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神经生物学疾病。作者手稿；2017年3月1日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
神经生物学疾病。2016年3月；87: 124–133.
2015年12月29日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.nbd.2015.12.015
预防性维修识别码：项目经理4724557
尼姆斯：美国国立卫生研究院749663
PMID：26739391

PPARγ诱导的CD36上调提高新生大鼠血肿分辨率并减轻生殖基质出血后的长期神经功能缺损

杰里·弗洛雷斯,1 达蒙·克莱布,1 威廉·罗兰,1 蒂姆·勒基克,1 保罗·克拉夫特,1和约翰·H·张1,2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

生殖基质出血仍是美国早产儿发病率和死亡率的主要原因，其临床治疗进展甚微。幸存者经常患有长期的神经后遗症，包括脑瘫、精神发育迟滞、脑积水和精神疾病。生发基质出血后血块破坏正常脑脊液循环和吸收被认为是出血后脑积水发生的重要原因。我们评估了是否通过PPARγ刺激上调小胶质细胞和巨噬细胞中CD36清道夫受体的表达，PPARγ在实验性成人脑出血模型中有效，并正在进行临床评估，将使用新生大鼠生发基质出血模型来提高血肿的消融并改善长期脑后遗症。PPARγ刺激（15d-PGJ2)短期PPARγ和CD36表达水平增加，血肿消退增强，这被PPARγ拮抗剂（GW9662）和CD36 siRNA逆转。PPARγ刺激（15d-PGJ2)还减少了长期白质丢失和出血后心室扩张，改善了神经功能结果，PPARγ拮抗剂（GW9662）可逆转这些结果。因此，PPARγ诱导巨噬细胞和小胶质细胞CD36上调对提高血肿消退和改善长期脑后遗症至关重要。

关键词：PPARγ、CD36、生殖基质出血、出血后心室扩张、血肿消退

介绍

神经节隆起由位于发育中胎儿侧脑室下方尾状核头部的神经元和胶质前体细胞组成，室管膜下组织内的高血管化区域是生发基质。早产儿的脑血流波动与血流动力学和呼吸不稳定相关，再加上生发基质固有的脆弱性，通常会导致生发基质出血，这是早产儿非常常见的主要神经并发症。未成熟脑中神经节隆起室管膜下（或室周）生发区的未成熟血管破裂时，会发生生殖基质出血（GMH）(巴拉布，2010年). 仅在美国，每年约有12000名活产婴儿发生GMH，过去20年中，中度至重度GMH病例数量保持稳定(Fanaroff等人，2007年;Jain等人，2009年;Osterman等人，2015年). 临床研究表明，患有GMH的婴儿经常患有长期神经功能缺损、脑性瘫痪、精神发育迟滞、脑积水和精神障碍(Ballabh，2014年;Kadri等人，2006年). 产前糖皮质激素治疗仍是预防GMH的最佳治疗方法，但GMH发作后的临床治疗进展甚微(Roberts和Dalziel，2006年;Shankaran等人，1995年).

早产儿的血液动力学和呼吸不稳定会导致先天脆弱的生发基质血管系统中的脑血流量波动，通常导致自发性出血(Ballabh，2014年). 随后的血肿对胶质细胞和神经元施加机械压力，导致细胞毒性和坏死，并引发炎症反应，导致分泌破坏性蛋白酶和氧化物质(Lekic等人，2015年). 在成人脑出血中，临床研究表明血肿体积是最好的预后指标；血肿体积越大，预后越差(Keep等人，2005年;Xi等人，2006年). 实验性成人脑出血研究证明，更快地清除血肿对于快速改善炎症和促进神经恢复是必要的(Zhao等人，2009年;Zhao等人，2007年). 此外，血凝块直接损害GMH后脑脊液的循环和吸收，对出血后脑积水的发生有显著影响(Aquilina等人，2011年;Cherian等人，2004年). 因此，我们假设提高血肿清除率将改善GMH预后。

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，是GMH和其他出血性脑损伤后神经炎症反应的关键驱动因素(Aronowski和Zhao，2011年;Tang等人，2015). 活化的小胶质细胞向受伤部位募集血行吞噬细胞，吞噬血肿以及受损或死亡的组织(Aronowski和Hall，2005年;Cox等人，1995年). 新生儿与成人小胶质细胞在出血性脑损伤发病机制中的作用不同(Woo等人，2012年). 与成人大脑不同，在成人大脑中，小胶质细胞和巨噬细胞通过产生炎性细胞因子而导致中风后的脑损伤(Vexler和Yenari，2009年)，新生儿大脑表现出相反的情况，因为这些细胞的耗竭通过消除内源性保护机制而加剧损伤(Faustino等人，2011年).

