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单元格。作者手稿；2017年2月11日，PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2016年2月11日；164(4): 681–694.
在线发布2016年2月4日。 数字对象标识：2016年10月10日/j.cell.2015.12.034
预防性维修识别码：项目经理4752889
NIHMSID公司：NIHMS747747号
PMID：26853473

人体肺部肿瘤的代谢异质性

克里斯托弗·汉斯莱,1 布兰登·福伯特,1 清远,2 纳马·列夫·科汉,11 金恩秀,三，4 吉延·金,1 雷江,1 Bookyung Ko公司,1 雷切尔·斯凯尔顿,5 劳林·劳达特,5 米歇尔·沃扎克,12 克莱尔·克里姆科,1 伊丽莎白·麦克米兰,6 亚斯米恩·布特,7 最小Ni,1 德怀特·奥利弗,7 何塞·托雷尔巴,7 克雷格·R·马洛伊,2,三，4 坎普·克恩斯廷,8 罗伯特·伦金斯基,2,三和拉尔夫·德贝拉迪尼斯1中，9,10,*
作者信息 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

非小细胞肺癌（NSCLC）在影响细胞代谢的遗传和环境参数方面存在异质性。在这里，我们评估了这些因素对人类非小细胞肺癌代谢的影响体内使用术中139例非小细胞肺癌患者输注C-葡萄糖，比较肿瘤和良性肺的代谢。虽然糖酵解和葡萄糖氧化增强在这些肿瘤中很常见，但我们观察到有证据表明，每种肿瘤中都有多种营养物质被氧化，包括乳酸作为潜在碳源。此外，在肿瘤内部和肿瘤之间发现了代谢异质性区域，令人惊讶的是，我们的数据表明非葡萄糖营养素对灌注良好的肿瘤区域有潜在贡献。我们的发现不仅证明了肿瘤代谢的异质性体内而且还突出了微环境对这一特征的强烈影响。

简介

相对于良性组织，肿瘤表现出代谢改变(Hanahan和Weinberg，2011年). 这些变化通过提供能量、大分子前体和减少当量来支持恶性细胞的异常生存和生长(DeBerardinis等人，2008年). 除了代谢重编程对癌症生物学的重要性外，它还对临床肿瘤学有影响。针对关键代谢活动是一种有效的治疗方法(Vander Heiden，2011年)以及对代谢的信息方面进行成像的能力，使得非侵入性地识别和表征恶性组织成为可能。最广泛使用的代谢成像形式是18氟-2-脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET），利用肿瘤中葡萄糖摄取增强(Fletcher等人，2008年).

代谢基因表达和代谢组学已被用于确定来自同一器官的单个人类肿瘤的亚类(Caro等人，2012年;Terunuma等人，2014年)但尚不清楚这些差异是否反映了代谢活动的真正变化体内肿瘤代谢受细胞内因子和外源性因子的不明确组合调节。癌基因的表达足以对营养利用的某些方面进行重新编程，这表明细胞的自主代谢部分由癌基因型驱动(Gao等人，2009年;Ji等人，2007年;Son等人，2013年). 肿瘤血管异常引起的灌注改变被认为是通过影响氧和底物传递而导致新陈代谢的主要外在驱动因素(Guillaumond等人，2013年). 其他外在影响包括基质细胞、免疫细胞和肿瘤细胞之间的代谢竞争或合作(Pavlides等人，2009年;Sonveaux等人，2008年). 除了肿瘤基因型带来的复杂性外，对肿瘤代谢的全面解释还需要考虑外部影响。

肿瘤微环境很难建模体外这限制了基于培养系统推断完整肿瘤代谢的使用。稳定同位素（例如。13C） 被广泛用于研究细胞代谢，因为13标记营养素下游的C富集编码有关途径活性的信息(Buescher等人，2015年). 安全13C使这种方法在人类中可行。一些研究提供了13癌症患者肿瘤切除期间的C-标记营养素，然后进行分析13从肿瘤中提取的代谢物中富集C。在胶质瘤和脑转移瘤中，注射[U-13C] 葡萄糖通过糖酵解和TCA循环显示葡萄糖代谢(Maher等人，2012年). 在NSCLC中，引入[U-13C] 葡萄糖团块显示糖酵解和TCA循环代谢在肿瘤中都很活跃(Fan等人，2009年). 丙酮酸羧化酶（PC）是一种将丙酮酸转化为草酰乙酸（OAA）的酶，在非小细胞肺癌中高度表达，并有助于区分肿瘤和肺(Sellers等人，2015年).

