个人基因组中保守结合位点的侵蚀指向医学史

摘要

作者摘要

介绍

高通量基因分型的出现刺激了旨在确定遗传病基础的全基因组关联研究（GWAS）的兴起。GWAS变异体，其中超过90%被发现位于蛋白质编码序列之外[1]越来越多的非编码基因组注释通过将重点从蛋白质编码和拷贝数变异转移，帮助我们更好地理解疾病的遗传基础[2–4]到非编码基因组。尽管GWAS有助于提示人类疾病易感性的基因调节成分[5,6]他们一直受到“缺失遗传力问题”的困扰，该问题认为GWAS检测到的基因座通常只能解释导致表型的一小部分遗传变异[三,7].

导致“缺失遗传力问题”的建议遗传方差模型包括“无穷小模型”（大量小效应常见变异）和“罕见等位基因模型”（大批大效应罕见变异）[7]. 在无穷小模型的情况下，缺失的遗传力可以解释为变体之间的加性或上位性相互作用，而不是独立的多态性[8]. 但是，选择和评估所有变体集会导致集合的组合爆炸，而我们目前在统计上没有足够的能力进行评估。

在这项工作中，我们将展示如何不仅成功地避免组合爆炸，而且同时解决加性和幕式非编码变异在人类疾病中的关键作用。具体来说，我们开发了一个新的统计框架来识别个人基因组中可能有害的非编码变异全体，通过对参与共同生物过程的关键基因的失调而导致疾病风险。

非编码基因组的核心作用在于顺式-基因表达的调节。GREAT（Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool，基因组区域注释工具）是一种常用的工具，用于解决一组顺式-调控基因组区域[9]. GREAT测试一组任意的基因组区域是否聚集在具有特定功能或通路的基因旁边，其中大多数被认为是调节附近基因表达的区域。GREAT分配不同的基因可变长度的基因调控域，解释远端调控元件，并奖励观察同一基因旁边的多个元件，反映脊椎动物基因调控的观察特性。在分析不同类型的ChIP-seq和相关数据方面，GREAT已被证明优于基于基因的测试（遵循转录分析的单探针基因范式）[9].

由于我们对识别疾病相关非编码变异以解释个人基因组感兴趣，我们询问使用GREAT是否可以在关键生物路径中丰富疾病相关非码变异的功能。首先，我们检测了与克罗恩病、空腹血糖特征、GREAT等多种表型相关的非编码GWAS显著SNP(S1表). 并非所有GWAS tag-SNP本身都是因果的，但由于它们靠近因果突变，我们可以假设GREAT在大多数情况下会将tag-SNPs与相同的受影响基因联系起来，它会将潜在的因果突变联系起来。例如，如果我们对40个与胆固醇水平相关的非离子非关联GWAS单核苷酸多态性进行GREAT分析，这是最丰富的术语(P（P）=3 x 10⁻⁵)在整个GO本体论中，涉及“循环胆固醇水平异常”的基因。我们在中显示了几个不同GWAS集的类似结果S1表在每种情况下，我们发现非连锁tag-SNP在与检测表型显著相关的功能类别基因旁边最丰富，提供了电子版对研究质量和GREAT分析有效性的保证，但也表明这些突变中的多个可能在受累个体中积累。因此，我们假设更多的信号可能隐藏在顺式-超出GWAS可能揭示的监管变量。

GWAS变异体靶基因富集的一致性表明变异体具有加性和/或上位性效应以赋予表型。由于计算要求高且缺乏统计能力，对此类交互进行建模通常仅限于对的启发式搜索[10]. 由于基因组中性进化产生的大多数变异，在非编码区识别因果变异的统计能力进一步减弱[11]. 因此，为了获得可应用GREAT的高质量变体集，我们需要一种方法，即获得一组功能相关的非编码变体，而无需枚举所有可能的集。

为了获得一组功能相关的、假定有害的非编码变体，我们利用转录因子（TF）结合位点预测。新型高通量技术，如HT-SELEX和蛋白质结合微阵列，揭示了大多数人类转录因子的精确DNA结合偏好[12,13]. 利用这些偏好来预测单个基因组中的TF结合是众所周知的困难。然而，如果人们只愿意预测结合位点的一个子集，即那些通过进化而保守的结合位点，那么只有在许多不同哺乳动物的直系同源位置看到结合位点，才能预测结合位点的存在[14]. 这样的方案自然会遗漏许多进化上较新的结合位点，但正如我们和其他人所示，我们确实预测的那些保守的结合位点可以非常精确地预测，并且对于下游分析（如功能富集和蛋白质复合物预测）很有用[14–16].