清道夫受体CD36是一种跨膜糖蛋白，参与多种生物功能，如泡沫细胞形成、免疫细胞趋化性和凋亡细胞的吞噬作用(Woo等人，2012年). 据报道，CD36受体位于多种细胞类型的细胞表面，包括单核细胞、内皮细胞和小胶质细胞。CD36在吞噬作用中发挥重要作用，上调其表达有助于提高血肿清除率(Zhao等人，2007年). 用CD36表达基因转染非吞噬细胞将这些细胞转化为吞噬细胞(Ren等人，1995年). CD36基因缺失加重了新生小鼠急性局灶性卒中后的损伤，部分原因是减少了凋亡细胞的清除(Woo等人，2012年).

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是核激素受体超家族成员，在上调CD36表达中起主要作用(Zhao等人，2009年;Zhao等人，2007年). PPARγ刺激对几种中枢神经系统损伤和疾病的抗炎作用(Landreth等人，2008年;Pereira等人，2005年). 许多研究表明PPARγ在各种实验性卒中模型中具有神经保护作用(Pereira等人，2005年;邵和刘，2015;Woo等人，2012年;Zhao等人，2007年). 在成人脑出血（ICH）实验模型中，PPARγ激活与CD36表达上调直接相关，导致吞噬作用介导的血肿清除以及小胶质细胞和巨噬细胞对死亡或受损细胞的清除增强。PPARγ刺激降低促炎介质的表达，改善继发性脑损伤，改善ICH后的功能恢复(Zhao等人，2007年). 目前，对脑出血患者进行PPARγ刺激以提高血肿清除率和改善继发性脑损伤的临床试验(Gonzales等人，2013年). 然而，没有临床试验评估GMH患者的PPARγ刺激。

在本研究中，我们评估PPARγ刺激是否能增强新生大鼠生发基质出血模型中CD36介导的血肿消退。我们假设使用15d-PGJ刺激PPARγ2，将增加血凝块的小胶质细胞/巨噬细胞吞噬作用，减少出血后脑积水、炎症、行为功能障碍和神经元丢失，这将通过CD36敲除或PPARγ拮抗剂的使用而逆转。

材料和方法

动物和手术

所有实验程序均按照美国国立卫生研究院动物治疗指南进行，并得到洛马琳达大学动物护理和使用委员会的批准。本研究使用了260只P7 Sprague-Dawley新生幼崽（印第安纳波利斯州哈兰市），体重12-15克（大脑发育与30-32周妊娠期人类相当）。如前所述，通过立体定向注射细菌胶原酶实现生殖基质出血(Lekic等人，2012年). 用3%异氟醚（通过医用氧气和混合空气输送）麻醉幼犬，同时将其稳定在立体定向架上。在切口部位使用异丙醇，然后使用贝塔丁。在纵向平面上切开，露出颅骨并显露前角。前角的立体定向坐标如下：距硬脑膜1.6 mm（头侧）、1.6 mm（右侧）和2.8 mm（深度）。钻一个钻孔（1 mm），以1 mm/min的速度将一根27号针头插入其中。用微输液泵引导的Hamilton注射器在3分钟内注入1µL中0.3单位的梭状胶原酶VII-S（Sigma-Aldrich，MO）。完成输液后，注射后再将针头留在原位10分钟，以防止“后漏”，然后以1 mm/min的速度取出针头。取出Hamilton后，用骨蜡封闭钻孔，缝合切口部位。然后给动物注射丁丙诺啡，让它们在37°C的加热毯上恢复。当幼崽完全康复后，它们会被放回母亲身边。每只动物的手术时间约为30分钟。假动物在不输注胶原酶的情况下进行针刺。脑室内注射siRNA的程序相同，但来自前角的立体定向坐标如下：硬脑膜1.0 mm（嘴侧）、1.0 mm（左侧）和1.8 mm（深度）。

