Bmi1调节线粒体功能和DNA损伤反应途径

摘要

Bmi1是转录抑制因子Polycomb家族的成员，通过调节染色质结构调节基因沉默，对造血干细胞和神经干细胞的维持和自我更新至关重要^1,2缺乏Bmi1的小鼠有许多缺陷，包括严重的神经异常、各种造血细胞谱系的改变、普遍发育不良和寿命显著缩短。以前的研究已经证明，大约50%的基因敲除小鼠在断奶前死亡，其余50%在3到20周龄的任何地方死亡^三为了理解Bmi1的作用是如何被介导的，人们高度关注了Bmi1对细胞的抑制作用墨水4a/Arf基因座，编码两个独立的肿瘤抑制因子和细胞周期调节因子p16^墨水4a和第19页^阿尔夫（参考文献4-7）。转录抑制的重要性墨水4a/Arf通过观察发现，缺乏Bmi1和p16的小鼠强调了该位点^墨水4a，第19页^阿尔夫或者这两种基因产物的神经和血液异常程度都低于Bmi1公司^–/–动物^4——6.

虽然有所改善，但缺乏Bmi1和Ink4a/Arf的小鼠仍显著小于野生型同窝小鼠，其总体存活率与Bmi1公司^–/–老鼠⁶此外，对外周有核胸腺细胞或脾细胞的数量以及骨髓微环境本身的细胞组成的检查，在Bmi1/Ink4a/Arf联合缺陷小鼠中仍然显著改变⁸因此，这些结果表明，除了抑制墨水4a/Arf基因座，无疑存在额外的Bmi1调节途径。在这里，我们证明Bmi1可以分别调节线粒体功能、活性氧（ROS）水平和DNA损伤反应（DDR）通路的激活。

Bmi1调节活性氧水平

缺乏共济失调毛细血管扩张症突变（Atm）基因产物或FOXO转录因子家族的小鼠表明，造血干细胞（HSC）数量在出生后迅速下降，每种情况下都与c-KIT内ROS水平升高有关¹Sca-1型¹林^——包括HSC的（LSK）骨髓细胞群^9,10因此，我们试图测试ROS水平是否在Bmi1公司^–/–细胞。对未分离的骨髓、纯化的LSK细胞和表达SLAM家族受体的骨髓细胞进行评估，之前的研究表明，这些细胞可以富集长期HSC细胞（LT-HSCs）¹¹证明了Bmi1公司^–/–导致ROS水平增加(图1a和补充图1). ROS水平的类似增加在已知的其他多种细胞类型中也很明显Bmi1公司^–/–小鼠，包括新鲜分离的胸腺细胞(图1b和补充图1).

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图1

缺乏Bmi1会增加ROS水平并改变线粒体功能

a、，通过DCFDA荧光评估纯化野生型（WT）或Bmi1公司^–/–骨髓细胞。b、，新鲜分离胸腺细胞中的活性氧水平。c、，WT或WT氧化还原稳态相关基因产物的定量rtPCR表达分析Bmi1公司^–/–胸腺细胞。结果标准化为Gapdh公司表达式(n个=每组3只动物*P（P）< 0.05).日期：，添加线粒体抑制剂寡霉素（0.5μg ml）后，在基础条件下完整胸腺细胞的耗氧量^–1)或在解偶联剂FCCP（1μ。细胞来源于n个=每个基因型4只动物*P（P）< 0.02.e、，新分离胸腺细胞中的相对ATP水平。测量一式三份（平均值和标准差），每组4只动物*P（P）< 0.01.f、，离体心脏线粒体的代表性耗氧量。克，络合物I或络合物II依赖性呼吸的测定状态III呼吸（平均值和标准差。；n个=每组4只动物*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01).小时，野生型和野生型中通过内源性荧光评估的NAD（P）H水平Bmi1公司^–/–胸腺细胞。我，ROS水平Bmi1公司^–/–胸腺细胞是否存在复合物I抑制剂鱼藤酮（Rot）、化学解偶联剂FCCP或NADPH氧化酶抑制剂DPI（平均值和标准日数）。；n个= 3; *P（P）< 0.05).j、，使用氧化还原荧光团MitoSox红分析胸腺细胞。