这些报告都没有评估肿瘤内部或肿瘤之间的异质性，也没有评估细胞外因子对代谢的影响。在这里，我们结合了临床影像学来提供9名未经治疗的非小细胞肺癌患者的糖代谢和肿瘤环境的定量信息。我们证明这些肿瘤在葡萄糖利用方面是异质性的，并且可以通过术前评估组织灌注来预测肿瘤之间和肿瘤内部的代谢异质性区域。

结果

术前成像、术中成像的工作流程13C-葡萄糖输注和样品选择

手术前，通过FDG-PET和多参数MRI（mpMRI）评估肿瘤(图1A). MpMRI包括解剖的T2加权成像；扩散加权成像（DWI）用于确定表观扩散系数（ADC），作为细胞度的替代物；和动态对比增强MRI（DCE-MRI），其测量对比剂的时间依赖性进入，并用于评估灌注(Koh和Collins，2007年;扬基洛夫和戈尔，2009年). 研究团队、外科医生和放射科医生参加了多学科会议，讨论图像和组织采样计划。手术当天，患者的每只手臂都放置了一根静脉导管。其中一个用于输送8克[U-13C] 葡萄糖超过10分钟，然后连续输注8克/小时，平均持续3小时，直到进行肺叶切除术。另一个用于提取血样以进行分析13血浆葡萄糖中C的富集。这种方法实现了高浓度血糖的持续状态(Maher等人，2012年). 切除肺叶后，组织定位以确定解剖标志，并进行解剖，以获得手术前成像优先考虑的特定碎片。对碎片进行冲洗、冷冻，并进行组织学、分子和代谢分析。

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图像引导评估人类非小细胞肺癌的糖代谢

（A） 临床研究工作流程。

（B） 患者1的术前成像。注册前获得FDG-PET/CT，所有MRI均在一次疗程内完成。箭头表示3级腺癌。

（C） [U期间的血糖升高-13C] 葡萄糖输注。箭头指示切除的时间。

（D） 组织学特征。比例尺，200μm。

（E） 糖酵解和TCA循环代谢物的相对分数富集。肿瘤值被归一化为相邻肺的值，其赋值为1.0。

缩写：FDG-PET/CT、氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描术/计算机断层扫描术；DWI，扩散加权成像；动态对比增强DCE；ADC，表观扩散系数；H/E、苏木精/曙红；Ac-CoA，乙酰-CoA；乳酸脱氢酶；PDH，丙酮酸脱氢酶。

图像和13来自一名59岁女性吸烟者的C数据显示患有3级腺癌（患者1）图1B-E这个肿瘤超过22厘米三并热衷于FDG-PET，展示了异质FDG信号和SUV最大值>10 (图1B,表1). 2小时血糖浓度超过30%(图1C). 组织学显示肿瘤有丰富的Ki67染色，Ki67是细胞增殖的标志，CD31是肿瘤血管的标志(图1D). 代谢产物从肺和FDG-avid、ADC-low（即高细胞）肿瘤片段中提取。直观显示如何13比较肿瘤和肺部的C标记，显示了几种代谢物的平均相对富集分数（即肿瘤富集分数/肺部富集分数）。葡萄糖和糖酵解中间体3-磷酸甘油酯（3-PG）在肿瘤中的富集分数稍低，但所有其他葡萄糖衍生代谢物，包括乳酸和TCA环衍生中间体（柠檬酸、谷氨酸和苹果酸）在肿瘤内富集程度更高(图1E; 满的13C分布图S1). 因此，在该肿瘤中，FDG的高摄取与葡萄糖对乳酸和TCA循环中间产物的贡献增加相关。

表1

来自9名非小细胞肺癌患者的临床和病理数据。

第。年龄性别吸烟大小组织学TNM阶段等级%基质MVD公司MIB-1型表皮生长因子受体克拉斯标准摄取值
159F类2022.2ADC（固体）pT2aN0MX型G3（G3）208238ND（无损检测）G12C系列10.2
274F类451.6ADC（交流）pT1apN0MX型G1号5018017ND（无损检测）Q61H问题不适用
三55F类104.9LCNEC公司pT1bpN0pMX第四集团不适用不适用80ND（无损检测）ND（无损检测）8.9
473F类05.4模数转换器（pap）pT2aN0MX型G2级401646N771GY系列ND（无损检测）4.7
563M（M）010.1ADC（交流）pT2aN0MX型G2级401674L858R型ND（无损检测）5.1
681M（M）12015.5模数转换器（峰值）pT2aN0MX型G2级2021519L858R型ND（无损检测）32
782M（M）3010.2SQCC公司cT1bN0M0型G3（G3）2014225ND（无损检测）ND（无损检测）8.3
866F类016.1ADC（交流/功率因数）pT2aNpN1MXG2级302145L858R型ND（无损检测）13.3
943M（M）03.8ADC（混合）pt1bN0MX型G2级202546ND（无损检测）ND（无损检测）2.5

吸烟反映了每包年的吸烟史（平均每包/天x年吸烟）。肿瘤大小以厘米为单位三T2 MRI测量。组织学关键：ADC，腺癌；ac，腺泡；乳头状；大细胞神经内分泌癌；鳞状细胞癌。TNM分期关键：T1a，最大尺寸≤2cm；T1b，最大尺寸>2cm但≤3cm；T2a，最大尺寸>3cm但≤5cm；N0，无区域性淋巴结转移；N1，同侧支气管周围和/或同侧肺门淋巴结转移；MX，远处转移未知；M0，无远处转移。肿瘤分级关键：G1，分化良好；G2，中度分化。G3，分化差；G4，未分化。%基质来源于非肿瘤细胞所占面积的半定量评估。微血管密度（MVD）报告为血管数量*10−6/微米2CD31 IHC检测到血管。MIB-1是核Ki67染色的细胞部分。ND，未检测到突变。NA、组织或图像不可用。