动物治疗和实验组

P7大鼠幼崽随机分为以下组：假手术组（n=38）、Vehicle组（n=38）、GMH+15d-PGJ组2（n=38），GMH+15d-PGJ2+GW9662（n=38），GMH+CD36 siRNA（n=12），GMH+15d-PGJ2+CD36（n＝12）、GMH+加扰siRNA（n＝12）。PPARγ激动剂（15d-PGJ20.1mg/kg；Sigma-Aldrich）、拮抗剂（GW9662，4mg/kg；Sigma-Aldrich）+激动剂和生理盐水（用于假手术组和载体组）在GMH后1小时腹膜内给予实验动物，然后每天一次，持续7天。CD36 siRNA（1.2 ng，Cell Signaling&Santa Cruz）和打乱siRNA（1.2ng，Santa Cru）在GMH诱导前24小时通过脑室内注射给实验动物。手术完成后，所有组均皮下注射丁丙诺啡（0.01 mg/kg）。

动物灌注和组织提取

使用异氟醚（≥5%）对动物实施安乐死，然后用冰镇磷酸盐缓冲盐水（PBS）经心灌注，用于血红蛋白测定和Western blot样本，或用冰镇PBS，然后用10%福尔马林进行组织学样本。用于血红蛋白测定和Western blot的前脑用液氮进行snap冷冻，然后在蛋白质提取或分光光度法定量之前储存在−80°C冰箱中。组织学脑样本在10%甲醛中固定至少3天，然后在30%蔗糖中固定至少三天，所有样本均保存在4°C冰箱中。然后将前脑植入最佳切割温度复合物中，并储存在−20°C的冰箱中。

血红蛋白测定

分光光度法测量用于评估出血量，使用了成熟的方案(Choudhri等人，1997年;Lekic等人，2011年;Tang等人，2004). 将冷冻提取的前脑放入含有3毫升PBS的单个玻璃管中。将组织匀浆60秒（tissue Miser均质机；Fisher Scientific，匹兹堡，PA），然后超声处理1分钟，以溶解红细胞膜。然后将产物离心30分钟，并将上清液从颗粒中分离出来。将德拉布金试剂（Sigma-Aldrich）与上清液以4:1的比例混合，静置反应15分钟。使用分光光度计（540 nm；Genesis 10uv；Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）根据常规执行的标准曲线，将吸光度计算为出血体积（µL）(Lekic等人，2011年).

颅内压（ICP）测量

在发作后28天，对动物进行麻醉，并将其固定在立体定向框架上，头部以30度角向下倾斜。进行中线皮肤切口以暴露寰枕膜。用26G Hamilton针刺穿大池，该针与Digi-Med LPA 400低压分析仪（美国肯塔基州Micro-Med-Louisville）的压力传感器相连，如前所述(Lackner等人，2013年)

西方印迹法

免疫印迹蛋白质浓度(Lekic等人，2011年)通过DC蛋白分析测定（Bio-Rad，Hercules，CA）。将每个样品30µg蛋白质装入4–20%凝胶的孔中，在50V下运行30分钟，然后在125V下运行90分钟，然后在0.3A下转移到硝酸纤维素膜上120分钟（Bio-Rad）。将膜在含0.1%吐温20的Tris缓冲盐水中的5%非脂肪乳中培养2小时。然后隔夜培养以下主要抗体：抗PPARy（1:1000；德克萨斯州达拉斯市圣克鲁斯）、CD36（1:500，德克萨斯州达拉s市圣克鲁兹）和甘露糖受体（CD206）（1:500、马萨诸塞州剑桥市ABcam）。然后将二级抗体（1:2000；加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司）涂敷在膜上，孵育2小时，然后使用ECL plus试剂盒（新泽西州皮斯卡塔韦的GE Healthcare and Life Science）进行处理。β-肌动蛋白被用作对抗抗体的内部控制物（1:1000；加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。使用ImageJ软件（4.0，Media-Conternetics，Silver-Spring，MD）分析合成蛋白免疫印迹图像的相对密度，如所述(Tang等人，2004).