为了解释ROS升高的现象，我们利用了之前的几个基因表达研究，这些研究已经确定了多个Polycomb靶基因^1,12,13在这些已确定的靶点中，有许多基因直接参与活性氧的生成，或定位于线粒体并已知影响线粒体功能。考虑到中国LT-HSC的稀缺性Bmi1公司^–/–小鼠，我们选择分析Bmi1公司^–/–胸腺细胞，因为之前的报告已经证明Bmi1缺乏小鼠的这种细胞群受到显著干扰^三,4我们的数据表明，这些细胞在活性氧水平上存在显著差异。如中所述图1c,Bmi1公司^–/–胸腺八肽酶抑制了许多先前确定的多囊调节基因产物，这些基因产物可以调节细胞内氧化还原稳态。鉴于线粒体可以产生氧化剂，因此对其破坏作用相当敏感¹⁴，我们试图分析Bmi1公司^–/–细胞。完整的Bmi1公司^–/–胸腺细胞减少了线粒体的基础耗氧量，降低了线粒体的氧化能力(图1d). 基础ATP水平在Bmi1公司^–/–胸腺细胞(图1e)以及其他组织(补充图2). 然而，在线粒体呼吸和细胞内能量学方面观察到的差异并没有伴随着线粒体数量、结构、生物生成或降解速度方面的任何明显差异(补充图3).

与我们完整的细胞呼吸测量结果一致，我们观察到纯化蛋白的功能明显受损Bmi1公司^–/–线粒体(图1f，g). 沿电子传输链（ETC）流动的中断在Bmi1公司^–/–线粒体被认为是活性氧生成的主要来源。受损的电子流增加了超氧化物形成的可能性，并且经常伴随着线粒体还原当量的积累（例如NADH）。与这种机制一致，NAD（P）H水平在Bmi1公司^–/–胸腺细胞(图1h). 为了进一步证实Polycomb活性、线粒体功能和氧化应激之间的联系，我们接下来测量了在设置各种线粒体功能抑制剂时的ROS水平。正如预期的那样，使用复合I抑制剂鱼藤酮减少电子流增加了ROS水平(图1i). 相比之下，使用药物解偶联剂FCCP治疗，特别是降低线粒体膜电位，从而增加ETC流量，显著降低了Bmi1公司^–/–细胞。与观察到的Duox1和Duox2表达增加一致(图1c)，我们还观察到用NADPH氧化酶抑制剂DPI处理后ROS水平小幅但不显著下降(图1i). 最后，线粒体氧化还原荧光团MitoSox Red的使用为以下假设提供了额外的支持：线粒体是观察到的ROS水平升高的主要来源Bmi1公司^–/–单元格(图1j和补充图3).

抗氧化剂可以解救Bmi1公司^–/–老鼠

接下来，我们试图评估ROS水平的增加是否会导致体内观察到的表型缺陷Bmi1公司^–/–老鼠。我们随机化了四周Bmi1公司^–/–使用和不使用抗氧化剂清除剂的小鼠N个-乙酰半胱氨酸（NAC）。治疗一周后，ROS水平Bmi1公司^–/–胸腺细胞已降至接近野生型水平(图2a). 在这种减少的同时，我们注意到抗氧化剂处理的胸腺的整体大小显著增加Bmi1公司^–/–老鼠(图2b). 胸腺大小的增加还伴随着抗氧化剂治疗组胸腺细胞总数的显著增加Bmi1公司^–/–虽然是动物Bmi1公司^–/–与野生型动物相比，接受NAC治疗的小鼠胸腺细胞数量仍然减少(图2c). 以前的研究也表明Bmi1公司^–/–小鼠胸腺细胞成熟也有缺陷^三,4。如中所述图2d，从野生型小鼠中分离出的约80%的细胞是CD4⁺CD8（CD8）⁺双阳性胸腺细胞。野生型小鼠服用NAC一周后，这种分布没有明显改变。相反，CD4的频率⁺CD8（CD8）⁺未经处理的Bmi1中观察到双阳性胸腺细胞^–/–NAC给药后，小鼠明显减少，但恢复正常(图2d，e). 最后，NAC给药除了改变胸腺细胞功能外还有其他作用，因为这种干预措施似乎也部分纠正了Bmi1公司^–/–动物(图2f).

