脂联素衍生活性肽ADP355在硫代乙酰胺肝损伤中的抗炎和抗纤维化作用

摘要

许多研究分析了脂肪因子在肝脏创伤愈合过程中的作用，确定了脂肪因子作为肝脏病理生理调节剂的新作用¹作为脂肪因子之一，脂联素是一种循环脂肪细胞衍生蛋白，最初由四组使用不同方法独立鉴定²据报道，脂联素可能对肝纤维化具有保护作用。脂联素可以阻断瘦素介导的肝纤维化^三,4缺乏脂联素的小鼠出现增强四氯化碳诱导的肝纤维化⁵一种可能的机制是脂联素可以保护胶原，从而负调控骨髓单核细胞祖细胞的生长和巨噬细胞的功能⁶此外，脂联素还对许多其他疾病有益，如心血管疾病、胰岛素抵抗、癌症和炎症状况².

然而，由于C末端球状结构域及其较大的肽片段的极端不溶性，将整个脂联素蛋白作为药物开发是困难的⁷这可能会限制使用全长脂联素的靶向治疗。此外，脂联素以寡聚依赖的方式发挥不同的生物活性⁶为了绕过上述限制，一些研究人员开始致力于开发一些与脂联素相关的更简单、更小的分子，这些分子可以作为脂联素受体激动剂来模拟脂联素的作用。这已慢慢成为现实。最近，一种新型脂联素短肽ADP355由66个重叠的10-氨基酸长肽组成，覆盖整个脂联素球状结构域（残基105–254）⁷据报道，它对几种脂联素受体阳性癌细胞株具有剂量依赖性的抗肿瘤作用，对原位人类乳腺癌异种移植瘤的生长具有31%的抑制作用体内⁷最近，据报道，ADP355可以抵消HIV蛋白酶抑制剂（PI）在实验动物模型中诱导的代谢功能障碍的有害影响⁸这些结果表明，ADP355可部分逆转PI诱导的皮下脂肪组织丢失；减弱PI诱导的高胰岛素血症、高甘油三酯血症和低脂联素血症；并预防PI诱导的认知障碍和脑损伤⁸在基于荧光偏振的高通量分析中，ADP355也被用作筛选脂联素受体激动剂的阳性对照，一些化合物被鉴定为潜在的脂联素接收器激动剂⁹.

基于上述结果，我们提出了ADP355作为脂联素受体激动剂可以减轻小鼠肝损伤的假设。在本研究中，我们用TAA建立了实验性肝损伤模型，并通过注射ADP355来检测ADP355是否具有脂联素样作用，对抗炎症和肝纤维化，并减轻脂肪（−/−）小鼠肝纤维化的增强。

结果

ADP355抑制TAA诱导的肝纤维化进展

肝纤维化是每种慢性肝病的特征¹⁰PSR染色显示，由于载体小鼠中诱导的TAA，明显的纤维增生从中心静脉或门静脉区域延伸至周围区域，具有明显的P-P（门静脉到门静脉）和P-C（门静脉-中心）桥接(图1B、C). 相比之下，ADP355治疗组的纤维化程度显著降低，而匆忙治疗组几乎没有变化(图1B、C). 定量染色和病理评分进一步证实ADP355对肝纤维化的负作用。H&E染色显示，在ADP355处理的小鼠中，TAA引起的肝坏死炎症被成功逆转，但在仓鼠中，这种逆转不成功(图1D).

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图1

ADP355改善TAA诱导的小鼠肝纤维化。

(A类)纤维化诱导和ADP355治疗的时间表。对照组=不治疗；车辆=TAA+PBS；加扰=TAA+加扰；ADP355=TAA+ADP355(B类)用苦味酸红染色法测定肝纤维化。如箭头所示，明显的纤维增生从中心静脉或门静脉区域延伸到周围区域，由于在小鼠体内诱导了TAA，出现了明显的P-P（门静脉到门静脉，黑色箭头）和P-C（门静脉至中心，绿色箭头）桥接。(C类)肝纤维化分期。(D类)尸体燃烧分别通过H&E分析。使用Ishak的评分系统和Image-Pro Plus 6 Windows软件进行组织病理学评估。显示了所有面板的代表性图像。平均值±SD；n=4-6个样本/组。与对照组或溶媒组相比，使用双尾Student t检验（t检验）计算*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

