《柳叶刀肿瘤学》。作者手稿；PMC 2016年1月19日提供。
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用生殖系免疫组织化学方法检测副神经节瘤和嗜铬细胞瘤SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司基因突变的回顾性和前瞻性分析
Josephine Nefkens Institute病理学系（F H van Nederveen MD、J Gaal MD、E Korpershoek BSc、E M C A de Bruyn BSc，H F B M Sleddens BSc、H Dannenberg MD、B-J Petri MD、P Derkx BSc、F Ferrau MD，J François BSc，R R de Krijger MD，W N M Dinjens PhD），临床遗传学系（R A Oldenburg MD），荷兰鹿特丹大学医学中心Erasmus MC生物统计学系（W C J Hop PhD）、内分泌学内科（W W de Herder MD）、外科（M-P F M Vrancken Peeters MD）和耳鼻喉科（A van Linge MD）；瑞士苏黎世特里姆利国立病理研究所（P Komminoth MD教授）；INSERM，U970，法国巴黎，巴黎笛卡尔大学，法国巴黎梅德克纳学院，法国巴黎法兰西大学（J Favier博士，J Rivière理学学士，A-P Gimenez-Roqueplo教授，医学博士）；美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院生殖与成人内分泌项目（医学博士K·帕克教授）；英国牛津大学亨利·威科姆分子生理学大楼（P J Pollard MD）；意大利佛罗伦萨大学临床病理学系（M Mannelli教授，医学博士）；荷兰莱顿大学医学中心人类遗传学系（J-P Bayley博士）；德国慕尼黑Klinikum Rechts der Isar病理科（A Perren MD）；德国吉森Justus-Liebig-Universität大学人类基因研究所（S Niemann博士）；荷兰奈梅亨拉德布大学奈梅亨医学中心医学系（J W M Lenders医学博士教授）、病理学系（A A Verhofstad医学博士）；荷兰马斯特里赫特马斯特里赫斯特大学肿瘤与发育生物学学院GROW病理学系（医学博士A P de Bruine教授）；英国伯明翰大学生物医学研究所医学和分子遗传学系和伯明翰女子医院西米德兰地区遗传学服务部（E R Maher医学博士）；巴黎解剖病理服务中心（F Tissier MD）科钦医院协助Publique-Hópitaux de Paris；巴黎协力医院，欧洲医院，解剖病理学服务中心，（T Méatchi MD，C Badoual MD），高血压病服务中心，阿玛医学院，盖内蒂克服务中心（A-P Gimenez-Roqueplo教授），法国巴黎；巴黎迪卡尔大学，巴黎笛卡尔学院，INSERM，U567，法国巴黎科钦学院（F Tissier MD）；法国巴黎科钦医院Rares de la Surrénale参考疾病中心（医学博士J Bertherat教授）；希腊塞萨洛尼基Hippokration总医院病理科（D Alataki MD）；安特卫普大学病理学实验室，安特卫p大学医院，Edegem，比利时（E Van Marck教授医学博士）；和德国德累斯顿卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯大学医院内科III（J W M Lenders MD教授）
*这些作者对这篇论文贡献均等
†Verhofstad博士于2008年3月去世
‡这些作者应被视为平等的最后作者
总结
背景
暗色细胞瘤和副神经节瘤是神经内分泌肿瘤，偶发性发生于多种遗传性肿瘤综合征，包括暗色细胞癌-副神经节肿瘤综合征。该综合征是由琥珀酸脱氢酶B的种系突变引起的(SDHB公司)，C(SDHC公司)，或D(SDHD公司)基因。临床上，尽管10-30%的明显散发的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤具有生殖系，但嗜铬细胞细胞瘤-副神经节细胞瘤综合征往往未被识别SDH公司-基因突变。尽管有这些数字，但对发色细胞瘤和副神经节瘤的突变筛查SDH公司由于时间和资金的限制，检测嗜铬细胞瘤-副神经节瘤综合征的基因很少被使用。我们研究了SDHB免疫组织化学是否可以有效区分SDH公司-相关和非-SDH公司-回顾性和前瞻性大型肿瘤系列中相关的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤。
方法
