数学建模：需要的主要组件
我们的目的是在一个数学模型中解释不同葡萄糖和氧气介质浓度下实验观察到的生长模式。为此，我们首先搜索了一个最小模型（在摘要中指定的意义上）来解释[G]=25mM和[O]=0.28mM介质浓度下的实验肿瘤生长观察结果，然后逐步扩展该模型以捕捉其他增长条件（有关逐步模型开发策略的说明，请参见中的图S3S1文件). 我们根据公布的信息和自己的实验指导的先验知识来选择可能的控制机制。我们选择了最大葡萄糖和氧气培养基浓度的条件，因为[G]=25mM和[O]=28mM与[G]=5mM和[O]=28mM的生长动力学的相似性表明，对于前一种条件，葡萄糖和氧气都可能不受限制（另见讨论（见下文）。Freyer和Sutherland在几乎相同的氧气和葡萄糖培养基条件下（与[1]). 我们在每个模型开发步骤再次拟合所有参数。因此，本文中显示的拟合是我们可以为各个模型获得的最佳拟合。然而，由于搜索空间大，模拟时间至少为一天（参考计算机：Intel（R）Xeon（R）处理器X5680 3.33GHz 12M缓存6核和144 GB DDR3-RAM 1333 MHz），不能完全排除进一步的参数搜索可能会带来额外的轻微改进。为了提高可读性，我们列举了每个开发级别的模型。
通常，我们只对每个参数集进行单一模拟，即随机增长过程的单一实现。这可以通过观察生长过程（如实验中的大约10000个细胞）是自平衡的，因此相同参数下生长过程不同实现的变化可以忽略不计（图S11S1文件).
我们的基本模型在基于代理的模型中分别考虑每个单元，即每个单独的单元由代理表示。分子，最后是葡萄糖、氧气和乳酸，以及细胞外基质和濒死细胞释放的“废物”物质，以其局部浓度表示。我们在下文中使用“分子”一词来概括描述这些影响细胞的环境因素。模型是三维的。在以下部分中，我们将简要介绍主要模型组件。模型以及模拟的生物过程的详细描述可以在材料和方法部分以及支持信息中找到(S1文件).
细胞
细胞被建模为填充非结构化晶格位置的单个对象（见补充[25,47])格点上不超过一个细胞。细胞可能处于三种状态之一：增殖、静止或死亡。根据他们的状态和当地环境，他们能够进入或重新进入（G0）细胞周期、生长、迁移、死亡或进行裂解(). 每个过程都需要一组必要的条件，并以一定的速度执行。过程和速率都取决于细胞邻域和局部分子浓度（见下文）。细胞的时间动力学由一个“主方程”描述，该方程模拟了某一多细胞构型概率的时间演化。该方程用Gillespie算法进行了数值模拟（参见S1文件).
细胞状态和细胞可能经历的生物过程的模式：细胞周期（包括细胞生长和分裂）、迁移、细胞死亡（凋亡和坏死）和溶解。左面板：在细胞周期的一小部分转变后，一个循环细胞通过占据两个相邻的晶格点而生长。生长细胞可以将一定数量的细胞推到一边。细胞可以通过从一个晶格点跳到相邻晶格点来迁移。细胞死亡的速度k个脖子并因此以速率进行裂解k个赖氨酸（为清晰起见，左侧面板中的方案为2D；但模拟均为3D）。右：所有过程都建模为泊松过程。细胞周期中的细胞经历米d日直到分裂成两个子细胞。由米d日子进程-单元周期时间最终遵循Erlang分布。增加的米d日将导致更尖锐的细胞周期分布。细胞以速率从一个细胞周期状态（CCS）过渡到下一个k个div公司,米。如果单元格处于状态m克它会成长。如果它处于状态米d日在下一个过渡期，它将分裂成2个子细胞。此外，2个子单元将按概率比例进入第一个CCS第页div公司或与概率1−成比例的静止（G0）第页div公司.处于静止状态的细胞可以以速率重新进入细胞周期k个重新和概率第页重新.指示如何计算模型1-4的所有转换率和概率。
分子
对于每种分子类型，选择其浓度的连续表示法。其时空动力学由偏微分方程（PDE）建模。对于每个分子，该方程可以转化为反应扩散方程的形式
哪里t吨是时间，u个∈ {G公司,O（运行）,L（左）,发动机控制模块,W公司}是葡萄糖、氧气、乳酸、细胞外基质或废物的浓度，D类u个是各自的扩散系数，以及第页u个表示涉及以下反应的速率函数u个(=u个(第页,t吨)).第页表示空间中的位置。扩散系数和反应函数取决于局部细胞密度σ(第页,t吨) = ∑k个