[U的团注和连续输注的比较-13C] 葡萄糖给药

管理13C葡萄糖作为一种或多种药丸而不是连续输注已被用于评估人类和小鼠的肿瘤代谢(Fan等人，2009年;Sellers等人，2015年;Yueva等人，2012年). Bolus具有降低成本和易于管理的优点。另一方面，输液可能会改善13C信号，更好地评估需要持久性的复杂路径13C暴露，以及实现同位素稳定状态以简化分析的可能性(Marin-Valencia等人，2012年). 由于标签不仅取决于进入路线，而且还取决于循环旋转的次数，因此对TCA循环的分析变得复杂。为了比较这些方法，我们评估了从短期和长期的13C暴露。患者2服用8g[U-13C] 葡萄糖，随后不久切除。这导致葡萄糖浓度迅速升高，但循环中没有平台(图S2A). 患者3在麻醉前服用8g丸，然后在手术前一小时服用另一8g丸(图S2B). 与患者1一样，肿瘤中乳酸（M+3）和TCA循环中间产物（M+2柠檬酸、谷氨酸和苹果酸）的富集程度高于患者2和3的肺部(图S2C). 患者1长时间输注并未改善这些物种的相对富集度，但患者2和3的绝对富集度较低，导致高阶标记信号不佳（例如柠檬酸盐和苹果酸盐中的M+3-4，图S2D、E). M+1同位素在持续性13C葡萄糖暴露；这种形式的标记可能出现在TCA循环的多次旋转之后(图S2F，G). 因此，弹丸足以检测到丰富的同位素，但会影响其他同位素的评估。出于这些原因，我们对4-9名患者进行了输液。

非小细胞肺癌患者厌氧和需氧葡萄糖代谢增强

表1和图S3包含9名患者的临床和组织学信息。肿瘤的TNM分期、分级和SUV均不均一最大值.的分子分析表皮生长因子受体和克拉斯显示表皮生长因子受体四名患者和克拉斯突变2例；三个肿瘤都没有基因突变。肿瘤还显示了广泛的基质含量、微血管密度和MIB-1分数(表1). 血浆葡萄糖浓度的增加表明13由于丸剂导致的C部分富集，随后在输注过程中出现平台(图S4). 完成13所有组织碎片的C同位素都在表S1。显示了几种信息代谢物的相对分数富集度（平均值为图2A和中单个片段的数据图2B). 所有肺样本都显示糖酵解和TCA循环的中间产物富集，表明良性肺使用这两种途径(表S1). 这些中间体在所有肿瘤中也被标记。重要的是，尽管13C标记，患者之间的变异性远远超过从同一肿瘤中获得的独立样本之间的变异，表明该技术检测人类肿瘤代谢中的生物变异(图2C).

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与邻近肺相比，人类非小细胞肺癌肿瘤增强了厌氧和需氧代谢

（A） 9名患者的平均相对富集度（肿瘤/肺）。使用每个肿瘤的一个片段确定平均值。乙酰辅酶A没有直接测量，而是从其他13使用tcaSIM.*的C浓缩数据，经Student配对t检验，p<0.05

（B） 所有9名患者的单个片段相对富集（肿瘤/肺）。注意，对于大多数肿瘤，分析了几个片段。患者2中未检测到谷氨酸。

（C） 所有标准偏差（SD）的密度图13来自肿瘤同一局部区域（重复之间的SD）或所有区域的C富集13来自不同肿瘤的C富集（肿瘤之间的SD）。所有部分富集首先根据组织葡萄糖富集进行标准化。

尽管事实上所有肿瘤都显示PET摄取FDG，但正如之前报道的那样，肿瘤中葡萄糖的平均富集分数低于肺部(Fan等人，2009年). 相比之下，肿瘤碎片中的乳酸含量更高，表明转化[U-13C] 葡萄糖对[U-13C] 乳酸含量高于非癌肺。与TCA循环有关的几种代谢物（例如乙酰辅酶A、柠檬酸、谷氨酸和苹果酸的M+2同位素）在肿瘤中也更富集(图2A、B).

虽然这些M+2富集可能反映了标签通过丙酮酸脱氢酶（PDH）反应进入TCA循环，但质谱法不能提供位置信息13C信息。这可能会混淆MS同位素定性评估的解释，尤其是当总体富集度较低时。因此，柠檬酸盐等中的M+2同位素可能反映了周期第一轮、周期多轮或PC-依赖性进入和多轮的联合效应期间PDH-依赖性标记。为了限制解释数据所需的假设，我们通过13C核磁共振波谱，明确指定13C位置。这些光谱显示谷氨酸的碳4存在显著的4-5倍，这种模式需要PDH活性。这种双重病变在肿瘤中比在肺部更为突出(图3A,5安)与C4单峰相关的4-5倍体标记与M+2在柠檬酸盐和谷氨酸盐中的富集分数高度相关(图3B). 这些观察结果表明，肿瘤中增强的TCA循环标记反映了均匀标记的乙酰辅酶A通过PDH进入循环。乳酸M+3和柠檬酸M+2的质量同位素之间以及柠檬酸M+2和苹果酸M+2中的强相关性表明，糖酵解、PDH和TCA循环活性在肿瘤中相关(图3C). 排除人为通货膨胀13代谢物池消耗的C标记(Buescher等人，2015年)，我们还分析了代谢物的丰度。肿瘤中葡萄糖含量较低，乳酸含量较高，TCA循环中间体没有显示出一致的趋势(图S5B、C). 因此，与邻近肺相比，人类非小细胞肺癌肿瘤通过PDH和TCA循环的碳流增强。