ADP355通过促进肝脏再生和减少肝脏细胞凋亡使小鼠从慢性损伤的肝脏功能障碍中恢复

如图所示，ADP355处理的小鼠肝糖原增加（PAS染色，图2A)，与运载小鼠和仓鼠相比，血清丙氨酸转氨酶和碱性磷酸酶活性降低，体重增加，肝体指数降低(图2B). 在肝纤维化的发展过程中，随着肝体指数的增加，体重减轻可能是由肝功能障碍引起的。ADP355处理的小鼠与载鼠和仓鼠相比，体重更高，肝体指数更低(图2B). PCNA、TUNEL、Ki67和裂解caspase-3染色显示，与仅TAA（载体）相比，ADP355治疗后显著超增殖，而ADP355处理显著降低了肝细胞凋亡(图2C).

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图2

ADP355改善TAA诱导的小鼠肝纤维化。

(A类)糖原通过周期性酸-希夫染色进行分析。(B类)丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶和体重增加的肝功能分析。肝体指数（LSI）=肝脏重量/体重（%）。(C类)PCNA、TUNEL、Ki67和裂解半胱天冬酶3的肝再生分析。显示了具有代表性的图像。使用手动方法和Image-Pro Plus 6 Windows软件进行组织病理学评估。平均值±SD；n=4-6个样本/组。与对照组或溶媒组相比，使用双尾Student t检验（t检验）计算*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

ADP355抑制TAA诱导的肝星状细胞活化

活化的HSC（肝星状细胞）在产生ECM（细胞外基质）从而导致纤维化方面发挥着重要作用¹¹如图所示，ADP355治疗后，α-SMA的表达（标记为HSC的激活）和ECM的生成（标记为I型胶原和III型胶原）显著下调(图3A). HSC的激活需要TGF-β1/SMAD信号通路的激活¹².我们的体内研究表明，ADP355可降低肝脏中TGF-β1和SMAD2蛋白的水平(图3B)，同时在体外ADP355处理LX-2细胞后，脂联素受体显著上调，SMAD2/3磷酸化受到抑制，SMAD2核移位受到抑制(图3C,补充图S1、S2). 脂联素的多种作用，特别是在肝脏中，已知是由腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）的激活引起的^{三,13,14,15,16}据报道，脂联素通过AMPK激活诱导活化的HSC凋亡^17,1830分钟时，在ADP355刺激的LX-2细胞中检测到AMPKα磷酸化增加(图3D). 此外，ADP355（50 ng/ml）在24小时内诱导LX-2细胞凋亡(图3E).

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图3

ADP355抑制肝星状细胞的激活。

(A类)ADP355对肝星状细胞的灭活作用体内通过肝切片对α-SMA、COL-1和COL-3进行免疫染色研究。(B类)TGF-β1/SMAD2信号体内通过肝脏切片免疫染色检测TGF-β1和SMAD2。(C类)在TGF-β1（1 ng/ml）存在下，用ADP355（0-500 ng/ml）处理LX-2细胞（肝星状细胞）40分钟；用指定剂量的ADP355检测SMAD2的磷酸化和核移位。条形图显示了（左）p-SMAD2/SMAD2相对于GAPDH强度的密度分析，以及（右）核/细胞质-SMAD2相对于组蛋白3/GAPDH的密度分析。(D类)ADP355增加LX-2细胞中AMPK的磷酸化。通过Western blot分析测定磷酸-AMPK和AMPK的蛋白质水平。条形图显示了p-AMPK/AMPK相对于GAPDH强度的密度分析。(E类)ADP355诱导LX-2细胞凋亡。使用Image-Pro Plus 6 Windows软件显示代表性图像并进行组织病理学评估。平均值±SD；n=4-6个样本/组。与溶媒组相比，使用双尾Student t检验（t检验）计算*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

