队列的基因表达，其中我们仅包括未接受辅助治疗的I期和II期患者。在Cox回归中，七个基因在总体生存率方面始终具有统计学意义。在所有队列中，联合签名的加权平均风险比为3.2，在独立验证队列中为3.0（C.I.1.3–7.4，p<0.01），并且与之前公布的染色体不稳定和细胞周期进展签名密切相关。

结论

如果前瞻性地验证新的预后特征，可能会使早期肺癌患者得到更好的分层和治疗。

电子辅助材料

本文的在线版本（doi:10.1186/s40364-016-0058-3）包含对授权用户可用的补充材料。

关键词：肺腺癌，预后生物标志物，基因表达，早期癌症

背景

肺癌是所有癌症类型中发病率第三高、死亡率最高的。对于非小细胞肺癌（NSCLC），5年生存率仍低于15%[1,2]。鉴于晚期非小细胞肺癌的治疗困难，改善预后的最有希望的可能性可能是早期病例的有效诊断和治疗。这些患者最重要的临床决策之一是是否在手术切除的基础上进行辅助化疗。目前，对于证据水平为1A的IA期非小细胞肺癌完全切除患者，不建议进行术后化疗，对于证据级别为2B的IB期疾病和>4cm的原发肿瘤，可以考虑进行术后化学治疗[2]。然而，只有高达73%的IA期和58%的IB期患者存活5年[1]。因此，确定可能从辅助治疗中受益的患者——即使是I期非小细胞肺癌患者——将具有很强的诊断和预后相关性。

一个类似的问题已经被广泛研究，并在很大程度上解决了淋巴结阴性雌激素受体阳性乳腺癌。获得了一个基因表达特征，用于识别从额外化疗中获益的高复发风险患者[三]。这种基因表达特征的识别通常始于对已知结果的患者队列中的大量基因进行量化，然后选择并进一步验证信息最丰富的基因。

类似的策略也被应用于肺腺癌。几个包含早中期肺癌患者的队列已经进行了转录组学分析，主要是通过微阵列进行的[4–10]。然而，从这些努力中还没有出现可靠、一致的基于基因表达的预测因子。失败的一个可能原因可能是，其中一些研究在一种或多种可能的方式上遵循了次优策略：1）寻找一种通用的NSCLC预后指标，而不是肺腺癌（LUAD）或肺鳞状细胞癌（LUSC）特异性特征[4,5]，2）在接受治疗/未接受治疗的混合人群中进行分析[4,6,9]，3）忽略微阵列数据中技术偏差的可能性[11,12]。另一方面，基于PCR的细胞周期进展（CCP）基因表达特征不来源于肺癌患者，在三个早期LUAD队列中被发现具有预后，并在基于PCR的研究中得到验证[13,14].

肺癌数据集的可用性越来越高，这使得寻找由基因组成的稳健特征成为可能，如果只在单个数据集上进行研究，则无法找到这些基因。因此，我们开始对几个肺癌微阵列数据集进行荟萃分析，以确定是否可以确定一个基因表达特征，该特征可以预测未接受化疗的早期肺腺癌患者的预后。

方法

从GEO数据库下载了微阵列数据(GSE8894标准,第14814页,GSE30219标准,GSE31210标准,GSE37745标准,GSE50081标准)，Shedden等人除外，其从caarraydb.nci.nih.gov下载（表1). 所有计算均使用R编程语言进行。每个基因表达数据集都用RMA算法进行了标准化，除了GSE9984标准，我们无法获得原始数据，因此我们使用直接从GEO下载的版本，该版本已使用GCRMA算法进行了规范化[4]。每个数据集，除了GSE9984标准还针对两个潜在偏差源进行了校正：捕获到的RNA降解是5’探针和3’探针之间表达的平均减少（降解偏差度量），以及RMA归一化后保持的起始mRNA的多样性（RMA IQR偏差度量）。此步骤是使用“bias”软件包版本0.0.5执行的[11]。危险比的加权平均值是按每个数据集的大小加权的平均值。