对220例肿瘤进行SDHB免疫组化。我们对175例具有已知生殖系突变状态的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的两个回顾性系列进行了研究。此外，对一组前瞻性的45例嗜铬细胞瘤和副神经节瘤进行SDHB免疫染色，然后进行SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司突变测试。
调查结果
SDHB蛋白在所有102例嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中均无表达SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司突变，但在与多发性内分泌肿瘤2型、von Hippel-Lindau病和神经纤维瘤病1型相关的所有65例神经节旁肿瘤中都存在。53例无综合征种系突变的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中，47例（89%）显示SDHB表达。SDHB免疫组织化学检测肿瘤组织中SDH公司前瞻性序列的突变率分别为100%（95%CI 87-100）和84%（60-97）。
解释
嗜铬细胞瘤-副神经节瘤综合征可以通过免疫组化程序可靠诊断。SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司种系突变检测仅适用于SDHB阴性肿瘤患者。SDHB公司对嗜铬细胞瘤和副神经节瘤进行免疫组织化学染色可提高嗜铬细胞癌-副神经节细胞瘤综合征的诊断水平。
介绍
嗜铬细胞瘤和副神经节瘤是罕见的，通常是良性的，高度血管化的肿瘤，两者都起源于神经嵴衍生的嗜铬细胞。棕色素细胞瘤一词仅用于肾上腺内肿瘤，而类似但肾上腺外肿瘤则被称为副神经节瘤。副神经节瘤又分为交感和副交感副神经节肿瘤，这取决于它们的位置和儿茶酚胺的产生。副交感神经副神经节瘤位于头部和颈部，通常不产生儿茶酚胺，而交感神经副节瘤位于腹部交感干沿线，通常产生儿茶酚胺。1
嗜铬细胞瘤和副神经节瘤偶尔发生，并伴有多种遗传性肿瘤综合征，包括2型多内分泌肿瘤（MEN2）房地产税基因生殖系突变），von Hippel-Lindau（VHL）病（由VHL（甚高频）基因），神经纤维瘤病1型（NF1NF1型基因生殖系突变）和嗜铬细胞瘤-副神经节瘤综合征。2,三后一种综合征是最常见的遗传病，表现为副神经节瘤，由SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司基因。该综合征的特征是家族性发生色素细胞瘤或副神经节瘤，通常发生在年轻时，并且通常是多灶性疾病，复发风险增加，恶性肿瘤发生率增加SDHB公司突变。4
SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司编码线粒体复合物II的四个亚基中的三个亚基，即琥珀酸-双醌氧化还原酶（琥珀酸脱氢酶），位于线粒体需氧电子传递链和三羧酸循环之间的十字路口。5最近的研究表明，SDH失活通过抑制缺氧诱导因子（HIF）-脯氨酰羟化酶诱导血管生成和肿瘤发生。6这个SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司基因是真正的肿瘤抑制基因，因为在嗜铬细胞瘤-副神经节综合征肿瘤中发现了双等位基因失活（肿瘤中相应野生型等位基因的遗传失活种系突变和获得性失活突变）。7
除NF1综合征外，皮肤咖啡色斑点是其特征，8遗传性嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者通常没有临床检测。在大量已发表的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者中，研究表明25-30%的患者具有遗传形式，12%的明显散发的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者在VHL（甚高频）,SDHB公司，或SDHD公司基因。三,7——9遗传性嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者的低诊断率是多种因素综合作用的结果，包括缺乏家族信息、遗传性和散发性病例的年龄分布重叠、去卵巢突变、不完全外显率(SDHB公司)，父母对外显率的影响(SDHD公司)疾病的表型异质性以及临床医生的认识不足。专家们对是否转塔,VHL（甚高频）,SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司所有嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者都应进行基因检测。许多专家主张，分子基因检测应针对符合特定临床标准的患者。4,10——12然而，可靠的临床指标表明SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者通常没有生殖系突变。