组织体积分析

使用低温恒温器（Leica Microsystems LM3050S）每600µm切割10µm厚的冠状脑切片，并将其放置在聚-L-赖氨酸涂层的载玻片上。使用计算机辅助（ImageJ 4.0，Media Controlnetics，Silver Spring，MD）手工描绘脑室系统（侧脑室、第三脑室、导水管和第四脑室）、半球（皮质、皮质下）、尾状体、丘脑、海马和胼胝体（白质），对脑片进行Nissl染色形态计量学分析(Lekic等人，2011年). 这些结构是使用先前立体学研究的光学解剖原理描绘的(Avendano等人，2005年;Bermejo等人，2003年;Ekinci等人，2008年;Klebe等人，2014年;奥尔肖特，1996年;Reisert等人，1984年;Tang等人，2001). 使用以下等式计算体积：[（平均[（冠状截面面积）×间隔×截面数）(MacLellan等人，2008年).

免疫组织化学

首先在4°C下用OX-42（1:1000，ABcam）和甘露糖受体（1:1000）在10µm厚的切片上染色过夜，然后用适当的荧光共轭二级抗体孵育（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson Immunoresearch）。出血周围区域通过荧光Olympus-BX51显微镜成像，并使用MagnaFire SP 2.1B软件（纽约州梅尔维尔奥林巴斯）进行分析。每个动物组在20×（小胶质细胞）的显微镜范围内至少取6个切片进行平均，并表示为细胞/视野，如所述(Wang和Dore，2007年)

神经行为分析

如前所述，神经行为功能在GMH后28天通过一系列测试（如下所述）以盲法评估，以检测感觉运动和认知缺陷(Hartman等人，2009年;Klebe等人，2014年):脚部故障测试：将大鼠放置在地面以上的金属丝网（20×40 cm）上，允许其在网格上行走2分钟。当一只完整的爪子从格栅的开口掉落时，将记录脚部故障的数量。Rotarod测试：将大鼠放在旋转床上（俄亥俄州哥伦布市哥伦布仪器公司），旋转床由一个旋转的水平圆柱体（直径7厘米）组成，圆柱体分为9.5厘米宽的车道。当圆筒旋转时，老鼠向前走，以避免摔倒。大鼠以5 RPM或10 RPM的启动速度进行测试，加速度为每5秒2 RPM。光电束电路检测到从气缸上掉落的延迟。水迷宫试验：将大鼠放在一个装满水、墙上有空间线索的金属池（直径110厘米）中，让它们游泳寻找一个淹没的平台（直径11厘米）。每只动物连续4天每天进行10次试验，连续2次试验中的5次试验，每次试验间隔10分钟。在接下来的3天里，平台被淹没在水面以下1厘米处，老鼠必须找到并记住平台的位置。此外，每天结束时，平台被移除，动物们被允许游泳以找到平台象限。带有计算机化跟踪系统的高架摄像机（Noldus Ethovision；Noldus，Tacoma，WA）记录了游泳路径，并测量了游泳距离、游泳速度和在探测象限中花费的时间。

统计分析

采用双侧检验的I型错误率0.05和幂0.8进行幂分析，以估计样本量。数据以平均值±标准偏差表示。使用Student-Newman-Keuls事后检验对等级进行单因素方差分析，以分析行为、组织学、western blots和免疫组织化学。P值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

PPARγ刺激改善长期神经功能缺损

在Morris Water Maze评估中，与假手术组相比，载剂组的表现明显较差，但PPARγ刺激与载剂组相比改善了空间学习和记忆，与假术组相比没有显著差异。PPARγ拮抗剂逆转了治疗效果（*P<0.05对Sham；#P<0.05对Vehicle；†P<0.05对GW9662+15d PGJ2;图1.A–B). 与其他GMH组相比，治疗也显著改善了足部故障测试中的感觉运动功能（*P<0.05 vs.Sham；#P<0.05vs.Vehicle；†P<0.05 vs.GW9662+15d-PGJ2;图1.C). 然而，与溶媒组和拮抗剂组相比，治疗组的旋转感觉运动评估没有显著差异（*P<0.05 vs.Sham；#P<0.05vs.溶媒；†P<0.05-vs.GW9662+15d-PGJ2;图1.D).