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图2

抗氧化剂治疗抢救Bmi1公司^–/–胸腺细胞

a、，从四周龄野生型（WT）小鼠或Bmi1公司^–/–小鼠在采集前随机接受NAC治疗一周。b、，4周龄小鼠的胸腺总大小要么用NAC（+）治疗一周，要么不治疗（-）。c、，4周龄时恢复的胸腺细胞总数Bmi1公司^–/–用NAC治疗一周或不治疗的小鼠（平均值和标准日数。；n个=每组4只动物）。日期：，胸腺细胞成熟度（CD4）的代表性评估⁺CD8（CD8）⁺细胞）在4周龄WT或Bmi1公司^–/–用NAC处理一周或在收集前未处理的小鼠。e、，4周龄小鼠胸腺细胞成熟的定量评估，随机接受为期一周的抗氧化剂治疗（平均值和标准差。；n个=每组4只动物）。f、，的重量Bmi1公司^–/–断奶后开始给予或不给予抗氧化剂治疗的小鼠（平均值和标准差。；n个=每组5-7只动物）*P（P）< 0.05.

定量实时聚合酶链反应（rtPCR）分析表明Bmi1公司^–/–抗氧化治疗后的小鼠在墨水4a/Arf转录(图3a). 因此，随后诱导Ink4a/Arf似乎并不需要Bmi1介导的活性氧升高。有证据表明，在某些情况下，p16升高^墨水4a这种表达可能与随后氧化剂水平的增加有关，并且似乎是必需的¹⁵因此，NAC似乎有可能正在救援Bmi1公司^–/–小鼠通过清除p16产生的氧化剂^墨水4a表达式。为了正式测试这种可能性，我们分析了从Bmi1公司^–/–小鼠或小鼠双重缺乏Bmi1公司和第16页^墨水4a(图3b和补充图4). p16的诱导^墨水4a对于观察到的ROS水平的上升似乎不需要Bmi1公司^–/–细胞。

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图3

激活DDR途径Bmi1公司^–/–胸腺细胞通过氧化还原敏感途径发生

a、，定量rtPCR分析墨水4a/Arf随机接受抗氧化治疗的小鼠胸腺细胞的表达（平均值和标准差。；n个=每组3只动物）。NS，不显著。b、，从WT获得的胸腺细胞中的ROS水平，Bmi1公司^–/–或组合Bmi1/p16^墨水4a-删除了老鼠。c、，分离胸腺细胞中氧化修饰核苷酸8-氧鸟嘌呤的水平。DAPI（4,6-二氨基-2-苯基吲哚）染色（蓝色）用于细胞核可视化。日期：，53BP1核病灶胸腺细胞取自用抗氧化剂NAC处理一周或未处理的小鼠。显示了每种情况下显示DDR激活的胸腺细胞的总百分比。e、，从WT或获得的胸腺细胞中Chk2活化的蛋白质印迹分析Bmi1公司^–/–老鼠。f、，分离后24小时培养物中原代胸腺细胞存活率的评估。