表1

本研究所包含队列中的患者数量

		包括^一
队列	可用	第一阶段	第二阶段	总计
Lee等人，2008年[4]	138	39	12	51
Zhu等人，2010年[5]	133	20	12	32
Shedden等人，2008年[6]	505	164	43	207
Rousseaux等人，2013年[7]	307	81	三	84
Okayama等人2012[8]	246	162	42	204
Botling等人，2013年[9]	196	31	4	35
Der等人，2014年[10]	181	92	35	127

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^一通过纳入标准：腺癌，无化疗

使用数据矩阵从TCGA数据门户下载验证队列的基因表达和临床协变量(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm)，选择15的所有可用肿瘤^第个2016年1月，疾病：LUAD，数据类型：RNASeqV2。表达值是从包含RSEM基因正常化结果的文件中提取的，我们使用每个肿瘤的平均基因表达对样本进行了标准化[15,16].

结果

我们进行了文献和数据库搜索，确定了七个公开可用的基因表达数据集，其中包含总体生存数据或无复发生存数据，并且至少有30名患者符合以下标准：1）在Affymetrix HG-U133A或HG-U134 Plus 2.0平台上进行了分析；2）组织学报告腺癌亚型；3）病理I或II期；和4）未给予新佐剂、佐剂或靶向治疗（表1). 每个数据集（Lee等人[4])分别进行标准化并进行调整以减少技术偏差[11].

为了确定其表达水平具有预后意义的基因，我们对22277个通用探针组中的每个探针组应用了以下程序。我们根据探针集的表达值将每个队列分为两组，并对这两组进行Cox比例风险回归和log-rank检验。如果所有队列中的危险比具有相同的方向性，并且在七个队列中的任何六个队列中P值低于0.05，则探针集被认为是预后的。我们预计该程序将产生1.0×10的单个I类错误率⁻⁷，并对22277个探针组进行了Bonferroni校正，家族误差率为0.00036。这个过程产生了七个探针组，每个探针组代表一个独特的基因（表2).

表2

每个队列中单个ESLA-7基因的危险比

基因	ADAM10型		DLGAP5型		RAD51AP1型		FGFR10P公司		NCGAP公司		基辅15		阿斯彭
探头组	202604_x天		203764_吨		204146_吨		205588_秒_秒		218663_吨		219306_安		219918年_月_日
队列	人力资源	对	人力资源	对	人力资源	对	人力资源	对	人力资源	对	人力资源	对	人力资源	对
Lee等人，2008年[4]	3	**	2.3	*	4	***	2.9	**	2.3	*	2.5	*	2.5	*
Zhu等人，2010年[5]	0.7		3.1	*	3.7	*	3.2	*	4.7	**	3.9	*	4.1	**
Shedden等人，2008年[6]	1.7	*	1.7	*	1.7	*	1.6	*	1.8	*	1.6	*	1.7	*
Rousseaux等人，2013年[7]	2.6	**	2.4	**	2.7	**	1.9	*	2.3	**	2.3	**	1.9	*
Okayama等人2012[8]	4.3	***	2.9	**	2.9	**	3.4	**	2.4	*	2.8	*	4.2	***
Botling等人，2013年[9]	2.5	*	1.7		1		1.3		1.3		1.7		1.1
Der等人，2014年[10]	2.2	**	2.5	**	2	*	2.1	**	2.5	**	2.4	**	2	*

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*对 ≤ 0.05, **对 ≤ 0.01, ***对 ≤ 0.001

七个探针组的表达值呈强正相关，因此我们将单个肿瘤的预后评分定义为平均对数₂七个探针组（称为“ESLA-7”，用于早期肺腺癌）的表达值。我们发现，当用ESLA-7评分将每个队列分为两个大小相等的组时，七个单独队列中的六个队列具有预后（表2和图1). 值得注意的是，ESLA-7评分比任何单独的探针组都更具预后。总体而言，ESLA-7的加权平均危险比为3.2，如果忽略Botling队列，则为3.6（图1).