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神经功能评估(A和B)莫里斯水迷宫(C类)脚部断层，以及(D类)生发基质出血后21～28天开始旋转。数值表示为平均值±SD*与假手术组相比P<0.05，与溶媒相比P<0.05†与抑制剂和激动剂相比，P<0.05。N=8个/组；和RPM，每分钟转数。

PPARγ刺激改善长期脑形态学

由于颅内压升高与脑积水有关，因此在大鼠脑卒中后4周测量颅内压。与溶媒组和PPARγ拮抗剂组相比，治疗组的ICP显著降低（*P<0.05 vs.Sham；#P<0.05vs.溶媒；†P<0.05 vs.GW9662+15d-PGJ2;图2.B). 计算出的皮层厚度与假手术平均值的比值，在溶媒和PPARγ拮抗剂组中显著降低，但PPARγ刺激组的皮层损失显著减少（*P<0.05与sham；#P<0.05与溶媒；†P<0.05与GW9662+15d-PGJ2;图3.A). 溶媒和PPARγ拮抗剂组的心室容积显著增加，但15d-PGJ2治疗降低了出血后心室扩张（*P<0.05 vs Sham；#P<0.05vs Vehicle；†P<0.05 vs GW9662+15d-PGJ2;图3.B). 白质损失是以假阳性白质的百分比表示的。PPARγ刺激减少了白质损失，但载体和PPARγ拮抗剂组的白质损失显著（*P<0.05对Sham；#P<0.05对载体；†P<0.05对GW9662+15d PGJ2;图3.C). 基底神经节丢失是指基底神经节出现在假手术中的百分比。15d-PGJ2与溶媒组相比，治疗组的基底节丢失明显减少。令人惊讶的是，GW9662组的基底节丢失与PPARγ激动剂或载体组没有显著差异（*P<0.05 vs.Sham；#P<0.05vs.vehicle；†P<0.05 vs.GW9662+15d-PGJ2;图3.D).

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生发基质出血后28天。代表性显微照片(A类)取Nissl染色脑切片(B类)颅内压（ICP），单位为毫米汞柱。注：有代表性的图片右侧的测量值表示大脑切片的位置。数值表示为平均值±SD*与假手术组相比P<0.05，与溶媒相比P<0.05†与抑制剂和激动剂相比，P<0.05。N=6个/组；毫米汞柱。

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量化(A类)皮质厚度(B类)心室容积(C类)白质损失，以及(D类)生发基质出血后28天基底节丢失。数值表示为平均值±SD*与假手术组相比P<0.05，与溶媒相比P<0.05†与抑制剂和激动剂相比，P<0.05。N=每组6个。

PPARγ刺激增强血肿分辨率，增加激活的小胶质细胞，诱导M2极化

在24小时、72小时和7天进行血红蛋白测定，以确定PPARγ在血肿消退中的作用。24小时时，与假手术组相比，所有组的脑内血红蛋白含量显著增加（*P<0.05 vs.sham；图4.A). 72小时时，与假手术组相比，所有组大脑中的血红蛋白含量显著增加，但15d-PGJ2与溶媒相比，治疗组的血红蛋白含量显著降低，而GW9662治疗组则相反（*P<0.05 vs Sham；#P<0.05 vs vehicle；†P<0.05vs GW9662+15d-PGJ2;图4.B). 第7天，与假手术组相比，只有载体和PPARγ拮抗剂组的血红蛋白含量显著高于假手术组，但PPARγ激动剂组血红蛋白含量显著低于载体和PPARγ拮抗剂各组（*P<0.05 vs.sham；#P<0.05vs.载体；†P<0.05-vs.GW9662+15d-PGJ2;图4.C). 由于在72小时后PPARγ刺激组观察到血肿分辨率显著提高，因此此时显示血肿周围区域免疫染色活化的小胶质细胞/巨噬细胞（OX-42）的代表性照片(图5.A）.第15天PGJ2与假手术组、溶媒组和PPARγ拮抗剂组相比，治疗组的小胶质细胞/巨噬细胞数量相对增加（*P<0.05 vs.sham；#P<0.05vs.溶媒；†P<0.05 vs.GW9662+15d-PGJ2;图5.B). 此外，72小时时血肿周围区域激活的小胶质细胞/巨噬细胞（OX-42）和甘露糖受体（CD206）共同定位的代表性照片显示，15d-PGJ中OX-42/甘露糖的受体表达增加2治疗组与所有其他组的比较(图5.A).