δ(第页−第页k个),第页k个(t吨)是细胞的位置k个时间t吨反应对每种成分（分子或ECM）都是特定的：细胞消耗葡萄糖和氧气，并带有−第页G公司和−第页O（运行），乳酸由缺氧细胞产生第页L（左）ECM由细胞产生并以一定的速率分解，而废物则由染色细胞释放出来。
数学建模：尺度耦合与数据比较
从文献中获取或估计了一些与细胞或分子唯一相关的参数（例如分子扩散系数、消耗率、细胞周期时间分布）。其他可从本文中提供的数据直接推断（例如初始条件、细胞大小）或通过敏感性分析推断（例如细胞分裂、细胞死亡和裂解率）（参见S1文件). 识别耦合细胞和分子动力学的主要机制及其参数化（参见)将模型与下面解释的数据进行比较。
图中的标记模式和确认引言中讨论的边界距离相关的“分带”（也可进行比较[8]和). 在下文中，我们将研究细胞-细胞成分、细胞外基质和代谢化合物（营养物质/代谢物）的影响，以推断相应的模型机制。对于后者（代谢），我们将比较四种不同的假设（模型1-4）。用于计算过渡率和概率的方程摘要，如对于以下章节中研究的所有模型，可以在.
表2
模型1-4的转换率和概率。所有型号都有第页重新
k个重新= 0,k个恰当的=常数.和k个赖氨酸=常数共同点。过渡率k个div公司,米单个细胞周期步骤之间的关系由下式给出k个div公司,米=米d日
k个div公司。所有参数值均可在中的表S1中找到S1文件.
| 模型 | 第页div公司= | k个div公司= | k个nec公司= |
|---|
| 1 | e（电子）−L（左）/ΔL（左） |
|
|
| ⋅H（H）([发动机控制模块] − [发动机控制模块]最小值) | ⋅H（H）([G公司][O（运行）] −第页氧合glc) | ⋅H（H）(第页氧化葡萄糖−[G公司][O（运行）]) |
| 2 | e（电子）−L（左）/ΔL（左） |
|
|
| ⋅H（H）([发动机控制模块] − [发动机控制模块]最小值) |
|
|
| 三 | e（电子）−L（左）/ΔL（左） |
|
|
| ⋅H（H）([发动机控制模块] − [发动机控制模块]最小值) |
|
|
| | |
|
| 4 | e（电子）−L（左）/ΔL（左） |
|
|
| ⋅H（H）([发动机控制模块] − [发动机控制模块]最小值) |
|
|
|
| ⋅H（H）(1 − 0.5([W公司] − [W公司]最大值)) |
|
| | ⋅H（H）(1 − 0.5([O（运行）]最小值− [O（运行）])) | |
机械生长抑制：概率细胞决策
[G]=25mM和[G]=5mM的生长曲线和增殖曲线看起来非常相似，而[G]=25mM和[G]=5mM的坏死核在17天的大小看起来非常不同（图和). 对EMT6/Ro电池的数据进行了等效观察[14]模型模拟表明，增殖不受非葡萄糖相关因子的控制，而是受接触抑制的机械形式控制[1]. 否则，增生边缘和坏死区的大小都应该受到影响。用我们的晶格模型进行的模型模拟证实了这一发现。
在以前的文章中，接触抑制的生物力学形式被认为是一种决定性的决定，取决于不断增长的细胞群中的局部压力或变形([1,2,48–50]). 然而，从年非晶格模型中生长多细胞球体的模型研究可以看出[24]和[34]基于变形阈值的确定性准则能够在局部随机事件（如细胞微观运动或细胞周期持续时间的随机性）的影响下，产生分裂细胞分数的逐渐变化，这两者都会导致变形和机械应力的随机波动。如参考文献所示。([25,43])通过引入最大距离Δ，可以在晶格模型（如本文所选）中定性地捕获扩展的扩散边缘L（左），一个细胞能够在其上推开其他细胞以便生长。细胞进入细胞周期的概率可以定义如下
哪里H（H）是Heaviside函数，H（H）(x个)=如果x个< 0,H（H）(x个)=1，如果x个≥0，并且L（左）是到最近的自由晶格点的距离。