如GREAT论文所示，虽然ChIP-seq实验表明TF与许多基因组位置非特异性结合，但最强的GREAT基因富集反映了TF调节的过程或功能，突出了参与调节过程的结合位点子集[9]. 以前，在我们的结合位点预测（PRISM）论文中，我们预测了给定TF基序的结合位点的保守子集，并对这一集合代替ChIP-seq峰进行了GREAT分析。在许多情况下，例如对于转录因子REST、GABPA、SRF和STAT3，这种分析揭示了TF参与的多种功能上下文，而无需进行细胞型匹配的TF-ChIP-seq实验[14].

此外，在我们之前的结合位点预测工作中，我们将保守结合位点预测与GWAS标记SNP相交。为了最大限度地提高GWAS标记SNP确实是功能性、因果性突变的可能性，我们着手寻找以下内容：GWAS标记的SNP与保守结合位点预测重叠，例如：1）两个观察到的等位基因在预测的TF与基序结合的能力上显著不同，和2）我们预测结合的TF先前与GWAS表型有关。在我们的论文中，我们只强调了五个这样的预测（[14]). 在前列腺癌的背景下，一个引人注目的例子是我们的预测，即6q22处的GWAS风险等位基因修饰HOX13的保守结合位点，从而修饰下游RFX6基因的表达。我们的预测后来得到了Taipale及其同事的完美实验验证，说明了PRISM预测在评估非编码变异对疾病的影响方面的效用[17].

如上所述，结合位点预测与PRISM和功能评估的融合顺式-带有GREAT的调控区域表明了一个强有力的组合，可以理解非编码变异在疾病中的作用。因此，在这项研究中，我们查看了个人基因组，统计了个人携带SNP的所有位置，该SNP破坏了进化上保守的结合位点，并（使用GREAT）询问哪些生物功能或过程是这些突变聚集最多的。在我们的假设指导下，即具有最意想不到的突变负荷的途径可能会导致一个人的病史，然后我们评估了我们的途径预测与该人的健康记录的相关性。

结果

使用一个包含657种不同转录因子的独特高质量结合基序的大型文库，涵盖所有主要的人类DNA结合域家族和33种灵长类和哺乳动物的多重比对，我们首先预测参考人类基因组中存在的跨物种保守结合位点（参见材料和方法). 然后，我们对照参考基因组检查人类个体的遗传变异。我们关注重叠保守结合位点预测的变异体子集（杂合或纯合）。从这些变异中，我们只选择人类参考基与黑猩猩同源基相同（因此很可能是祖先）的变异，而个体变异基与两者不同。最后，在这些位点中，我们只保留单个（衍生）变异体与祖先碱基相比预计会显著降低结合亲和力的结合位点——我们称之为保守结合位点侵蚀位点（请参见图1和材料和方法).

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图1

保守结合位点侵蚀位点方法示意图。

（A） 推断保守结合位点侵蚀位点（CoBEL）和侵蚀功能后果假设的方法。（B） 保守结合位点侵蚀位点（CoBEL）是人类参考转录因子结合位点，在多种哺乳动物中保守，被测序个体衍生变异体破坏。显示了ADRA1B上游的CoBEL对地震基因组“异常心输出量”预测的贡献表1（C）通过文献调查，检查保守结合位点侵蚀位点（CoBEL）的功能富集情况，并将功能表型与病史相匹配。对每个步骤进行统计显著性评估（见正文）。

我们从加州大学旧金山分校下载了所有四个人的全基因组变异文件，这四个人的公共病史摘要也可用：Stephen Quake[18]，以及来自个人基因组项目（PGP10）的三个人[19]. 获得了James Lupski的附加文件[20]. 然后，我们将每个基因分别与参考基因组进行比较，以获得斯蒂芬·奎克的6321个CoBEL，乔治·丘奇的5291个CoBELs，米沙·安格里斯特的5775个CoBELs，罗莎琳·吉尔的5861个CoBERs，詹姆斯·卢普西的6447个CoBESs(S4系列–第8节表）。