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血红蛋白测定(A类)24小时(B类)72小时，以及(C类)7天。72小时(D类)对siRNA组进行血红蛋白测定。数值表示为平均值±SD*与假手术组相比P<0.05，与溶媒相比P<0.05†与抑制剂和激动剂相比，P<0.05，与CD36 siRNA相比，%P<0.05，而@P<0.05与打乱的siRNA相比。每组N=6。

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免疫组织化学代表性图片显示(A类)用甘露糖受体和DAPI染色激活小胶质细胞（OX-42；标尺：20µm）(B类)72h时进行活化小胶质细胞定量。72小时后进行蛋白质印迹(C类)CD206表达。注：血肿周围区域位于黄色虚线（A）下方，具有代表性的GMH大脑指示IHC图像的拍摄位置。数值表示为平均值±SD*与假手术组相比P<0.05，#与溶媒相比P<0.05，†与抑制剂和激动剂相比，P<0.05，与CD36 siRNA相比，%P<0.05，而@P<0.05与打乱siRNA相比。每组N=6；和ICH，免疫组织化学。N=每组6个。

PPARγ刺激增加72小时CD36和PPARγ表达

在GMH后0、3、6、12小时和1、3、5和7天，进行了一项时间过程研究，以确定内源性PPARγ和CD36在GMH中的表达水平。与0小时相比，内源性PPARγ表达在3、6、12小时和1天时显著增加（*P<0.05与0小时；图6.A). 相应地，内源性CD36表达在3小时、6小时、12小时和1天与0小时相比显著增加（*P<0.05与0小时；图6.B)并在7天内趋于升高。在72小时时测定所有实验组的PPARγ和CD36表达水平。在15d-PGJ中PPARγ表达显著增加2与所有其他组相比（*P<0.05与Sham；#P<0.05与Vehicle；†P<0.05与GW9662+15d PGJ2;图6.C). 与PPARγ类似，CD36在15d-PGJ中的表达显著增加2组与所有其他组相比（*P<0.05 vs.Sham；#P<0.05vs.Vehicle；†P<0.05 vs.GW9662+15d-PGJ2;图6.D).

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Western blot用于时间进程研究(A类)PPARγ和(B类)GMH后0、3、6、12小时、1、3、5、7天的CD36。然后在72小时进行蛋白质印迹(C类)PPAR-γ和(D类)CD36。数值表示为平均值±SD*与假手术组相比P<0.05，与溶媒相比P<0.05†与抑制剂和激动剂相比，P<0.05。N=6个/组；h和d、小时和天。

CD36敲除逆转PPARγ激动剂增强血肿分辨率和72小时M2表达

72小时时，CD36敲除逆转了PPARγ激动剂增强的血肿消退，而在加扰siRNA组中没有逆转（*P<0.05与Sham，#P<0.05与Vehicle，%P<0.05与CD36 siRNA+15d-PGJ）2，@P<0.05与加扰siRNA+15d-PGJ相比2,图4.D). 此外，CD36敲除逆转了PPARγ甘露糖受体的表达，这在干扰siRNA组中没有逆转（*P<0.05与Sham，#P<0.05与Vehicle，%P<0.05与CD36 siRNA+15d-PGJ2，@P<0.05与加扰siRNA+15d-PGJ相比2,图5.C).

讨论

新生儿脑出血是早产儿常见的疾病。由此产生的血肿被认为是导致出血后脑积水的主要原因，因为血凝块破坏脑脊液循环和脑室吸收(Crews等人，2004年). 在成人出血性卒中模型中，血肿快速消退具有神经保护作用(赵等，2015;Zhao等人，2007年). 尤其是，PPARγ刺激上调了小胶质细胞/巨噬细胞中CD36的表达，导致成人脑出血后血产物吞噬功能增强，血肿消退更快(Zhao等人，2007年). 在本研究中，我们检测了用15d-PGJ刺激PPARγ的效果2胶原酶诱导新生大鼠GMH后血肿消退以及长期脑形态学和神经功能结果。此外，我们确定了PPARγ和CD36抑制是否逆转了15d-PDJ刺激PPARγ所观察到的治疗效果2本研究首次评估了这种治疗方法对新生儿血肿消退的影响，并首次评估了其改善长期白质丢失、出血后脑积水发展和神经功能缺损的治疗潜力。