Bmi1调节DDR途径

为了了解ROS水平增加可能激活哪些其他途径，我们利用了先前的观察结果，证明氧化应激可以触发DDR途径的激活¹⁶。如中所述图3c,Bmi1公司^–/–胸腺细胞8-氧鸟嘌呤水平升高，这是氧化损伤DNA的一个稳定标记。此外，与持续的DNA损伤一致，我们观察到53BP1（也称为Trp53bp1）的核病灶增加，这是DNA损伤和DDR激活的另一个已知标志¹⁷.英寸Bmi1公司^–/–收集前用NAC处理一周的小鼠，53BP1核病灶数量显著减少(图3d). 包括Chk2在内的其他DDR组件也在Bmi1公司^–/–细胞，而抗氧化处理再次降低了这种活性(图3e). 这些结果表明Bmi1公司^–/–小鼠足以直接损伤DNA并参与DDR途径。为了进一步强调这一点，我们观察到用外源性过氧化氢处理胸腺细胞可以激活DDR途径，并且从检查2^–/–小鼠在很大程度上避免了ROS诱导的细胞死亡(补充图5). 这些结果表明，通过Chk2的缺失中断DDR通路可能对氧化应激提供一些益处Bmi1公司^–/–细胞和组织。为了正式说明这个假设，我们评估了野生型的存活率，检查2^–/–,Bmi1公司^–/–或组合Bmi1公司^–/–检查2^–/–胸腺细胞。鉴于Bmi1公司^–/–胸腺细胞在培养中迅速丧失活力，缺乏Bmi1和Chk2的胸腺细胞的存活率与野生型细胞相似(图3f). 类似的救援Bmi1公司^–/–通过补充NAC培养基也可以获得胸腺细胞(补充图6).

Chk2删除拯救Bmi1公司^–/–老鼠

进一步了解DDR途径的激活如何有助于Bmi1公司^–/–表型，我们询问缺乏Bmi1和Chk2的小鼠与Bmi1公司^–/–老鼠。先前的结果已经证明尽管Chk2缺陷细胞具有增加的放射抗性，检查2^–/–小鼠自发性肿瘤形成率不高，并且在大多数情况下，表现出与野生型小鼠相同的表型^18,19。我们首先检查了体内胸腺细胞成熟Bmi1公司^–/–或组合Bmi1公司^–/–检查2^–/–动物。如前所述，在抗氧化治疗中，胸腺和脾脏的总体大小在Bmi1公司^–/–检查2^–/–老鼠比在Bmi1公司^–/–-只有老鼠(补充图7). 同样，先前观察到的CD4数量减少⁺CD8（CD8）⁺胸腺双阳性细胞Bmi1公司^–/–在缺乏这两种基因的小鼠中，小鼠的标记显著降低Bmi1公司和检查2(图4a). 我们还注意到胸腺的整体结构发生了显著变化。与野生型小鼠相比，Bmi1公司^–/–小鼠胸腺皮质和髓质之间缺乏明显的分离(图4b). 在胸腺细胞成熟受损的其他动物模型中也发现了胸腺整体结构的类似变化^20,21相反，胸腺皮质和髓质在Bmi1公司^–/–检查2^–/–老鼠(图4b). 鉴于此检查2缺失似乎可以保护胸腺细胞免受ROS介导的细胞死亡(图3f和补充图5)我们推测，缺乏Chk2可能通过抑制凋亡来拯救胸腺细胞数量和成熟。与这一概念一致的是，细胞凋亡水平在大脑皮层增加Bmi1公司^–/–与野生型动物相比，这两种基因缺陷动物的总细胞凋亡水平降低Bmi1公司和检查2(图4c). 正如之前在抗氧化处理中观察到的Bmi1公司^–/–检查2^–/–小鼠似乎不是诱导墨水4a/Arf轨迹(图4d和补充图8). 类似地，删除检查2不会直接改变Bmi1表达缺失诱导的活性氧水平(补充图9). 有趣的是，NAC治疗和检查2删除在抢救方面稍微更有效Bmi1公司^–/–胸腺细胞数量和成熟度检查2仅删除，表明ROS的某些影响可能与DDR反应无关(补充图10).