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人类非小细胞肺癌相对于邻近肺组织PDH依赖性TCA循环流量增加

（A） 患者4的肺部和肿瘤核磁共振波谱。插图显示了乳酸C2（LAC2）和谷氨酸C4（GLU4）的多重波的扩张。GLN，谷氨酰胺；ALA，丙氨酸；TAU，牛磺酸；GLY，甘氨酸；天冬氨酸；SUC，琥珀酸；S、 单线；D、 双股；Q、 四重奏（双人对唱）。

（B） 所有片段中NMR衍生标记特征和GC/MS衍生标记特征之间的相关性，使用这两种技术都可以获得这些片段的数据。数据来自5名患者的10个肿瘤碎片和7个肺碎片。Cit，柠檬酸盐；谷氨酸、谷氨酸。

（C） 34个肿瘤和9个肺碎片的选定质量同位素之间的相关图。

（D） 说明M+3物种在[U期间起源的示踪方案-13C] 葡萄糖输注，与邻近肺部的所有肿瘤碎片测量值的平均值和标准差。

（E） 与TCA循环转换标记方案相关的同位素平均相对富集分数（肿瘤/肺）图S2F.

（F） 使用tcaSIM估算PDH和PC的通量。CS，柠檬酸合成酶。

*经Student配对t检验（D、E、F），p<0.05。

肺肿瘤中PC的表达增加，并且有证据表明通过这种补体酶的通量增加，通过定性评估13C富集(Sellers等人，2015年). PC转换器[U-13C] 丙酮酸生成OAA M+3，与未标记的乙酰辅酶A缩合生成柠檬酸M+3并与苹果酸平衡生成苹果酸M+3。肿瘤中苹果酸、柠檬酸和谷氨酸M+3的分数富集度高于肺部(图3D)尽管这些物种的绝对丰度远低于PDH衍生同位素(表S1). 柠檬酸M+5是OAA M+3和乙酰-CoA M+2的缩合产物，几乎无法检测到，可能是因为OAA和乙酰-Co A的绝对富集度较低。通过分析柠檬酸盐M+1和苹果酸M+1的分数富集度来评估TCA循环周转率，这两种物质在肿瘤中均过度表达(图3E). 因此，M+2同位素的显著性并不是周期更替减少的产物。

为了将分析扩展到定性评估之外，我们使用了tcaSIM，这是一种模拟代谢网络的计算工具，涉及糖酵解、TCA循环、脂肪酸氧化、回补和其他活动。稳态输注而非团注所提供的更高、更复杂的标记数据增强了该工具的实用性。tcaSIM可用于识别相对通量，该相对通量最能解释同时从多个代谢物获得的实验标记数据。这种方法避免了与简单的定性分析相关的陷阱，例如增强13TCA循环中间体中的C标记源于上游代谢物的高富集，而不是真诚地通量变化。建模表明，与作为参考的柠檬酸合成酶通量相比，肿瘤中的PC和PDH通量均升高。肿瘤和正常肺中PDH而非PC主导丙酮酸进入TCA循环(图3F). PDH通量的大小与MIB-1分数呈正相关(图S5D).

人类和小鼠非小细胞肺癌对乳酸利用的证据

虽然乙酰辅酶A在肿瘤中的富集程度高于肺(图2A)，绝对富集度低(图4A). 这促使我们研究其他血液代谢产物是否有助于肿瘤代谢。乳酸循环水平为1-2 mM，在某些条件下是癌细胞的燃料(Guillaumond等人，2013年;Kennedy等人，2013年;Sonveaux等人，2008年). 为了研究循环乳酸对肿瘤代谢的影响，我们首先比较了所有患者肿瘤和肺中乳酸、糖酵解中间产物3-PG和PEP的富集分数。在肺部碎片中，3-PG和PEP的富集与乳酸的富集相似，乳酸M+3与3-PG或PEP M+3的平均比值几乎正好为1.0(图4B). 如果乳酸是由肺中的糖酵解产生的，这是可以预料的。相反，许多肿瘤碎片中乳酸的富集超过了3PG或PEP的富集(表S1)平均乳酸M+3超过3-PG或PEP M+3约40%(图4B). 过量标记也传播到TCA循环中，因为肿瘤中柠檬酸盐M+2与3-PG或PEP M+3的富集比率较高(图4B). 这些发现表明，额外的标记底物有助于肿瘤乳酸。最明显的候选者是乳酸本身，因为从血浆中输入的乳酸将供给肿瘤乳酸池，并为TCA循环提供碳(图4C). 的确，[U-13C] 葡萄糖输注导致可测量的循环量[U-13C] 乳酸(图4D,表S1). 由于血浆和肿瘤中的乳酸富集度均低于葡萄糖富集度13肿瘤中的C-乳酸会稀释乙酰辅酶A和其他与肿瘤葡萄糖富集相关的代谢物的富集。鉴于我们通过核磁共振证实M+2同位素主要反映了[U的进入和通过-13C] 在TCA循环中，如果TCA循环中间产物的M+2富集分数超过3-PG和PEP中的M+3，这将与乳酸对TCA循环代谢的贡献相一致。在一些患者中观察到这种关系，包括患者1(图4E,表S1). 其他人如患者5表现出从葡萄糖到所有下游中间产物的标记逐渐下降的模式，类似于肺(图4E). 这些数据表明，一些人类肺部肿瘤可能使用乳酸作为碳源。