我们评估了15d-PGJ的疗效2治疗，PPARγ激动剂，作为GMH诱导的脑损伤的潜在治疗方式，在发作后1小时给予。尽管治疗在24小时时并没有显著提高血肿的清除率，但在GMH后72小时和7天时确实显著提高了血肿的清除率(图4.A–C). PPARγ刺激显示新生儿GMH后72小时开始的血肿清除速度比成人ICH后7天更快(Zhao等人，2007年). 15d-前列腺素J2与PPARγ拮抗剂GW9662共同赞赏，逆转了15d-PGJ2GMH后72小时和7天对血肿消退的治疗效果。为了确定GMH后PPARγ和CD36的内源性表达是否发生变化，我们在GMH诱导后的0、3、6、12小时、1、3、5和7天的终点进行了Western blot时间进程。在GMH诱导后3、6、12小时和1天，内源性PPARγ表达增加，然后在3天时恢复到基线水平(图6.A). 内源性CD36表达在GMH诱导后3、6、12小时和1天显著增加，并在7天内趋于升高(图6.B). 因为内源性PPARγ和CD36表达在72小时时恢复到基线水平附近，并且因为15d-PGJ2治疗后72小时血肿消退，我们通过Western blot检测治疗对72小时PPARγ和CD36表达水平的影响。如预期，15d-PGJ2与假手术组和溶媒组以及15d-PGJ组相比，治疗组PPARγ表达显著增加2与GW9662联合用药逆转了这种效应(图6.C). 同样，15d-PGJ2与假手术组和溶媒组以及15d-PGJ组相比，治疗组CD36表达显著增加2与GW9662联合用药逆转了这种效应(图6.D).

CD36受体是一种重要的清道夫受体，位于多种细胞类型上，包括单核细胞、内皮细胞和小胶质细胞/巨噬细胞。CD36在小胶质细胞/巨噬细胞吞噬中起重要作用，上调其表达有利于血肿消退(Zhao等人，2007年). 与所有其他组相比，在治疗后的GMH动物的血肿周围区域观察到更多激活的小胶质细胞，这证明PPARγ的治疗效果依赖于这些关键免疫细胞(图5.A–B). 与假手术组相比，所有GMH组发病后的DAPI染色细胞似乎都增加了。生发基质中有许多生长和分裂的神经元和胶质前体细胞。先前的GMH研究记录了损伤后增殖细胞因子和途径的增加，如TGF-β和mTOR，我们推测增殖信号在新生儿脑出血后触发更深层的胶质增生(Lekic等人，2015年). 虽然脑细胞死亡肯定会发生，但我们推测，增殖信号与白细胞浸润增加共同促进了新生儿大脑中观察到的这些结果。虽然活化的小胶质细胞/巨噬细胞有助于成人的脑损伤，但一些证据表明，小胶质细胞或巨噬细胞对新生儿的损伤具有重要的防御机制，这可以用小胶质细胞在新生儿脑发育中的重要作用来解释(Faustino等人，2011年;哈里和卡夫，2012年). 此外，活化的小胶质细胞/巨噬细胞有两种不同的状态，一种是促炎经典激活状态（M1），另一种是免疫抑制和组织再生交替激活状态（M2）(Klebe等人，2015年). CD36刺激可促进小胶质细胞/巨噬细胞活化以及M2极化(Chavez-Sanchez等人，2014年;Kouadir等人，2012年;Rios等人，2013年). PPARγ刺激也使小胶质细胞/巨噬细胞极化为M2状态(Penas等人，2015年;Pisanu等人，2014年;Yoon等人，2008年). 为了证实GMH中的这些发现，活化的小胶质细胞和甘露糖受体（CD206）（M2标记物）的免疫组织化学共同定位显示，15d-PGJ中的共同表达增加2与其他组相比，经过处理的GMH动物，提供了更多证据表明PPARγ诱导M2极化(图5.A). 类似地，CD206蛋白印迹显示，与假手术组、仅含CD36 siRNA的GMH动物和含CD36 siRNA和15d-PGJ的GMH小鼠相比，经治疗的GMH鼠的CD206表达水平增加2治疗。有趣的是，载体处理的GMH动物表现出CD206表达水平增加的小趋势，与15d PGJ相比，这也没有实现统计学上的显著差异2治疗过的GMH动物。出血后，随着血肿周围环境转变为免疫抑制状态，M2小胶质细胞/巨噬细胞将随时间增加M2小胶质细胞/巨噬细胞在问题修复阶段发挥关键作用(Klebe等人，2015年). CD36敲除消除了载体组中观察到的趋势，与15d-PGJ相比，表达显著减少2治疗。CD36击倒也逆转了15d-PGJ2诱导CD206表达上调(图5.C). 因此，CD36对M2极化很重要，尤其是在PPARγ刺激后。为了进一步证实小胶质细胞/巨噬细胞CD36在PPARγ诱导的血凝块清除中发挥关键作用，我们使用siRNA来抑制CD36的表达。CD36击倒逆转15d-PGJ2治疗对72小时血肿消退增强的影响，而干扰siRNA无法逆转(图4.D).