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图4

Chk2缺失对DDR通路的抑制可挽救多个缺陷Bmi1公司^–/–老鼠

a、， 检查2删除恢复体内胸腺细胞成熟Bmi1公司^–/–老鼠。WT，野生型。b、，WT胸腺的结构，Bmi1公司^–/–和组合Bmi1公司^–/–检查2^–/–老鼠。箭头指向正常的髓质区域。c、，胸腺皮层区域的代表性TUNEL染色。日期：，定量rtPCR分析墨水4a/Arf导入Bmi1公司^–/–或组合Bmi1公司^–/–检查2^–/–胸腺细胞（平均值和标准差。；n个=每组3只动物）。e、，LSK细胞进入全身骨骼的频率箭头(*P（P）< 0.01; 平均值和标准差。，n个=每组6只动物）。f、， 体内将等量的WT骨髓细胞注入致死性照射小鼠的CFU-S，Bmi1公司^–/–或组合Bmi1公司^–/–检查2^–/–小鼠(*P（P）< 0.01; 平均值和标准差。，n个=每组5只动物）。克，竞争性再生四个月后的外周血成分，其中等量的WT竞争性骨髓细胞（CD45.1）和Bmi1公司^–/–检查2^–/–将供体骨髓（CD45.2）移植到受照射的宿主（CD452）中。我们几乎没有观察到捐赠者的贡献Bmi1公司^–/–检查2^–/–经过这种竞争性的重新繁殖实验后的细胞。小时，WT的代表性外观，Bmi1公司^–/–或组合Bmi1公司^–/–检查2^–/–老鼠。我，6周龄时体重分析(*P（P）< 0.01; 平均值和标准差。；n个=每组6人）。j、，小脑结构缺陷Bmi1公司^–/–通过Chk2缺失拯救小鼠。k、，的寿命Bmi1公司^–/–具有不同Chk2状态的小鼠。P（P）< 0.05检查2^+/–与检查2^+/+和P（P）<0.001检查2^–/–与检查2^+/+;n个每个基因型≥15只动物。我，Polycomb蛋白Bmi1通常同时抑制墨水4a/Arf导致p16降低的基因座^墨水4a和第19页^阿尔夫表达以及调节线粒体功能以降低ROS水平并抑制DDR通路的激活。Ink4a/Arf和DDR的激活分别与肿瘤抑制和干细胞老化有关。

接下来，我们评估了缺乏Chk2是否也能提高Bmi1公司^–/–造血干细胞或祖细胞。为了解决这个问题，我们测量了两种细胞中LSK细胞的数量Bmi1公司^–/–或组合Bmi1公司^–/–检查2^–/–老鼠。这种细胞群通常被认为包含丰富的祖细胞，以及罕见的长期再生细胞。如中所述图4e，缺乏这两者的小鼠中LSK细胞的数量Bmi1公司和检查2明显高于Bmi1公司^–/–动物。接下来，我们试图评估从Bmi1公司^–/–检查2^–/–老鼠。来自Bmi1公司^–/–小鼠的在体外结肠形成能力，而Bmi1公司^–/–检查2^–/–骨髓细胞显著改善(补充图11). 再过一段时间体内在祖细胞功能测试中，我们测量了注射总骨髓（1×10）后形成的脾集落形成单位（CFU-S）⁵细胞）转化为辐照宿主。再次使用此体内在祖细胞功能测试中，我们发现Bmi1公司^–/–骨髓在Bmi1公司^–/–检查2^–/–老鼠(图4f).

尽管这些结果表明检查2删除后Bmi1公司^–/–祖细胞，它们并没有解决长期再生能力是否也有伴随改善。为了验证这一点，我们使用野生型、，Bmi1公司^–/–,Bmi1公司^+/–或组合Bmi1公司^–/–检查2^–/–骨髓。如前所述^1,8与干细胞维护和自我更新的缺陷一致，我们观察到Bmi1公司^–/–骨髓无法参与这种长期的重新人口测定(补充图12). 我们还观察到Bmi1公司^–/–检查2^–/–骨髓(图4g和补充图12). 因此，我们得出结论，鉴于Bmi1公司^–/–检查2^–/–小鼠的LSK细胞数量增加，祖细胞功能明显改善检查2无法挽救自我更新的缺陷Bmi1公司^–/–老鼠。