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人和小鼠非小细胞肺癌的乳酸代谢

（A） 肿瘤和肺中葡萄糖（M+6）和乙酰辅酶A（M+2）主要标记形式的比较。数据是所有碎片的平均值和S.D.，不包括坏死肿瘤碎片。*=肿瘤和肺乙酰辅酶A富集之间的p＜0.05（配对Student t检验）。

（B） 肺和肿瘤中乳酸和柠檬酸盐与糖酵解中间体3-PG和PEP的标记比率。数据是所有碎片的平均值和S.D.，不包括坏死肿瘤碎片。*，p<0.05；***，p<0.005（配对学生t检验）。

（C） 图示糖酵解和乳酸输入引起的肿瘤乳酸池的示踪方案。

（D） 患者1和5的葡萄糖M+6和乳酸M+3的血浆富集。

（E） 患者1和患者5的肿瘤碎片中信息质量同位素的富集百分比（每个患者一个碎片）。绿色实线表示葡萄糖M+6在血浆中的富集，橙色虚线表示每个患者血浆中的乳酸M+3富集，如图D所示。

（F） 示踪剂方案说明[2]-13C] 给荷瘤小鼠输注乳酸。

（G）顶部，[2期间血浆中乳酸M+1的富集-13C] 给四只小鼠输注乳酸，每只小鼠接受A549或HCC827异种移植物。底部，输注[2后肿瘤代谢物的分数富集-13C] 乳酸。数据是每个细胞系四个肿瘤的平均值和S.D，p<0.05（A549）；**，p<0.01（A549）；#，p<0.05（HCC827）（与3-PG的单因素方差分析比较）。

为了直接检测乳酸代谢，小鼠皮下移植了来自突变细胞系的异种乳酸克拉斯（A549细胞，G12S突变）或表皮生长因子受体（HCC827细胞，E746-A750缺失）注入[2-13C] 乳酸。这导致循环乳酸池快速而持续地富集(图4G)，并将葡萄糖中的一些富集物作为乳酸用作糖异生前体(图4F). 这些肿瘤中的乳酸被显著标记(图4G). 柠檬酸、苹果酸和谷氨酸的富集程度超过了3-PG的富集程度，表明这些代谢物含有13C来自进口乳酸盐，而不是来自标记的葡萄糖。

MRI灌注标记物预测单个NSCLC肿瘤的葡萄糖代谢程度不均匀

肿瘤之间广泛的代谢异质性促使对调节葡萄糖代谢的因素进行检查。所有患者DCE MRI数据的可用性为检查灌注对肿瘤代谢的影响提供了机会。我们首先通过手动绘制选择用于肿瘤最大直径的切片的感兴趣区域（ROI）来评估DCE图像的平均信号强度。DCE定性评估很容易将肿瘤分为两类，其中一些肿瘤表现出较高的时间依赖性对比度增强，其余肿瘤表现出较低的增强(图5A). DCE数据也作为对比剂给药60秒后曲线下的初始区域进行分析（iAUC60，图5B). 此前已证明该参数在人类非小细胞肺癌中至少一周内是稳定的(Ng等人，2010年)类似于我们的患者从成像到切除的时间间隔（1-8天）。部分富集分析显示，灌注良好的肿瘤的代谢产物与邻近肺几乎无法区分，而iAUC60值较低的肿瘤平均富集程度高于良性肺或iAUC6值较高的肿瘤(图5C). 建模13C富集数据显示，在低对比度增强的肿瘤中，PDH通量大约高出三倍，而两组之间的PC通量没有差异(图5D).

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DCE MRI识别非小细胞肺癌的异质性葡萄糖代谢区域

（A） 从每个肿瘤的最大直径区域获取DCE数据。肿瘤可以很容易地分为DCE信号较高和较低的两组。

（B） 图5A中时间过程的前60秒（iAUC60）曲线下的初始面积。这种DCE的半定量标记物也会产生两组不同的肿瘤。数据为研究中所有肿瘤的平均值和S.D。

（C） 糖酵解（3-PG和乳酸M+3）、PDH和第一个TCA循环周期（柠檬酸、谷氨酸和苹果酸M+2）、TCA循环后续周期（苹果酸和柠檬酸M+1）和PC活性（苹果酸与柠檬酸M+3。数据是所有肿瘤碎片的平均值和S.D。

（D） PDH和PC的通量使用tcaSIM建模。数据是所有肿瘤碎片的平均值和S.D。

（E）顶部，腺癌的矢状面预对比图像（患者8）。通过DCE MRI评估并取样进行代谢分析的区域显示出来。底部、肿瘤上下侧面的DCE曲线。这些曲线绘制了伽马变量函数的平均值，该函数适合每个感兴趣区域的三个不同切片。

（F） 糖酵解（3-PG和乳酸M+3）、PDH和第一个TCA循环转折（柠檬酸、谷氨酸和苹果酸M+2）相关同位素的相对富集分数（肿瘤/肺）。数据是来自肿瘤上下两个方面的三个片段的平均值和S.D。