由于CoBEL削弱了保守的祖先结合位点，我们询问是否一个人的集合优先出现在编码任何特定功能的基因旁边，如果是，这个功能是否与个人的病史有关(图1C). 如前所述，GREAT是一种专门用于评估一组基因组区域内丰富功能的方法，这些基因组区域被认为是调节邻近基因的[9]通过与基因组中的每个基因关联一个可变长度的调控结构域，由其两个相邻的基因包围。GREAT还拥有大量关于基因功能和表型的知识，这里我们使用了110多万个这样的基因注释（参见材料和方法). 对于一组给定的CoBEL，GREAT迭代了16000多种不同的生物功能和表型，询问CoBEL是否在任何特定功能基因的调控域中特别丰富。例如，人类基因组中的33个基因被注释为“异常心输出量”。它们的GREAT指定调控域覆盖了基因组的0.45%。在6321个地震CoBEL中，有28个（0.45%）偶然出现在这33个基因的调控域中，但实际上观察到57个CoBEL，数量是原来的两倍多。为了确定统计显著性，GREAT为这种丰富计算了两个统计数据，并对其进行了多假设检验（请参见材料和方法).

Stephen Quake的医疗记录中最突出的是致心律失常性右心室发育不良/心肌病的家族史，包括一例可能的心源性猝死病例[18]. 令人惊讶的是，当使用GREAT分析Quake的CoBEL集合时，顶级表型富集（使用默认参数设置，为原始GREAT论文中的推理能力进行优化[9])是“心输出量异常”（57 CoBEL，错误发现率Q=1.69 x 10⁻⁴). 这种增加提示心脏病的易感性是心输出量减少的原因[21]. 事实上，在所有五个基因组中都观察到CoBEL和个人医疗记录之间有意义的关联(表1和第9部分–第13节表）。

发作性睡病患者乔治·丘奇（George Church）的最大收获是“节前副交感神经系统发育”（23 CoBEL，Q=1.18 x 10⁻⁴). 自主神经系统被强烈怀疑与发作性睡病有关[22]. Misha Angrist的个人报告表明，可能存在毛发角化病，这是一种滤泡性疾病，表现为皮肤上出现粗糙、略带红色的肿块，他认为“上皮细胞形态发生”是他最重要的生物过程浓缩物[23]（60 CoBEL，Q=1.38 x 10⁻⁵). 对于患有高血压的罗莎琳·吉尔（Rosalynn Gill）来说，最高富集表型是“循环钠水平降低”（32 CoBEL，Q=4.94 x 10⁻⁶). 钠摄入量与高血压密切相关[24]. 有趣的是，我们为詹姆斯·卢普西（James Lupski）获得的最高生物过程浓缩物，其家族有外周神经系统（PNS）轴突神经病病史[20]是“少突胶质细胞分化的调节”（59 CoBEL，Q=2.93 x 10⁻⁵). 少突胶质细胞是神经胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）的轴突周围形成髓鞘，并维持轴突的长期完整性[25,26].

虽然GREAT的统计意义上的功能丰富否定了CoBEL在功能相关基因调控域中均匀随机分布的无效假设，但它并没有检查保守结合位点的分布是否存在遗传偏见（侵蚀与否）在涉及丰富功能的基因的调控域中。因此，为了进一步评估我们结果的重要性，我们将每个CoBEL替换为具有相同亲和力和相似跨物种保守性的相同转录因子的随机结合位点预测。使用10000个随机控制集表1由于基因组中结合位点分布的偏差导致最高预测值较低（地震P（P）=3 x 10⁻⁴，教堂P（P）=5.7 x 10⁻³，愤怒P（P）=4.8 x 10⁻³、吉尔P（P）=1 x 10⁻⁴，卢普西P（P）=1.9 x 10⁻³，且组合P=1.6 x 10⁻¹⁵). 当我们放宽要求，恢复每个完全相同的术语，并匹配更广泛的12-60个相关函数中的任何一个作为顶级预测（地震P（P）=1.1 x 10⁻³，教堂P（P）=1.3 x 10⁻²，愤怒P（P）=7.7 x 10⁻³、吉尔P（P）=7.4 x 10⁻³，卢普西P（P）=6.5 x 10⁻³，组合P=5.2 x 10⁻¹²; 看见材料和方法).