ADP355通过促进STAT3信号传导阻断巨噬细胞活化

据报道，脂联素可能通过负向调节巨噬细胞的功能发挥可溶性防御胶原的作用⁶STAT3通过抑制巨噬细胞的激活而成为炎症反应的潜在负调节因子^19,20,21如图所示，ADP355治疗显著抑制TAA诱导的肝巨噬细胞（标记为F4/80）的激活体内(图4A)并促进RAW 264.7细胞（巨噬细胞）中STAT3的磷酸化在体外(图4B). ADP355治疗后，CD45和CD11b阳性白细胞渗入肝脏的情况也显著减弱体内(图4C、D). 在体内研究表明，在TAA诱导的肝损伤中，ADP355治疗可减少巨噬细胞介导的辅助T细胞的增殖(补充图S3).

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图4

ADP355负调节巨噬细胞活化。

(A类)通过肝脏切片对F4/80进行免疫训练，可以显示ADP355对巨噬细胞的灭活作用。(B类)RAW 264.7细胞（巨噬细胞）中p-STAT3的蛋白质印迹。(C、 D类)用CD11b和CD45进一步测定肝脏中的炎症细胞。使用Image-Pro Plus 6 Windows软件显示代表性图像并进行组织病理学评估。平均值±SD；n=4-6个样本/组或三个独立实验。与车辆组相比，使用双尾Student t检验（t检验）计算*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。

ADP355降低脂联素缺乏小鼠对慢性肝损伤的敏感性

据报道，脂肪（−/−）小鼠（KO）易受CCl4诱导的肝纤维化的影响⁵因此，我们评估了ADP355对脂联素基因缺陷小鼠的治疗潜力(图5A). ADP355的给药，但不加扰，降低了血清ALT/ALP水平和脂肪（−/−）小鼠对TAA诱导的肝纤维化和坏死性炎症的敏感性(图5B–D).

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图5

ADP355可减轻脂联素缺乏小鼠TAA诱导的慢性肝纤维化。

(A类)纤维化诱导和ADP355治疗时间表。(B类)血清ALP和ALT(C类,D类)用皮卡罗伊红和H&E染色分析肝纤维化和坏死性炎症。显示了具有代表性的图像，并使用Ishak的评分系统进行了组织病理学评估。平均值±SD；n=4-6个样本/组。与WT或WT+TAA组相比，使用双尾Student t检验（t检验）计算*p<0.05、**p<0.01、**p<0.001。

此外，我们还检测了ADP355对急性肝损伤的保护作用(图6A). 统计分析表明，ADP355和载体之间TAA治疗的存活率差异不显著(图6B). 然而，在给予TAA后4天，ADP355处理小鼠的ALT和ALP水平显著低于载药小鼠(图6C). ADP355处理的小鼠表现出减少肝纤维化和坏死性炎症，并表现出更高的增殖能力(图6D–F).

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图6

ADP355减少TAA诱导的急性肝损伤。

(A类)急性肝损伤诱导和ADP355治疗时间表。(B类)小鼠Kaplan-Meier生存分析。(C类)血清ALP和ALT(D类,E类)用苦味酸红和H&E分析活小鼠的肝脏样本。用Ishak系统测定肝活检病理评分。(F类)PCNA免疫训练。采用手工方法进行组织病理学评估。显示了所有面板的代表性图像。平均值±SD；n=4-6个样本/组*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001使用双尾Student t检验（t检验）计算。

讨论

脂联素作为一种有益的激素分子，据报道对肝脏损伤具有保护作用^1,三,4然而，脂联素由244个氨基酸组成，是一种相对较大的细胞因子，这限制了其临床应用，因为制药商很难纯化出全尺寸的脂联素蛋白用于大规模生产。ADP355是一种基于脂联素的短肽，由Otvos L设计和开发等.，他证明了其最初的临床前发展，在癌细胞中充当AdipoR激动剂⁷重要的是，该肽在小鼠血清和血液中表现出良好的稳定性和良好的毒性特征⁷在本研究中，我们提供了第一个明确的证据，证明ADP355的递送在显著减少TAA诱导的肝损伤方面具有与脂联素相似的治疗潜力。