*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.005，学生未配对t检验。

为了测试单个肿瘤中是否存在代谢异质性区域，我们使用DCE MRI确定差异对比度增强的解剖区域，然后从同一肿瘤中选择高对比度和低对比度吸收区域进行代谢物提取和13C富集分析。患者8是一名非吸烟者表皮生长因子受体-变异腺癌16.1厘米三和一辆高级SUV最大值(图5E,表1). 尽管对肿瘤整体的DCE MRI分析表明这是一个灌注良好的肿块(图5A)，DCE特征在上下区域之间有显著差异(图5E). 从优势和劣势方面获得的片段被分割成三个较小的片段，提取并分析13C富集。肿瘤灌注不良的下半部分的富集程度明显高于上半部分(图5F). 核磁共振波谱和质谱数据建模都证实了肿瘤这两个区域的差异代谢(图S6). 患者9有3.8厘米三SUV低的腺癌最大值(表1)以及整个DCE信号相对较差(图5A). 然而，检测到细微的差异，表明与内侧区域相比，后部信号略微增强(图S7A、B). 与患者8的更大和更多FDG-avid肿瘤一样，从这两个区域分离的片段在13C富集，DCE信号较高的区域显示13C乳酸、柠檬酸盐和其他代谢产物的富集(图S7C). 因此，基于DCE的灌注评估预测了葡萄糖在临床相关灌注范围和SUV范围内对中枢代谢的贡献程度最大值.

为了更深入地了解DCE表型和代谢之间的关系，对几种肿瘤的片段进行了RNA测序。然后，利用所有检测到的转录物或2756个代谢相关基因的子集，根据基因表达特征对片段进行聚类(图6A)(波塞马托等人，2011年). 在这两种非监督分析中，碎片都没有根据灌注表型分离。然而，基因集富集分析（GSEA）显示，在低DCE信号片段中，与糖酵解、氧化磷酸化和TCA循环相关的基因表达增强，而高DCE信号的片段富集了与其他营养素相关的基因，20个富含most的基因中有许多与溶酶体和氨基酸代谢有关(图6B、C). 因此，差异DCE信号区显示出基因表达模式的改变以及葡萄糖衍生碳供应中枢代谢的利用改变。

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高、低DCE信号肿瘤的基因表达特征

（A） 肿瘤片段RNA-Seq数据的无监督聚类。数据包括所有检测到的转录物（左）或2756个参与代谢的基因转录物子集的定量。

（B） GSEA使用代谢基因转录物的结果。高DCE组和低DCE组显示了20个最丰富的基因集。

（C） 低DCE肿瘤中富集的三个基因集的GSEA图。

（D） 非小细胞肺癌肿瘤中替代燃料利用的建议模型，存在灌注区域差异。

讨论

这里我们耦合了[U-13C] 用FDG-PET和mpMRI进行葡萄糖输注，以评估非小细胞肺癌患者的葡萄糖命运，将代谢与邻近肺进行比较，并确定预测代谢的肿瘤生物学方面体内我们的工作扩展了最近利用同位素示踪剂分析人类肿瘤代谢的其他工作。特别是，之前的两项研究使用了13切除术前C-葡萄糖评估非小细胞肺癌代谢(Fan等人，2009年;Sellers等人，2015年). 与他们一样，我们观察到肿瘤中糖酵解和TCA循环活性增强的证据，并得出结论，丙酮酸羧基化增强可将NSCLC与肺区分开来。我们的工作在几个方面对这些研究进行了补充。首先，我们报告了研究中肿瘤的分子和组织学特征。这使我们能够证明，在不同的组织学亚型和癌基因型中观察到葡萄糖氧化增强。其次，我们对持续暴露于循环中的连续同位素源后的葡萄糖代谢进行了计算评估。最终，这提供了有关碳进入TCA循环和TCA循环处理的信息，以及对葡萄糖和其他燃料提供氧化代谢的程度的评估。第三，将多模态成像与13C衍生数据使我们能够将代谢标记物与其他生物学特征进行比较，尤其是组织灌注。由于怀疑这些特征会影响代谢，我们的方法提供了有关人类非小细胞肺癌代谢复杂性驱动因素的信息。

这些人体研究的一些实用性值得一提。手术过程要求在切除病变肺叶之前结扎肺动脉15-30分钟。在此期间，肺叶和肿瘤依靠支气管和侧支循环进行营养输送。证据表明，这并没有显著改变肿瘤的氧合状态。支气管循环携带高氧血液，对非小细胞肺癌总血流量的贡献大于肺循环(Nguyen Kim等人，2015年). 检查13C标记表明TCA循环代谢增强而非抑制的特征，反对严重的氧限制。这些标记物即使在结扎持续数小时的偶发患者（未显示）中也持续存在。因此，尽管肺动脉结扎可能会减少总血流量，但这并不能阻止组织参与氧化代谢。

技术限制是该方法需要足够大的片段来13C研究（~50 mg），不可避免地导致恶性细胞和基质细胞的混合。我们使用术前成像和肿瘤大体检查来选择主要由活细胞、恶性细胞和组织学组成的碎片来证实这一点。虽然单个肿瘤包含非恶性细胞的可变贡献，但队列中关键特征的一致性（例如TCA循环中间产物的增强标记）强烈暗示这些特征是恶性细胞的结果。此外，建模的某些方面假设每个片段在葡萄糖代谢方面具有同质性。虽然尚不清楚基质细胞在多大程度上影响片段内的代谢同质性，但我们注意到，标记的定性评估和模型乙酰辅酶A的富集非常一致。