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图1

七个早期肺腺癌队列和TCGA LUAD验证队列的Kaplan-Meier总体或无复发生存率估计[4–10,16]。每个队列根据ESLA-7评分进行分组（红色：>中位数，黑色：≤中位数）

接下来，我们进行了多元分析，调整了阶段、年龄和性别分层。所有队列中均无其他临床数据类型可用。在该分析中，ESLA-7在各个队列中的HR范围在1.1-4.9之间，加权平均值为2.7，除Botling等人2008年外，在所有队列中具有统计学意义（表三).

表3

根据年龄、阶段和性别分层调整ESLA-7在多变量环境中的表现

队列	人力资源	CI公司	对	N个	事件
Lee等人，2008年[4]	2.9	1.2–7.1	*	51	24
Zhu等人，2010年[5]	4.9	1.3–18.1	*	32	14
Shedden等人，2008年[6]	2	1.2–3.5	*	207	64
Rousseaux等人，2013年[7]	2.6	1.2–5.8	*	84	31
Okayama等人2012[8]	3.1	1.2–7.9	*	204	27
Botling等人，2013年[9]	1.1	0.3–3.9		35	14
Der等人，2014年[10]	3.2	1.6–6.2	***	127	44

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*对 ≤ 0.05, **对 ≤ 0.01, ***对 ≤ 0.001

为了评估ESLA-7在未用于获得特征的独立队列中的表现，我们分析了TCGA LUAD队列中的RNA-seq基因表达数据。为了减少TCGA队列中不同化疗方案的影响，我们分析了该队列中I期和II期患者的无复发生存率（RFS）。大多数早期LUAD患者直到复发才接受化疗；因此，该分析可被视为对真实预后表现的更准确评估。在此，ESLA-7具有统计学意义（HR=1.8，C.I.1.3–2.6，p<0.001，附加文件1：图S1A）。随后，我们利用现有的治疗信息审查了开始化疗时的生存时间，从而建立了一个随访期内未接受化疗的患者亚组。对I期和II期未治疗患者（N=95）的RFS分析显示HR=3.0（C.I.1.3–7.4，p<0.01，图1和其他文件1：图S1B）。

由于这七个基因中的大多数都被注释为与染色体不稳定性（CIN）相关的功能，我们询问是否可以使用我们之前描述的CIN25染色体不稳定性特征或之前发布的细胞周期进展（CCP）特征实现类似的预后表现[13,14,17]。我们以与ESLA-7信号相同的方式应用了CIN25和CCP信号，发现ESLA-7平均表现优于CIN25和CCP（加权平均风险比分别为3.2、2.9和2.8，图2). 当使用TCGA LUAD RNAseq数据时，CIN25和CCP得分也显示出类似于ESLA-7的趋势（附加文件1：图S1C-F）。此外，每个队列中ESLA-7和CIN25之间的相关性非常高，范围从0.88到0.98，表明ESLA-7-在很大程度上量化了CIN。ESLA-7和CCP之间的相关性在0.89到0.99之间。

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图2

指示ESLA-7、CIN25性能的森林图[17]和CPP[13]七个早期肺腺癌队列和TCGA LUAD验证队列的特征

为了评估ESLA-7的表现，在不将队列任意分为两个大小相等的组的情况下，我们使用ESLA-7作为连续变量进行Cox回归。除Botling等人2013年（加权平均数2.1，表4). 此外，我们探讨了ESLA-7评分是否可以进一步将预后分层到两个以上的组，并使用ESLA-7-评分将每个队列分为四个大小相等的组。对于每个阶层中有足够数量患者的队列，明显的趋势是明显的（图三). 第一四分位患者的生存率高于其他三个四分位的患者，尤其是第四个四分位数的患者。朱等人2010年没有明显的这种趋势[5]和Botling等人，2013年[9]队列，可能是因为这两个队列中的患者数量较少。