以下方面的改进Bmi1公司^–/–通过同时删除检查2超越胸腺细胞和造血祖细胞。事实上，这些双缺陷小鼠的整体外观与Bmi1公司^–/–动物(图4h). 这也伴随着整体体重的显著增加(图4i). 此外，鉴于Bmi1公司^–/–小鼠有严重的共济失调，这种表型在Bmi1公司^–/–检查2^–/–动物。与这种改善相一致的是，双缺陷小鼠的小脑细胞数量显著增加，并且比在Bmi1公司^–/–老鼠(图4j). 类似地，然而Bmi1公司^–/–雄性和雌性小鼠都是不育小鼠Bmi1公司^–/–检查2^–/–小鼠能够产生活的后代。相反检查2没有挽救之前描述的轴向骨骼变化，因为我们观察到大约80%的Bmi1公司^–/–检查2^–/–与正常的7根椎体胸骨肋骨相比，小鼠有6根肋骨^三.

最后，我们注意到Bmi1公司^–/–在年龄匹配的小鼠中基本上不存在Bmi1公司^–/–检查2^–/–老鼠(补充图13). 根据这些观察结果，我们询问缺乏Chk2是否可以延长缺乏Bmi1的动物的中位寿命和最大寿命。在我们的殖民地Bmi1公司^–/–小鼠大约1个月大，基本上所有小鼠都在3-4个月大时死亡(图4k). 删除一份检查2提供了生存优势，而同时删除检查2更有效，延长了患者的中位生存期Bmi1公司^–/–检查2^–/–小鼠约6个月。

结论

我们证明，Bmi1的缺失导致线粒体功能和ROS稳态相关基因产物集合的表达增加。缺乏Bmi1的细胞具有明显的线粒体功能障碍，伴随着活性氧持续增加，足以参与DDR途径。抗氧化剂治疗或通过以下方法中断DDR检查2删除大大改进了Bmi1公司^–/–老鼠。我们的观察进一步表明Bmi1公司^–/–小鼠，ROS独立于Ink4a/Arf途径发挥作用。此外，尽管在Bmi1公司^–/–鼠标删除墨水4a/Arf基因座导致LT-HSC缺陷的实质性挽救，值得注意的是检查2缺失仅限于非常早期的造血祖细胞。

启动DDR响应是年龄相关损伤的自然结果。例如，与年轻的HSC相比，从老年小鼠中纯化的HSC显示出γ-H2AX核病灶水平增加，这是DNA损伤的标志²²虽然这些旧的HSC的绝对数量没有下降，但DDR的激活与干细胞功能的损害相关。同样，在一些DNA修复装置的不同部件存在遗传缺陷的小鼠遗传模型中，也有证据表明移植HSC的功能能力降低^23,24此外，最近的证据表明，癌症干细胞的自我更新也可能受到肿瘤诱导的DNA损伤的限制²⁵在其他动物模型中，p16随年龄增长而增加^墨水4a表达与干细胞功能的年龄依赖性下降有关²⁶此外，在几个独立模型中，删除第16页^墨水4a导致神经、胰腺和造血干细胞的功能能力提高^27——29因此，DDR途径和p16的升高^墨水4a与干细胞和祖细胞衰老和功能障碍有关。在干细胞和祖细胞室外，Ink4a/Arf基因座的激活和DDR通路的参与也分别与介导由各种应激诱导的细胞衰老、生长停滞和/或细胞死亡有关^30,31这两条通路的激活被称为一个重要的肿瘤抑制屏障，因为这两条途径都是受损细胞增殖或繁殖的有效抑制剂。有趣的是，我们的数据表明，Bmi1的缺失导致这些应激激活和肿瘤抑制途径同时参与，并且这两种途径似乎分别对肿瘤的整体表型有贡献Bmi1公司^–/–老鼠(图4l). 此外，干细胞在生物体整个生命周期中持续存在的必要性表明，这些细胞可能对限制活性氧的产生有特别严格的要求。我们的结果表明，Polycomb蛋白家族可能具有独特的位置，能够与整个干细胞生物学协调调节线粒体功能和氧化还原稳态。

方法

补充材料

致谢

脚注

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