尽管存在这些复杂性，但仍有可能得出几个结论。首先，数据强烈表明，相对于邻近的良性肺，非小细胞肺癌通过PDH和TCA循环的糖酵解和葡萄糖氧化增强。我们在两种基因突变的肿瘤中观察到这种表型表皮生长因子受体或克拉斯以及我们分子分析未检测到的其他致癌因素。目前，特定致癌突变的影响尚不清楚。虽然这两个克拉斯-突变肿瘤中13C标记，两者都有低DCE信号，独立预测高13整个组的C标签。总的印象是，多种致癌驱动因素可以指定葡萄糖强烈氧化的表型体内这与观察结果一致，即糖代谢增强是培养的癌细胞中许多致瘤突变的共同结果。然而，活肿瘤中糖酵解和葡萄糖氧化之间的关系尚难确定。普遍的看法是18FDG摄取意味着糖酵解增强和葡萄糖氧化抑制，类似于对Warburg效应的传统理解(沃堡，1956年). 我们的数据为非小细胞肺癌从氧化代谢到糖酵解代谢的“转换”概念提供了有力证据。研究中的几个肿瘤有SUV最大值值超过10，但没有证据表明葡萄糖氧化受到抑制。我们得出结论：18FDG-PET阳性的肺肿瘤提供增强的葡萄糖氧化。增加队列规模将有可能测试特定突变是否对葡萄糖代谢产生特定影响。

第二，输入13TCA循环中的C以PDH为主。在所有肿瘤中均观察到TCA循环代谢物的PDH依赖性标记，并且与良性肺相比平均增强。大多数癌细胞株也使用PDH从葡萄糖向TCA循环提供碳，尽管当培养中有其他营养物质时，这种酶对生存和增殖是不必要的(Rajagopalan等人，2015年). 在我们的队列中，PDH活性与Ki67染色相关，表明PDH在恶性细胞增殖中起作用。

第三，肿瘤表现出乙酰辅酶A相对于葡萄糖的低富集。这可能表明额外的底物进入葡萄糖和TCA循环之间的代谢网络。尽管葡萄糖是一种重要的能源，但新出现的证据表明，肿瘤细胞也会氧化其他营养物质，在某些情况下，可能更喜欢替代燃料而不是葡萄糖(2015年，自治区和德贝拉迪尼斯;Mashimo等人，2014年). 其他潜在碳源包括从细胞外空间清除的脂肪酸、氨基酸、酮类和大分子。我们的数据表明，乳酸通常被视为癌细胞的废物，可以被非小细胞肺癌组织用作呼吸基质。乳酸含量丰富，被单羧酸转运体（MCT）摄取，其中一些在非小细胞肺癌中表达(Eilertsen等人，2014年). 乳酸脱氢酶（LDH）催化NAD+/乳酸和丙酮酸之间的NADH依赖性交换。尽管所有LDH亚型都能双向催化这种反应，但含有B亚单位的亚型由低密度血红蛋白可能有利于乳酸转化为丙酮酸，并且在使用乳酸作为燃料的组织中高度表达。低密度血红蛋白在NSCLC肿瘤和细胞系的一个子集中高度表达，并与腺癌的低生存率相关(McClelland等人，2013年). 有人提出，乳酸被用作实体肿瘤灌注良好区域的呼吸底物，同一肿瘤灌注较少的区域将葡萄糖转化为乳酸并分泌出来(Sonveaux等人，2008年). 我们的数据没有记录乳酸净消耗量，也没有区分乳酸氧化的区域定位。然而，我们确实观察到，除[U-13C] 在DCE信号高的区域，葡萄糖对TCA循环的作用增强。数据表明，基于乳酸和其他燃料的PET探针有助于确定人类非小细胞肺癌的营养偏好，并确定癌基因型、微环境和其他因素对其的调节。

第四，一项关键发现是，DCE可以预测肿瘤之间的代谢变异性。DCE信号高的肿瘤在以下方面与正常肺相似13C富集，而信号较低的肿瘤通过PDH或PC增强了与TCA循环相关的几乎所有同位素。这意味着在人类NSCLC中观察到的主要代谢表型（增强13TCA循环中间产物的C标记）与灌注有关。目前尚不清楚灌注改变是否决定代谢活动，或者灌注减少和代谢改变是否发生在其他因素的平行下游。为了支持前一种假设，当考虑到低肿瘤乙酰辅酶A富集和RNA-Seq数据时13碳富集和DCE表明，灌注改变了各种燃料对TCA循环的贡献(图6D). 具体而言，高DCE肿瘤可能同时氧化多个底物，但如果低DCE肿瘤的灌注受损，葡萄糖对TCA循环的贡献相对于竞争底物增加。这可能只是反映了这样一个事实，即就每单位耗氧量产生的能量而言，葡萄糖超过脂肪和蛋白质，并且在灌注适度减少的状态下可能更可取。另一种但并非相互排斥的可能性是，在灌注减少的区域，不太丰富的营养物质会耗尽，而葡萄糖由于其高浓度和扩散性而仍然可用。为了解释肿瘤细胞和微环境之间的相互作用如何有利于嗜葡萄糖表型，提出了一个类似的假设(Gatenby和Gillies，2004年). 在这种情况下，可能需要增强葡萄糖代谢来提供能量和合成前体，以抵消循环中其他燃料和大分子可用性的降低。