肝脏具有独特的再生能力，因此可以快速有效地修复器官，以在损伤后维持其重要功能^22,23然而，在许多肝脏疾病（尤其是晚期肝纤维化）的发展过程中，越来越广泛的纤维化阻碍了肝脏再生，进而导致肝功能受损²³因此，刺激肝脏再生，加速肝脏结构和功能的恢复，对肝脏疾病的临床治疗具有重要意义。已有证据表明脂联素体内与肝脏再生的正常进程有关。与野生型小鼠相比，脂联素缺乏小鼠的2/3部分肝切除术（PH）显示肝质量重新生长受损，肝细胞增殖降低²⁴在我们的研究中，用ADP355重新探讨了脂联素对肝脏再生的刺激作用。结果表明，ADP355显著增加了损伤肝脏中增殖肝细胞的数量（标记为PCNA和Ki67），并抑制了肝脏的凋亡（标记为TUNEL和裂解caspase-3）。因此，从肝功能障碍恢复的小鼠体重减轻，血清ALT/ALP升高，肝糖原降低。

肝纤维化是肝脏组织损伤（尤其是持续性损伤）导致伤口愈合的结果。越来越多的证据表明，肝纤维化可能是可逆的，甚至晚期肝硬化表型现在也被认为是潜在可逆的²⁵肝纤维化的一个关键因素是门脉周围和窦周区域α-平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞的生成和增殖。人们认为HSC具有成纤维潜能，是肝肌成纤维细胞的主要来源之一。HSC在正常肝脏中处于静止状态，位于Diss间隙，并将维生素A储存在脂滴中。作为对肝损伤的反应，静止的HSC被激活以失去维生素A并转分化为肌成纤维细胞表型，表达α-平滑肌肌动蛋白。这些细胞具有高增殖指数，是原纤维胶原的主要来源²⁶作为促纤维化细胞因子，瘦素增加HSC增殖并抑制HSC凋亡²⁷与瘦素相反，脂联素促进HSC凋亡，阻止HSC增殖，并保护肝脏免受纤维化¹⁷Adipo（−/−）小鼠出现增强四氯化碳诱导的肝纤维化⁵肝纤维化对脂联素的保护作用之一是作为瘦素拮抗剂抑制HSC的激活^三,4在我们的研究中，ADP355治疗显著降低了肝纤维化。进一步研究表明，与载药小鼠相比，ADP355处理的小鼠肝脏中α-SMA的表达显著降低，表明ADP355可以显著抑制TAA损伤诱导的HSC增殖。同时，与溶媒组相比，ADP355处理小鼠肝脏中1型胶原和3型胶原的生成也显著减少。此外，ADP355促进HSC LX-2的凋亡在体外.

TGF-β是肝纤维化的潜在促纤维化介质¹²TGF-β1在HSC激活和肝纤维化形成中的致病作用已通过转基因敲除小鼠和腺病毒过度表达显示^28,29HSC的激活通过三种TGF-β1受体（I、II和III型）的上调或从头表达增加对TGF-？的反应性，并激活其下游SMAD信号通路；因此，磷酸化的SMAD2和SMAD3转位到细胞核，调节基因转录¹¹作为TGF-β1的抑制剂，尼罗替尼成功地减少了CCL4和胆管结扎诱导的肝纤维化³⁰此外，TGF-β1及其激活物也是肝细胞生长的有效抑制剂在体外以及在肝脏再生方面体内它可能是部分肝切除术复制反应的终点¹²除了阻断肝细胞生长外，TGF-β还诱导细胞凋亡在体外在培养的肝细胞中³¹.TGF-β的过度表达体内会导致肝细胞高度凋亡²⁸瘦素通过上调TGF-β1部分促进肝脏的促纤维化反应³²脂联素刺激AMPK的药理学激活可以降低TGF-β1、瘦素等诱导的肝星状细胞的活化和增殖^三,16,17随后阻断TIMP-1的分泌并显著增加MMP-1的活性^三.