虽然1000个基因组项目受试者的表型数据不可用[27]1094个个体的全基因组序列的可用性让我们可以问，在大量的对照背景下，我们对五个表型个体的最高预测有多独特。我们通过测试1000个基因组项目的对照个体中是否很少出现表型预测，从而测试我们筛查的特异性，从而询问表型预测对于给定的个人基因组是否是唯一的。由于在我们的分析中包含了常见和罕见变异，因此进行了此对照分析。我们想验证在我们的五个基因组中观察到的丰富性并不是由与许多其他个体共享的共同CoBEL所支配。

因此，我们计算了1000个基因组项目测序的所有对照、非表型1094个基因组中观察到的富集频率[27]. 我们验证了1094个基因组的CoBEL集合大小与五个分析基因组的CoBEL集合大小相当（最小值6121；欧洲平均值6385），将CoBEL提交给了GREAT，并注意到了最大的富集。我们观察到的五个个体的每一个最高富集率都小于0.05(S2A表格)富集的p值和折叠统计数据表明，它们从1000个基因组队列中显著删除(图2). 接下来，我们进行了主成分分析，以验证我们研究中分析的五个基因组都主要是预期的（欧洲）祖先，而不是与1000个基因组项目数据相比的异常值(图3A). 然后，我们仅使用381个欧洲基因组和181个混合基因组重新计算富集的发生率，以校正任何特定种群的富集。同样，所有丰富术语的出现率都小于0.05(S2A表格). 由于GREAT中的本体术语与有向无环图（DAG）结构相关，因此诸如“异常心输出量”（Quake基因组预测）之类的术语与其总括术语“异常心血管输出量”共享相似的基因集，1000基因组项目中的一名对照患者可能会出现这种情况。为了解释预测两个相关项的情况，我们还通过计算一个项的更广泛的相关函数组来计算该项的错误发现率。然而，这些发现的发生率仍然低于0.05(S2B表格)当我们重复完整的1094个基因组、381个欧洲基因组和181个混合基因组计算更广泛的相关功能组时，除了更常见的心脏和高血压疾病的p值稍高（高达0.088）。事实上，在1000名非表型基因组受试者中，8%的人（他们自己可能患有或易患各种复杂疾病，尤其是更常见的疾病）在与高血压相关的更广泛术语中含量最高，5%的人在心脏术语中含量也同样最高。

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图2

“对照”基因组中假设表型的富集分布。

（A-E）1000基因组项目中1094个基因组和本报告中分析的五个基因组的个人基因组丰度比较。虚线表示GREAT的默认二项式倍数（大于或等于2）和FDR（小于或等于0.05）显著性阈值。左下角是GREAT默认超几何FDR不显著的基因组质量（小于或等于0.05）。红色标记表明一个分析过的个人基因组的预测是显著的，并将其与1000个基因组队列进行了区分，表明这种关联在对照个体中并没有以较高的频率出现。A组显示，“异常心输出量”的增加在背景1000基因组队列中相当常见，这并不意外，因为轻度心脏病的易感倾向在其他正常人群中很常见。

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图3

CoBEL的频率分布与人口结构的关系。

（A） 根据1000个基因组项目中的基因组对五个基因组进行主成分分析（PCA），结果显示与欧洲人群的聚类符合预期。（B-F）在所有1000个基因组数据中以及通过PCA与五个基因组聚类的两个群体中，比较五个个体的富集特异性CoBEL频率。这一分析和额外的频率分布分析（见正文）均表明，CoBELs的顶级富集物由常见和罕见的变异组成，正如预期的那样，低致病性突变只在总体上产生显著影响。全1000个基因组和两个亚群体的频率分布的相似性进一步表明，在我们的富集中没有任何群体特定的偏见。