隐性遗传在明显散发副交感神经副神经节瘤患者中最为明显，高达34%的患者在SDHD公司。13检测嗜铬细胞瘤-副神经节瘤综合征（嗜铬细胞炎或副神经节肿瘤家族史、多灶性疾病、发病年龄较低和恶性肿瘤）的特异性高但敏感性低的临床适应症不足以正确诊断该综合征。遗传性嗜铬细胞瘤-副神经节瘤综合征的检测对嗜铬细胞癌和副神经节肿瘤患者及其家人至关重要，因为他们发展为多发性、多种恶性肿瘤的风险增加。4,14——16此外，在识别SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司种系突变，可以对患有副神经节肿瘤的个体患者和携带突变的任何家庭成员进行监测。突变分析SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司一直提倡在所有没有明确临床或家族适应症的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤病例中诊断嗜铬细胞炎-副神经节肿瘤综合征。16尽管SDH公司-通过对所有嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者的突变分析，将经常发现突变携带者，大多数病例都没有突变，这使得这种基因筛查策略成为一种劳动密集型和经济要求高的程序。嗜铬细胞瘤-副神经节瘤综合征肿瘤与散发性嗜铬细胞癌和副神经节肿瘤的不同之处在于存在SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司突变，除了少数偶然情况外，17,18在真正散发的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中未发现。尽管存在这种基因型差异，但目前尚不可能在散发性嗜铬细胞瘤和副神经节瘤以及嗜铬细胞炎-副神经节肿瘤综合征相关肿瘤之间进行可靠的表型鉴别。在本研究中，我们确定了SDHB免疫组织化学在区分SDH公司-相关和非-SDH公司-在两个不同中心的大型回顾性和前瞻性研究中发现相关的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤。
方法
患者
采用SDHB免疫组织化学方法对两组回顾性的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤进行了研究（荷兰鹿特丹的Erasmus MC，110例；法国巴黎的欧罗巴州Georges Pompidou和Cochin，65例）。这些系列包括1982年至2007年间在伊拉斯谟MC诊断的嗜铬细胞瘤，1995年至2007年在INSERM U970诊断的嗜铬细胞瘤，1993年至1998年在伊拉斯姆斯MC诊断的副神经节细胞瘤，以及1993年至2008年在INSERM U970中诊断的副节细胞瘤。这个系列被扩大了，增加了一些种系突变SDHB公司,SDHC公司和SDHD公司来自其他中心的病例，具有尽可能多的不同突变。总的来说，该系列包括175例福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）肿瘤（101例嗜铬细胞瘤、58例副神经节瘤、3例转移瘤和13例位置不明的副神经节肿瘤），包括24例房地产税，29VHL（甚高频）, 12NF1型, 34SDHB公司, 38SDHD公司，四个SDHC公司生殖系突变病例和34例散发病例。
此外，还对45例前瞻性肿瘤（6例嗜铬细胞瘤和39例副神经节瘤）进行了SDHB免疫组化，其中SDH公司-基因状态事先未知。这一前瞻性系列包括2002年至2008年间在伊拉斯谟MC诊断的所有副神经节瘤，以及2008年诊断的所有嗜铬细胞瘤。从该系列中获得SDHB免疫组化结果后，SDH公司-进行基因突变分析。所有调查案件的详细信息见网络附录。在患者知情同意的情况下，对这些患者及其家属的突变状态进行现场检测。根据荷兰医学科学协会联合会制定的组织适当二次使用行为准则，对前瞻性系列进行匿名评估。该研究获得了机构审查委员会的伦理批准（CPP Paris Cochin，2007年1月）。
程序
使用了两种不同的抗SDHB的一级抗体：小鼠单克隆克隆21A11（NB600-1366；美国科罗拉多州利特尔顿市Novus Biologicals；1:50）和兔多克隆HPA002868（Sigma-Aldrich Corp；美国密苏里州圣路易斯；1:500）。抗体应用于常规FFPE档案组织。在Starfrost Plus（Knittel Gläser；德国布伦瑞克）玻璃载玻片上切割并安装4-6μm截面。将切片脱蜡，再水化，在Tris–EDTA缓冲液（pH 9·0或柠檬酸盐缓冲液，pH 6·0，100°C）中微波加热15分钟，在自来水中冲洗，然后在3%H中孵育2O（运行）2在PBS中放置20分钟。SDHB抗体在正常抗体稀释剂（荷兰Duiven Klinipath）中稀释，载玻片在4°C下与100μL每张载玻片孵育过夜，然后在pH值为8.0的Tris–Tween中冲洗。使用Dako ChemMate envision辣根过氧化物酶30分钟（100μL/片；丹麦Glostrup的Dako envision试剂盒），然后用磷酸盐缓冲盐水冲洗。将四氢二氨基联苯胺（100μL/载玻片；Dako envision试剂盒）涂抹两次5 min，然后用蒸馏水冲洗载玻片。玻片用哈里斯苏木精复染1分钟，用自来水冲洗，脱水，并用盖玻片覆盖。在阴性对照反应中，稀释缓冲液中省略了主要抗体，这在所有情况下都会导致完全没有染色。人类心肌、肾上腺、肝脏和结肠组织被用作阳性对照。这些组织在细胞质中显示出强烈的颗粒染色，带有两种抗体。在嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中，围绕肿瘤细胞Zellballen的纤维血管网的正常基质细胞作为每个样本的内部阳性对照，也显示出与阳性对照样本相同的强烈颗粒细胞质染色。