然而，如中所示（左图）引入这样一个锐利的截止线会导致外增殖边缘和内静止边缘之间相对尖锐的过渡，而实验剖面显示出一个宽的过渡区，细胞周期中的细胞频率逐渐发生变化。通过选择概率方法，可以在格子模型中获得平滑的实验观察到的跃迁，细胞进入细胞周期的概率随Δ呈指数递减L（左）(，左侧面板）：
第17天（红色）和第24天（绿色）[G]=25mM，[O]=0.28mM的Ki67阳性细胞的实验和模型预期分数（左侧）和IV型胶原（ECM）密度（右侧）vs.与球体表面的距离。细胞周期的确定性进展取决于细胞与表面的距离，它会产生实验上未观察到的急剧跃迁（左虚线），而概率跃迁则会在模拟中生成Ki67阳性细胞的平滑单调递减函数（左虚线）。此外，只有当ECM的局部浓度超过阈值时，细胞才能在细胞周期中进行[发动机控制模块]最小值，实验发现的Ki67剖面恢复（左，全线）。右实线：计算机模拟中的ECM浓度。
因此，细胞进入细胞周期的决定是随机的，这意味着距离边界相同的相邻细胞可能会表现出不同的行为。这会产生局部不均匀的细胞行为。细胞周期进展概率（3）在最外边界生成Ki67阳性细胞分数最高的轮廓。这种趋势是一种稳健的现象，在生长细胞种群的非格子模型中也可以发现，其中细胞周期的进展由变形或压力阈值控制([48,51]). 因此，我们得出结论，单靠变形或压力阈值对细胞周期进程的生物力学控制并不能解释多细胞球体边缘增殖下降的原因。
细胞外基质
实验数据表明边缘细胞的增殖活性低于内部细胞(，左面板），同时IV型胶原染色显示靠近球体边界的ECM浓度较低(; 右侧面板）。这表明ECM在细胞周期进程中的已知控制功能[50]可能是球体边缘增殖细胞比例较低的原因。观察到ECM结合和连接的整合素信号是增殖信号的重要组成部分，支持了这一假设([52,53]).
因此，我们假设细胞通过置换进入细胞周期需要最小密度的细胞外基质等式3通过
其中[发动机控制模块]反映ECM的本地集中度，以及[发动机控制模块]最小值是阈值（这些值没有维数，因为我们直接使用区间[0,1]中定义的荧光强度）。细胞外基质由每个细胞分泌，并以一定速度减少。选择[发动机控制模块]最小值=0.003，细胞外基质浓度表现为实验观察到的结果()模拟的增殖曲线与实验曲线吻合良好。
等式4决定每个子细胞分裂后直接进入细胞周期的概率。在大多数论文中，我们假设这个决定是不可逆的(第页重新=0英寸)但我们也考虑了退出G0的后果(第页重新>0英寸). 对于后者，我们测试了不同的替代规则（参见S1文件)可以由退出率的等式包含，第页(L（左）) =k个重新
第页重新(L（左）). 该方程假设细胞以速率探测k个重新概率发生的G0退出第页重新(L（左）). 时间间隔内发生入口的概率[t吨,t吨+ Δt吨)在深度L（左）(t吨)就是那个时候.以防第页重新功能形式为第页div公司在里面等式4，费率k个重新必须非常小，以便在数据和模型之间达成一致（中的图S4S1文件). 我们发现k个重新= 0.001/2.4小时（图S4英寸S1文件; 由提供等式4). 即，仅在100/第页重新特定单元格退出G0的平均天数。
我们进一步测试了细胞静止的概率为1−第页div公司（如中所示等式4)只有当其相邻站点空闲时才能退出静止（中的图S5S1文件)如果细胞能够感知自由空间，则可能会发生这种情况。在这种情况下，如果重新进入的临界ECM浓度升高，我们也可以获得与生长数据的良好拟合。我们注意到，在模拟过程中很少观察到细胞周期从G0重新进入，并且模拟结果对重新进入率的变化一点也不敏感（参见S1文件). 我们的结论是，通过退出静止状态而重新进入细胞周期并不是SK-MES-1细胞MCS生长的关键参数。然而，在药物治疗的情况下，药物可能会杀死最外层的细胞，细胞周期的重新进入预计会改变治疗细胞群的生长和存活，并将成为一个关键参数。
总之，为了解释数据，细胞周期重新进入必须是一个非常罕见（可忽略的罕见）的事件，这就是为什么我们在以下整个过程中都忽略了细胞周期重新进入（有关更多详细信息，请参阅S1文件).