在我们的长期评估中，经溶媒治疗的GMH动物有显著的皮层、白质和基底神经节丢失以及出血后心室扩张，但15d-PGJ2治疗改善了这些脑形态学疾病，PPARγ拮抗剂GW9662联合用药逆转了这些疾病(图3.A–D). 令人惊讶的是，GW9662联合政府并没有完全扭转15d-PGJ2虽然观察到了一种趋势，但其对减少基底节丢失的作用。我们的ICP测量结果与脑形态学评估结果一致，与载体和PPARγ拮抗剂组相比，治疗组的ICP水平显著降低(图2.B). 此外，经溶媒治疗的GMH动物在Morris Water Maze、Foot Fault和Rotarod试验中表现不佳，但15d-PGJ2治疗显著改善了空间记忆和运动功能，GW9662联合用药逆转了这一点(图1.A–D). 足部缺陷测试评估运动功能，旋转试验评估感觉运动协调和平衡，莫里斯·沃特马泽评估空间学习和记忆(Schaar等人，2010年). 尽管15d-PGJ2减少了脚部缺陷的数量，但在旋转试验中并没有显著提高性能。GMH和随之而来的出血后心室扩张可能导致小脑损伤，影响运动协调(Brouwer等人，2015年;Fumagalli等人，2015年;Volpe，2009年). 需要更深入的研究来阐明GMH和小脑损伤之间的病理生理学关系。虽然运动协调是旋转机器人和足部故障测试中的一个重要因素，但在加速气缸平台上保持平衡的因素使我们推测小脑损伤可能会更深刻地影响旋转机器人评估中的性能。15d-PGJ2治疗可能不足以改善GMH引起的潜在小脑损伤和继发的出血性脑积水，如果是这样的话，调节GMH后的免疫反应可能不足以促进完全功能恢复。此外，旋转试验可能不够敏感，无法检测治疗组感觉运动改善的结果，这就是为什么我们进行了多项神经功能评估。尽管如此，这些结果提供了足够的证据，证明GMH后血肿消退的增强与长期脑形态学和神经认知结果的改善相对应。最重要的是，更快的血凝块清除导致出血后心室扩张显著减少，这证明血液制品在出血后脑积水的发展中起着重要作用。

CD36清道夫受体在小胶质细胞/巨噬细胞介导的细胞碎片和血液制品吞噬作用中很重要。我们的研究结果表明，15d PGJ可刺激PPARγ2在我们的实验性GMH模型中，通过上调CD36清道夫受体的表达，增加小胶质细胞/巨噬细胞的吞噬功能，从而提高血肿清除率。我们首次报道了GMH后更有效的血肿清除对脑形态和神经功能结果的长期积极影响。血液制品破坏脑脊液循环和脑室系统的吸收，经常导致出血后脑积水。在此，我们提供证据表明，更快的血凝块清除可以减少GMH后出血后的长期心室扩张。在不损伤周围组织的情况下清除血肿是理想的，具有临床意义。PPARγ刺激可能是一种很有前途的治疗GMH患者的方法，尤其是因为吡格列酮对PPARγ的刺激已经在成人脑出血的临床试验中进行了评估。

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集锦

  • 15d-PGJ治疗2新生大鼠生发基质出血后
  • PPARγ刺激、CD36清道夫受体和小胶质细胞/巨噬细胞激活
  • 提高血肿分辨率并改善长期脑形态学结果
  • 长期神经功能缺损减轻

脚注

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