最后，我们评估了五个人的CoBEL富集与病史关联的特异性(图1C和S14表格). 进行这项测试是为了验证预测的最高富集度并不是很广，因此它们会匹配不同的病史，同样，所选的个体没有如此广泛的疾病表型来匹配不同的可能最高富集度。我们定义了一个关联矩阵，将富集和病史联系起来，将五个个体中观察到的表型作为行，将所有顶部富集项作为列。只有当（任何个体的）富集项被认为与（任何个体）表型的病因有关时，基质中的细胞才会标记为“真”材料和方法). 这个矩阵的一个例子是由一名医生根据他们的医学知识和培训填写的(S15表)另一个例子是通过文献调查独立填写的(S16表). 目的是使用两个关联矩阵中的一个作为“黄金”关联，计算将一组五名具有随机病史的个人与观察到的丰富性关联的机会。我们生成了1000组由五个人组成的随机病史，这些病史由相似的疾病特征组成，并评估了将其与丰富性联系起来的可能性（参见材料和方法). 使用医生生成的关联矩阵，成功地将五个随机个体与丰富联系起来非常重要(P（P）=3.0 x 10⁻³)以及通过文献调查生成的矩阵(P（P）=3.0 x 10⁻²)表明我们的丰富性和病史之间的联系不仅仅是所列病史的功能。文献调查衍生的关联矩阵可能提供更严格的零模型，因为它包括当前研究主题暗示的关联，这些关联在未来可能会或可能不会与临床相关。

我们的CoBEL预测不同于已知的GWAS关联。238个变异等位基因表1这些预测与单个表型无关的GWAS SNP重叠，表明我们的方法是发现疾病位点的补充方法。虽然GWAS的目标是找到最有可能单独区分疾病队列和匹配对照的基因座，但我们的方法试图确定可能导致疾病的常见和罕见基因座的总和。GWAS的能力不足，无法找到这种组合相互作用。同样，负责238种变体的CoBEL均未与HGMD交叉[28]疾病变体（一大组极为罕见的高度渗透性变体，被认为单独触发潜在疾病）。当重叠分析扩展到包括可能连锁不平衡（LD）中的GWAS单核苷酸多态性时，只有两种可能的表型匹配出现：“心肌肥厚”相关[29]SNP rs3729931用于地震和“多发性硬化症”（另一种脱髓鞘疾病[26])关联的[30]Lupski的SNP rs882300。事实上，我们预测的CoBEL变异等位基因总数的近一半（7115，49%）是我们五个个体中唯一的。类似地，对于中的五个顶部函数预测中的每一个表1，在16个可能的子集中（CoBEL与其他四个人共享或不共享），最大的贡献（17-34%）总是来自私有站点(S1图).

当CoBEL频率在人口水平上进行检查时，Quake和Gill’s富集的CoBEL显示出较高的人口频率(图3B和3E)因为他们可能更常见的心脏病和高血压的丰富表型。相反，Church、Lupski甚至Angrist在较小程度上表现出较丰富的CoBEL，人口频率较低(图3C、3D和3F). 为了检验CoBEL分析的群体频率依赖性，我们将自己限定为罕见的CoBEL，定义为1000个基因组中频率小于或等于0.01的CoBELs。我们的功能丰富对于罕见的CoBEL来说都不重要。即使我们将1000个基因组的频率增加10倍至0.1，也只有Angrist的“上皮细胞形态发生”富集被挽救，尽管富集统计数据有所减少（16 CoBEL，Q=1.85 x 10⁻²)与全套相比（60 CoBEL，Q=1.38 x 10⁻⁵). 这进一步证实了我们的丰富是常见和罕见变体的结合。

讨论

我们执行的屏幕功能不足：我们没有所有人类转录因子或所有功能（祖先或非祖先）结合位点的结合亲和力；变异图谱可能遗漏更复杂的基因调控突变；尤其是我们对表型与基因关联的了解还远远不够完整。此外，我们只关注获得的顶级富集，而不是所有富集，以保持测试关联统计严格性的能力。然而，所有这些限制只会降低我们检测真实关联的能力，但不会提高错误预测的可能性。相反，通过关注高度保守的结合位点，我们大大增加了其破坏带来适应度代价的可能性。事实上，考虑到GREAT测试了16000多种不同的生物过程或表型（来自“一腹主动脉瘤z（z）我们获得的基因组预测与医学表型之间的联系似乎非常重要。