表4

以ESLA-7为连续变量的cox回归危险比

队列	人力资源	CI公司	对	N个	事件
Lee等人，2008年[4]	1.8	1.3–2.6	***	51	24
Zhu等人，2010年[5]	3.8	1.1–12.1	*	32	14
Shedden等人，2008年[6]	2.4	1.6–3.5	***	207	64
Rousseaux等人，2013年[7]	2.2	1.5–3.3	***	84	31
Okayama等人2012[8]	1.9	1.3–2.8	***	204	27
Botling等人，2013年[9]	1.2	0.7–2.2		35	14
Der等人，2014年[10]	1.6	1.1–2.2	*	127	44

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*对 ≤ 0.05, **对 ≤ 0.01, ***对 ≤ 0.001

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图3

七个早期肺腺癌队列的Kaplan-Meier生存率估计，根据ESLA-7评分四分位数进行划分

最后，我们将ESLA-7应用于五个肺鳞癌（LUSC）队列[4,5,7,9]。根据ESLA-7值进行的中位数分裂在任何LUSC队列中均未产生统计意义（附加文件2：表S1和附加文件三). 我们试图为肺鳞状细胞癌（LUSC）创建一个单独的特征。然而，应用于LUSC患者的类似方法并没有产生稳健的表达特征（数据未显示）。

讨论

我们使用简单的方法来获得早期肺腺癌的可靠预后基因表达特征。然而，在一个独立队列中验证了签名，有95名患者参与了回归分析，其中许多患者在随访的第一个学期内退出了研究或由于方法学原因被审查，因此应该谨慎对待这一结果。如果在独立的临床试验中成功验证，ESLA-7的特征可能用于指导临床肿瘤学家决定单个早期肺腺癌患者，尤其是I期患者，是否应在肿瘤手术切除后接受化疗。这七个基因可以与另外一小部分参考基因结合，就像其他癌症类型的类似预后特征一样[三,14,18].

ESLA-7和其他两个特征之间的高度相关性表明，它们在很大程度上可能量化了相同的生物过程。CIN25是一种来自特定基因的染色体不稳定特征，这些基因的表达与几种肿瘤的非整倍体一致相关。与CIN25一样，ESLA-7的净过表达预示着不良的临床结果。两个特征都包含与动粒组装直接相关的功能基因：CIN25中的KIF20A、KIF4A、TPX2、PRC1和TTK；ESLA-7中的KIF15、DLGAP5和ASPM。此外，两者都包含属于凝聚素复合物的基因：ESLA-7中的NCAPG；CIN25中的NCAPD2。动粒和凝聚素复合体在染色体组装和分离中都起着核心作用。总的来说，这两个特征都表明染色体不稳定是早期患者预后的重要因素。

只有一个基因RAD51-associated protein 1（RAD51AP1）存在于这两个特征中。该基因通过增强RAD51的重组酶活性，在同源重组介导的染色体损伤修复中发挥重要作用。

ESLA-7的特征包括基因ADAM10和FGFR10P，据报道，这些基因与包括肺癌在内的各种癌症的发生有关，其功能表明，它们可能通过与主要信号级联（ERK1/2、p38 MAPK和STAT、Notch1、RAS/MAPK、PLC-γ和PI3K/AKT）的相互作用参与致癌转化和/或增加细胞增殖。与CCP相比，ESLA-7的表现稍好，这可能是因为ADAM10和/或FGFR10P携带了额外的信息，而这些信息与ESLA-7其余基因的相关性稍低（附加文件4：图S2）。

有趣的是，参与纺锤体组装基因调控的叉头盒心肌梗死（FOXM1）几乎通过了我们的标准。该基因也是CIN25和CCP基因中最重要的基因之一，最近在一项跨平台、跨癌症的研究中被确定为各种恶性肿瘤不良结果的预测因子[19].

虽然我们发现CIN特征与LUAD预后之间存在单调相关性，但我们之前发现CIN与LUSC预后之间存在非单调关系，在这种关系中，与队列中的其他患者相比，CIN水平非常低和非常高会导致生存率增加[20].