在我们的研究中，ADP355治疗降低了TAA损伤肝脏中TGF-β1和SMAD2的表达。SMAD2磷酸化和核移位被抑制，而ADP355处理增强了AMPK磷酸化在体外同时，TGF-β1是肝细胞生长的有效抑制剂在体外和再生肝脏体内它可能是部分肝切除术复制反应的终止者。因此，通过激活AMPK抑制ADP355对TGF-β1/SMAD2信号的抑制，不仅可以抑制纤维化，还可以抑制肝细胞凋亡。

巨噬细胞与产生胶原蛋白的肌成纤维细胞非常接近，无疑在纤维化中起着关键作用。它们产生促纤维化介质，如TGF-β1，并通过调节各种基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制剂的平衡来控制细胞外基质的周转³³在受损肝脏中，其数量增加，且主要位于受损和纤维化区域周围^25,34少量巨噬细胞的存在可以促进肝星状细胞从静止向活跃的快速转化在体外³⁵.阻断巨噬细胞浸润抑制肝星状细胞的激活，并导致肝纤维化的抑制³⁶.GdCl3治疗通过选择性降低库普弗抑制HSC激活，减少肝纤维化³⁷脂联素的抗炎作用与其对巨噬细胞功能的抑制密切相关。脂联素可以使酒精摄入后肝巨噬细胞中Toll样受体-4（TLR-4）介导的信号正常化，可能是脂联素在酒精性肝病进展中的保肝作用的原因之一³⁸用脂联素治疗培养的巨噬细胞可显著抑制其吞噬活性和脂多糖诱导的肿瘤坏死因子的产生⁶重要的是，用脂联素隔夜治疗Kupffer细胞可以使慢性乙醇诱导的LPS刺激的TNF-α表达敏化正常化，使ROS的增加正常化^6,39,40脂联素的抗炎作用与抗炎介质如白细胞介素-10的表达增加有关⁴¹，由转录因子STAT3调节，STAT3是炎症反应的潜在负调节因子^19,42.阻断STAT3促进巨噬细胞活化^19,20STAT3在肝损伤中的促炎症和抗炎作用与细胞类型有关；在肝细胞中，STAT3促进炎症，而在巨噬细胞/枯否细胞中，它抑制炎症⁴³然而，巨噬细胞/Kupffer细胞在诱导肝脏炎症中起主要作用，巨噬细胞/Kupffer淋巴细胞中STAT3的抗炎作用可能主导肝细胞的促炎作用⁴³STAT3激活还促进肝脏再生，STAT3的敲除抑制了肝细胞的分裂和增殖，增强了小鼠肝脏缺血/再灌注损伤中的肝细胞损伤²⁰或肝部分切除术后⁴⁴.脂联素缺乏通过减弱小鼠STAT3磷酸化损害肝脏再生²⁴在我们的研究中，我们观察到，在TAA诱导的肝损伤中，ADP355治疗显著降低了肝脏中巨噬细胞的活性，并显著抑制了其他免疫细胞向肝脏的浸润。ADP355处理后，RAW 264.7巨噬细胞中STAT3磷酸化增强。

综上所述，我们的结果表明ADP355可以模拟脂联素的作用，对TAA诱导的肝损伤发挥治疗作用(补充图S4). 它可以促进肝脏再生，抑制肝细胞凋亡、HSC激活的纤维化和巨噬细胞介导的炎症，从而使肝脏从功能障碍中恢复。这些作用至少部分归因于ADP355激活AMPK或STAT3信号和抑制TGF-β1/SMAD2信号。作为一种易于合成的简单分子，ADP355有望在脂联素相关的临床应用中发挥作用。

方法

其他信息

如何引用这篇文章：Wang，H。等脂联素衍生活性肽ADP355在硫代乙酰胺诱导的肝损伤中发挥抗炎和抗纤维化作用。科学。代表。 6, 19445; doi:10.1038/srep19445（2016）。

补充材料

致谢

脚注

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