我们的CoBEL预测支持已知的疾病等位基因。例如，一种特殊的人类白细胞抗原（HLA）等位基因在绝大多数发作性睡病患者中被发现，这些患者患有猝倒，在那些没有发作性睡症的患者中也很常见[31]. 受影响的Church基因组是不同HLA等位基因的纯合子（见补充方法）。四个GWAS单核苷酸多态性，均具有中等效应大小（OR=1.29–1.79），目前与发作性睡病相关。Church携带其中两个基因，但我们分析的其他四个未受影响的基因组也携带2-3个发作性睡病风险等位基因，因为它们普遍存在（参见S3表).

此前对地震基因组进行了编码和GWAS变异分析[18]. 虽然没有出现单一的强突变，但收集到的突变总数足以将心脏病评估为相对较大的风险。然而，许多个人变异的评估过程偏向于基因变异和先前确定的风险位点，重点是解释心脏病家族史。我们获得的心输出量丰度不仅来自新的非基因位点，而且是以完全不可知的方式获得的。

我们的分析是对最先进的分析的补充，这些分析侧重于通过与已知（主要是编码）变体数据库交叉来搜索主要致病变体，探索已知疾病相关基因中罕见或新颖的编码或剪接变体，并使用SIFT等计算工具优先编码候选变体[32]，PolyPhen2[33]和VAAST[34]. 很少有这样的工具适用于非编码基因组，据我们所知，没有一种工具明确关注结合位点的破坏。CADD等方法[35]对非编码变异体的致病性进行评分，但在阳性集上训练其模型，只对有害的非编码突变进行弱富集。由于基因组的非编码部分很大（97%），而且大多数此类工具不会聚集功能性或任何其他类别的突变，因此大多数用途仅限于剪接变体或非编码RNA[20]和Ashley等人[18]分别用于Lupski和Quake。这两项工作主要集中在已知疾病相关基因的编码变体上。他们识别了非同义SNP，并在已知致病性变体数据库（如HGMD）中搜索匹配项[28]和OMIM[36]. 当已知的疾病变异体未被识别时，研究范围扩大到包括与其患者相关的基因中的罕见和新变异体（Lupski等人的神经病变）[20]以及Ashley等人的心血管疾病[18]). 这两项研究都没有寻找任何潜在的基因调控突变。

除了我们的分析获得的富集外，我们的顶级富集中结合位点的积累也揭示了这一点：首先表1平均受三种以上CoBEL的影响，削弱了该基因假定的调控稳健性[37]. 第二，表1还显示，在所有五种情况下，CoBEL影响了为所述功能/表型注释的所有人类基因中的大多数（58-89%）。

总之，我们的观察结果表明，基因调控在（人类一代）时间和（基因调控）空间上逐渐受到侵蚀，最终表现为病史。这些观察结果证实了一个长期以来的观点，即小的有害突变的谱系积累，即使与不同的生活方式和环境相结合，最终也会增加家族性疾病表型的可能性[38]. 根据这些有害突变的选择系数及其遗传背景，这些突变最终可能会从种群中清除，但由于非随机的人类交配模式和侵蚀后相对较短的时间尺度，这些突变目前是可见的。

我们的屏幕提供了一个令人兴奋的一瞥，人类基因调节对个人病史贡献的潜在遗传负荷。随着我们表征个体遗传负荷的能力的提高，我们对基因组-环境相互作用以及触发人类疾病发病的阈值的理解也将提高。

材料和方法

支持信息

致谢

资金筹措表

HG由国家科学基金会研究金DGE-1147470资助，SC由斯坦福研究生研究金和国家科学基金资助DGE-1147770，SLC由HHMI Gilliam研究金资助，GB由NIH资助R01HG005058和R01HD059862，NSF信息科学中心（CSoI）资助授予CCF-0939370和KAUST。GB是Packard Fellow和Microsoft Research Fellow。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

数据可用性

所有相关数据都在论文及其支持信息文件中。

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