结论

如我们的研究结果所示，如果CIN确实对早期肺癌具有很高的预后，那么这将表明LUAD和LUSC队列应分别进行分析。如果进一步前瞻性验证，新的预后特征将有助于更好地分层并减少早期肺癌患者的过度治疗。

道德认可声明

在本研究中，我们使用了在赫尔辛基宣布后经相关机构审查委员会批准的患者同意下收集的公开数据。

数据由以下机构委员会批准：三星医疗中心机构审查委员会，并获得书面知情同意书（IRB 2005-12-034），大学健康网络研究伦理委员会，四个机构的机构审查委员会（密歇根大学癌症中心（UM），莫菲特癌症中心（HLM）、斯隆-凯特琳纪念癌症中心（MSK）和达纳-法伯癌症研究所（CAN/DF））、日本东京国家癌症中心机构审查委员会、乌普萨拉地区伦理审查委员会，参考号2006/325，林科平地区伦理审查理事会，参考号2010/44-31，大学卫生网络研究伦理委员会（UHN181），本研究伦理声明中使用的TCGA数据如下：所有样本均取自相关机构审查委员会适当同意的患者。

基金

这项工作得到了丹麦独立研究委员会的支持[09-073053/FSS]；乳腺癌研究基金会、匈牙利Széchenyi计划[KTIA_NAP_13-2014-0021]、2013年MTA归巢计划、MTA-TKI643/2012和Novo Nordisk基金会[致ZS]；丹麦癌症协会（Danish Cancer Society）将R72-R90-A6213（发给MK]）和A4618-13-S2（发给ACE]）以及2011年MTA Momentum Program（发给DS）。

缩写

中央对手方清算所	细胞周期进展（特征）
CIN公司	染色体不稳定性（特征）
ESLA公司	早期肺腺癌（特征性）
地理位置	基因表达综合
LUAD公司	肺腺癌
LUSC公司	肺鳞状细胞癌
非小细胞肺癌	非小肺癌
操作系统	总生存率
聚合酶链反应	聚合酶链反应
RFS公司	无复发生存

其他文件

附加文件1：图S1A。^{（21K，pdf）}

TCGA LUAD RNAseq−阶段I和II ESLA−7，DFS。图S1B：TCGA LUAD RNAseq−第一和第二阶段ESLA−7，DFS−无治疗。图S1C：TCGA LUAD RNAseq−第一和第二阶段CIN25，DFS。图S1D：TCGA LUAD RNAseq−I期和II期CIN25，DFS−无治疗。图S1E：TCGA LUAD RNAseq−CCP第一和第二阶段，DFS。图S1F：TCGA LUAD RNAseq−CCP I期和II期，DFS−无治疗。（PDF 20 kb）

附加文件2：表S1。^{（60K，docx）}

ESLA-7在选定肺鳞状细胞数据集中的表现。根据ESLA-7得分进行中位数分割*p≤0.05，**p≤0.01，****p≤0.001。（DOCX 59 kb）

附加文件3：^{（124K，文本）}

TCGA LUSC临床数据。（发送124 kb）

附加文件4：图S2。^{（57K，pdf）}

GSE8894 NSCLC Adeno未经治疗。（PDF 11 kb）

脚注

竞争性利益

ACE和ZS是本文提到的CIN25染色体不稳定性特征相关专利的发明者。对于其余的作者，没有宣布。

作者的贡献

MK和ZS设计了这项研究。MK、ACE和ZS进行了分析。MK、ZS、JM、DS和ACE撰写了手稿。DS、JM对手稿的批判性审查做出了贡献。所有作者阅读并批准了最终手稿。

参与者信息

马金·克兹斯坦尼克（Marcin Krzystanek），电子邮件：kd.utd.sbc@尼克拉姆.

朱迪特·莫尔德维，电子邮件：yavdlomrd的liamtoh部长.

David Szüts，电子邮件：uh-atm.ktt@divad.stuzs网址.

佐尔坦·萨拉西，电子邮件：ude.dravrah.snerdlihc@isalazs.natloz.

Aron Charles Eklund，电子邮件：kd.utd.sbc@dnulke.

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文章来自生物标记物研究由以下人员提供BMC公司