我们利用DCE MRI良好的空间分辨率对单个肿瘤进行区域分析。这为实体肿瘤代谢通量的区域异质性提供了证据。值得注意的是，数据表明灌注的影响可能会覆盖肿瘤遗传所设定的固有代谢偏好。例如，患者8的肿瘤在表皮生长因子受体，但整个肿瘤的代谢活性与DCE表型相关，差异很大。一个新出现的关键问题是，代谢脆弱性是否在单个肿瘤中也表现出如此显著的区域异质性。这将对癌症代谢治疗的前景产生重大影响。

总之，我们报告了将临床成像和13人类癌症中的C富集。我们的数据表明，肿瘤代谢受微环境的显著和可预测的调节，并且可以在手术前确定代谢的局部变化。这种技术使样品采购成为一种合理的方法。鉴于癌细胞中环境特异性代谢途径的储备不断扩大(2015年，自治区和德贝拉迪尼斯)这将大大提高同位素示踪实验的信息产量。现在应该可以使用替代底物来识别和预选区域，以提供TCA循环，并测试与微环境和代谢偏好之间的相互作用相关的特定假设。由于DCE和mpMRI的其他采集方法适用于癌症小鼠模型，因此也可以在输液成本低、实验参数控制高的实验系统中使用此方法。

实验程序

其他详细信息见扩展实验程序

临床方案

9名未经治疗的非小细胞肺癌患者在获得知情同意后被纳入IRB方案。手术当天，[U-13C] 葡萄糖的引入如前所述(Maher等人，2012年). 遵循标准手术程序，大多数病例为机器人肺叶切除术。组织碎片立即在液氮中冷冻。病理学家在不了解代谢结果的情况下进行组织学分析。第18–21外显子表皮生长因子受体使用实验室开发的引物进行双向Sanger测序。突变分析克拉斯密码子12、13、61和146在Sequenom Mass ARRAY系统（MALDI-TOF）上手动调用。

多参数磁共振成像（mpMRI）

术前8天或更短时间内发生MRI。冠状动脉和轴向T2加权图像用于定位病变并获取测量值。DCE和DWI在同一检查中进行。

质谱和核磁共振光谱

如前所述，在输液过程中获得的血液用于测量血糖浓度(Maher等人，2012年). 将组织样品（50–100mg）添加到50:50甲醇：水中进行提取。按照所述进行GC/MS和NMR(Cheng等人，2011年;Maher等人，2012年).

小鼠研究

所有程序均由UT西南大学动物护理和使用委员会根据实验动物护理和使用指南将100万个A549或HCC827细胞注射到Ncr公司裸鼠。在输注之前，小鼠禁食16小时，然后在麻醉下将27号导管放置在尾侧静脉中。10%重量：重量的[2的水溶液-13C] 通过注射泵将乳酸（剑桥同位素实验室）注入120分钟，在10分钟内以150μl的速率注入，直到注入结束。定期采集约50μl的血样。在输液结束时对动物实施安乐死，然后采集肿瘤，用冷盐水短暂冲洗，并在液氮中冷冻。

RNA测序

将肿瘤样本均质并提取RNA。处理3μg RNA用于文库制备和测序。原始读取与人类基因组组装hg19对齐。一组2756个人类代谢基因(波塞马托等人，2011年)GSEA用于定义DCE信号高或低的样本之间的差异表达路径。RNA-seq数据保存在基因表达综合数据库中74484英镑.

统计

患者配对样本通过配对Student t检验进行分析。对比度增强和相对分数富集的肿瘤间分析通过非配对Student t检验进行分析。利用趋势线的皮尔逊生产-时刻相关系数对相关图进行分析。如果p<0.05，则认为所有数据均具有显著性。

补充材料

1

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2

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致谢

我们感谢John Minna、Joan Schiller和DeBerardinis实验室成员的有益讨论。这项工作得到了N.I.H.（R01 CA157996和CA157996-04S1、P50 CA70907、P41 EB015908和UL1 TR001105）、韦尔奇基金会（I-1733）、CPRIT（R-1107-02和RP130272）、加拿大卫生研究院（MFE 140911）和V基金会的资助。R.J.D.是Agios Pharmaceuticals和Peloton Therapeutics咨询委员会的成员。

脚注

作者贡献。R.J.D.、C.T.H.、R.E.L.和K.K.设计了这项研究。Q.Y.实施mpMRI采集技术，并协助患者进行MRI扫描。N.L.-C.、R.E.L.和C.T.H分析了成像数据。C.R.M.、J.K.、B.F.和L.J.对示踪剂分析提供了见解。B.F.和M.N.采集并分析了RNASeq数据。D.O.分析了肿瘤样本克拉斯和表皮生长因子受体突变。E.J.进行核磁共振。R.S.和L.L.管理临床方案并招募患者。K.K.进行了手术。M.W.和B.K.协助小鼠输液。E.M提供了统计援助。C.K.协助组织处理。Y.B.和J.T.分析了组织病理学标本。C.T.H.和B.F.处理、分析和解释了人类和小鼠的示踪数据。C.T.H.和R.J.D.撰写了这篇论文。

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