模型1：葡萄糖和氧气限制的生长和存活
我们认为缺乏葡萄糖和氧气是导致细胞死亡的原因。Schaller和Meyer-Hermann[2]提出只有当葡萄糖和氧气的产物超过阈值时，细胞才能存活第页草酸低于此阈值时，细胞会发生细胞死亡：
哪里H（H）是Heaviside函数，和最大值和k个div公司和k个div公司分别是实际的分裂率和细胞死亡率。由于无法获得SK-MES-1细胞葡萄糖和耗氧率的实验测量值，我们假设这些速率与EMT6/Ro细胞测得的氧和葡萄糖消耗率遵循相同的函数关系（参见材料和方法)，仅允许SK-MES-1电池的参数与EMT6/Ro电池的参数不同。
结果表明，对于该假设（虚线）和营养培养基条件III（[G]=25mM，[O]=0.28mM），模拟结果与实验生长曲线和ECM、增殖和细胞死亡的径向剖面吻合良好，但对于条件II（[G]=5mM，[0]=0.28m M）则完全不符合。坏死核心的大小和生长曲线被高估了。
[G]=5mM，[O]=0.28mM（条件II，右上图和中图）和[G]=25mM，[Co]=0.28mM（条件III，左上图和下图）的生长动力学（上图）和TUNEL，Ki67，胶原蛋白IV的空间分布。虚线显示了细胞周期进展需要局部葡萄糖和氧气浓度的乘积超过临界阈值的模拟，而低于该阈值的细胞会静止并死亡。如果产品被ATP的局部浓度所取代，协议将显著改善（实线）。对于虚线曲线，假设介质中的扩散系数为D类医学= 30D类肿瘤实验生长曲线显示为箱线图（方框：平均值、下四分位数和上四分位数，水平虚线：最小值和最大值），径向剖面显示为平均值（粗线）和标准偏差（细线）的组成。
模式2:ATP限制生长和存活
下一步，我们认为细胞周期的进展和死亡取决于细胞的主要能量货币三磷酸腺苷（ATP）的产量[54]细胞可以从消耗的葡萄糖和氧气中生成，而不是从氧气和葡萄糖浓度的局部产物中生成：
哪里第页列车自动防护系统是ATP的生产率（参见等式28),划分增殖状态和死亡状态边界的阈值。我们注意到，充分供应氧气和葡萄糖的细胞以大约1100的速率产生ATP百万分之一/小时（请参见这似乎最能满足电池的能量需求。有趣的是，适度缺乏葡萄糖或氧气的细胞将使其ATP生成增加至1700百万分之一/小时.
营养依赖性代谢。ATP（左上）和乳酸（右上）的生成速率。最低ATP要求的阈值用黑线表示。厌氧代谢葡萄糖（左下）和糖酵解ATP（右下）的百分比。
显示ATP-限制生长（实线）在II和III两种条件下均与肿瘤生长动力学符合良好。
ATP具有重要的生长调节功能，这一观点得到了以下观察结果的支持：ATP已被证明可以控制鸡和小鼠视网膜发育中的细胞周期[55]，并且最成功的靶向细胞周期的药物抑制ATP与细胞周期进展所必需的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的结合([56,57]). 此外，已经发现ATP可以上调人心脏成纤维细胞的增殖([58]).
然而，在5mM葡萄糖（条件II）的情况下，模型预测的坏死核心要比25mM葡萄糖（情况III）大得多，而实验曲线表明其大小相当。此外，条件II下死亡细胞的比例比实验发现的要小得多。坏死核心的大小随葡萄糖和氧气扩散系数的变化而变化，如中所示的另一个模拟示例所示（虚线）。这里我们假设介质中的分子扩散是球体中的30倍。在这种情况下，模型显示出与5mM葡萄糖（条件II）更好的一致性，但却低估了25mM葡萄糖的坏死核心的大小（条件III）。虽然模型2预测的坏死核心的大小随着葡萄糖的中等浓度和明显的扩散系数的变化而变化，但实验曲线表明，5mM和25mM葡萄糖的坏死核心大小大致相同（同样，在培养24天时，与对照组相比，5mM葡萄糖和25mM糖的坏死核心尺寸也大致相同).
模型3：乳酸诱导的细胞死亡
此外，染色细胞部分的实验曲线（参见)揭示了条件II和条件III之间的一些差异。首先，对于5mM葡萄糖，坏死核心在17天和24天的深度约为150微米，而对于[G]=25mM，坏死核心出现较慢：在第17天几乎不存在，在第24天变大。其次，[G]=5mM时坏死部分和存活部分之间的过渡比[G]=25mM时明显得多。第三，24天后，与直觉相反，在外部发现更多的死亡细胞（<150微米)25毫米的葡萄糖，而不是5毫米的，尽管后者被认为营养更有限。
这表明两种情况下细胞死亡的原因可能不同。因此，在第三步中，我们研究了额外假设的后果，即如果局部乳酸浓度超过临界阈值，也可能触发细胞死亡(). 细胞被葡萄糖充分供应，但缺乏氧气，从而产生乳酸。我们通过将死亡率设为
其中[L（左）]最大值= 20百万分之一是细胞死亡率为其值一半时的乳酸浓度，以及n个是希尔系数，它决定了从无细胞死亡响应切换到全细胞死亡响应的锐度。即。n个=1导致平稳过渡n个→ ∞ 到Heaviside函数。我们选择了希尔系数，以获得最佳拟合（图S8S1文件). 线性相关性或Heaviside函数导致数据的一致性比Hill函数差得多n个= 2. 乳酸是厌氧菌代谢的副产物等式9主要影响高血糖但低氧供应的情况（参见).
添加乳酸诱导的细胞死亡。如果葡萄糖生成过程中产生的乳酸浓度高于一定浓度，则会发生细胞死亡，条件III（[G]=25mM，[O]=0.28mM）和条件II（[G]=5mM，[0]=0.28mM）的种群动力学和时空分布，以及条件I（[G]=1mM，[O]=0.28mM）的生长阶段和条件IV（[G=25mM，[0]=0.07mM）已正确捕获。假设介质中的扩散系数为D医学=30 D肿瘤实验增长曲线显示为箱线图（方框：平均值、下四分位和上四分位，水平虚线：最小值和最大值），径向剖面显示为平均值（直线）和标准偏差（误差线）的组成。
显示了ATP-限制和乳酸诱导细胞死亡的组合如何影响所有四种条件下的生长曲线以及条件II（[G]=5mM，[O]=0.28mM）和条件III（[G=25mM，[0]=0.28m M）的径向剖面。现在，增殖和死亡细胞部分的径向轮廓的形状和时间演变与数据的一致性比以前好得多。
此外，有趣的是，尽管该模型仅以[G]=5mM、[G]=25mM和[0]=0.28mM进行了校准，但在没有任何额外参数调整的情况下，定量预测了极低葡萄糖介质浓度（[G]=1mM、[O]=0.28m M）和极低氧气介质浓度（[G]=25m M、[O]=0.07m M）的生长阶段！这表明捕获了决定SK-MES-1球体生长阶段的关键因素的功能依赖性。
有趣的是，在小鼠杂交瘤中观察到乳酸对生长的不利影响([59]). 研究发现，高浓度的乳酸（55mM）抑制细胞生长，并伴随着死亡率的增加（尽管作者将后者归因于较高的渗透压）。然而，死亡率对乳酸浓度的总体依赖性与我们的模型预测的结果非常相似（S1文件). 在CHO（中国仓鼠细胞[60])，永生化细胞。
模式4：废物和欠氧调节静止
最后，虽然所有四种条件下观察到的初始生长阶段都可以用ATP和乳酸依赖性细胞动力学很好地解释，但它们无法解释约20天后所有条件下出现的饱和度。对于[O]=0.28mM的生长速度快于线性生长速度的所有生长条件，在20–30天左右达到饱和（即进入生长速度慢于线性生长的阶段）的小时间，必须存在一个拐点，超过该拐点，膨胀速度开始下降。然而，只要培养基中的营养物质浓度保持不变，外部细胞就由营养物质供给，膨胀速度的降低与营养物质无关。因此，膨胀速度的降低必须源于肿瘤内部过程产生的生长抑制。乳酸可以被排除为这种生长抑制剂的候选物，因为它只出现在缺氧的情况下（III和IV）。此外，可以排除机械应力导致饱和的原因，因为多细胞球体的环境是液体，而不是在压缩时具有较高阻力的介质([48,61,62]).
我们通过假设细胞暴露在废物中超过一定时间后会静止下来，从而验证了赖氨酸染色细胞释放的细胞质废物物质可能作为生长抑制剂的假设：
哪里H（H）是Heaviside函数，n个经验是一个细胞暴露于废料或缺氧或两者兼而有之的细胞周期数，是细胞在这种条件下不受生长抑制的最大细胞周期数[W公司](第页,τ)和[O（运行）](第页,τ)废物和氧分子的局部浓度[W公司]最大值和[O（运行）]最小值相应的阈值浓度。也就是说，积累了太多废物的细胞会变得静止，不再（重新）进入细胞周期。请注意，这种动力学也可以用随机动力学来表示，因此可以通过为每个细胞引入一个内部状态变量（计数器），当外部局部废物浓度超过阈值浓度时，该变量以一定的恒定速率增加，并假设细胞周期（re-）当该状态变量超过临界值时，禁止进入。如果状态数和计数器增加一个单位的速度都很大，则达到阈值之前的新兴等待时间是Erlang分布的，标准偏差非常小（即非常接近由等式10). 与计算细胞周期数不同，细胞暴露于临界浓度的废物或氧气不足（或两者兼而有之），如等式10，我们测试了另一个条件，即暴露是在绝对时间内积分的（而不是细胞周期时间的倍数）。在这种情况下，只有条件IV的拟合发生了变化，实验和模拟之间的偏差增加了约5%。
总之，模型4的增殖和静止之间的转换由等式确定4和10.
此外，可以观察到，大约200…300小时后，在所有四种条件下，半径膨胀都会减慢。因此，我们进一步假设，在废物暴露或缺氧条件下，细胞生长速度减慢
其中[O（运行）]最小值和[W公司]最大值分别是氧气和废物的临界浓度。Stopper等人先前报道了低氧供应导致的生长速率下降[63]而格林斯潘已经提出了来自坏死碎片的废物的抑制生长作用[64].
显示了扩展模型的模拟结果，包括乳酸和废物对两个不同阈值的废物暴露时间的依赖性。条件II和III显示出相似的初始生长阶段，随后是两个线性状态，第一个以ATP限制为主，第二个以废物中毒为主，最后以饱和结束。
废物和欠氧调节静止。如果一个细胞暴露在废物中（来自死亡细胞的细胞裂解液的细胞碎片）或在一定数量的细胞周期内缺氧，，它将在下一次分裂后变得静止。正确捕获了所有生长阶段所有条件I-IV的种群动力学，包括饱和度以及条件III（[G]=25mM，[O]=0.28mM）和条件II（[G]=5mM，[0]=0.28m M）的时空分布。图表显示了实验观察和模型模拟之间的比较。实验增长曲线要么显示为箱线图（方框：平均值、下四分位数和上四分位数，水平虚线：最小值和最大值），要么显示为径向轮廓的平均值（直线）和标准偏差（误差条）的组成。模拟曲线显示为黑线。
另一方面，条件I和条件IV在由废物暴露（条件I）或缺氧（条件IV）驱动的非常短的初始生长阶段后几乎立即饱和。注意，只有当细胞静止延迟足够数量的细胞周期暴露时，饱和度才是间歇性的。而对于8个细胞周期的较大延迟()球体永久停止生长，在4个细胞周期延迟（未显示）的情况下，球体的膨胀只会暂时减缓，然后恢复其初始速度。这与大量废物有关，这些废物可能在较长的延迟时间内堆积和扩散，从而影响所有细胞，而不仅仅是最靠近坏死核心的细胞（有关所有条件的模拟快照，请参见图S14S1文件).