病理学家对标本的突变状态一无所知，他们对来自鹿特丹和巴黎的回顾性系列的免疫组织化学结果进行了独立评分。在进行突变分析之前，研究人员或病理学家对前瞻性序列的免疫组化结果进行评分。
用50个5μm切片（约10 mg）进行Western blot，这些切片取自5个冷冻的嗜铬细胞瘤组织样本，这些样本来自于SDHB公司（EX3del），SDHD公司（p.Asp92Tyr），房地产税（p.Cys634Arg），VHL（甚高频）（p.Arg64Pro），以及NF1型（临床确定）。此外，从携带SDHB公司突变，来自正常肾上腺。将这些组织转移到100μL 1×Laemmli样品缓冲液中，然后在室温下培养15分钟。接下来，将样品搅拌15 s，然后在100°C下培养5 min。然后在10%SDS-PAGE凝胶上运行等量的样品。电泳后，将蛋白质转移到Immobilon-P膜（Millipore，Temecula，CA，USA）并进行免疫印迹。21A11和HPA002868抗体均用于蛋白质印迹，抗β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich；1:10000）用作蛋白质印迹量的对照。
为了检测肿瘤中SDHB的免疫组化染色缺失是否与SDH酶活性降低有关，根据Pearse的研究，进行了SDH酶组织化学19稍作修改。将来自用于western印迹的相同肿瘤样品的冷冻切片在37°C下与SDHenzyme底物溶液（含8.3 mmol/L NaH）孵育1h2人事军官4.H型2O、 33·3 mmol/L钠2高性能操作4.2小时2O、 41·7 mmol/L钠2C类4H（H）4O（运行）4，2·5 mol/L硝基四氮唑（N-6876，Sigma-Alrich），0·22 mmol/L AlCl2.6小时2O、 0.13 mM氯化钙2，25 mM钠2HCO公司三和0.17 mmol/L甲基硫酸吩嗪（P9625，Sigma-Aldrich）。在水中漂洗两次后，将载玻片在4°C下，在甲酰胺大分子dex溶液（含有10 mL 37%甲醛，10 mL 1%氯化钙2，80 mL宏指数[Pharmalink，瑞典斯德哥尔摩]）。再次在水中冲洗载玻片三次后，用imsolmount（Klinipath，Duiven，Netherlands）安装载玻片，并用盖玻片覆盖。采用快速冷冻的健康三头肌组织作为阳性对照。作为阴性对照，来自相同肿瘤组织的切片在省略了硝基蓝四氮唑的缓冲液中培养。
突变分析房地产税,VHL（甚高频）,SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司对175例回顾性肿瘤进行了基因分析。4,20为了进行这些分析，从1993年至2008年期间，从FFPE肿瘤和正常组织或外周血中提取DNA。使用描述的标准程序分离DNA，并通过单链构象多态性分析（SSCP）进行突变分析，然后对PCR产品进行直接、内部或商业（荷兰莱顿Baseclear）测序。13,20,21通过现场测序对其他中心的额外样本进行突变分析，并在Erasmus MC和INSERM U970进行验证。对所有34例散发病例进行突变分析，直接测序开放阅读框，包括外显子-内含子边界SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司基因。4
还对45例前瞻性肿瘤进行了研究SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司如前所述，通过对包括所有外显子-内含子边界在内的开放阅读框架进行直接测序而发生突变。20此外，对该序列中存在的大基因组缺失进行了研究SDH公司使用商用试剂盒（SALSA MLPA P226；荷兰阿姆斯特丹MRC Holland）通过多重连接依赖性探针扩增（MLPA）检测基因。
统计分析
根据是否存在SDH公司突变，以及SDHB免疫组织化学检测SDH公司检测突变。在前瞻性系列中，我们测试了SDHB免疫组织化学检测结果与SDH公司使用Fisher精确测试的突变状态。使用精确二项式方法计算95%置信区间。使用10.0版STATA进行分析。
资金来源的作用
赞助商在研究设计、数据收集、分析、数据解释或本文写作中均未发挥任何作用。FHN、JG、EK、JF、APGR、RRK和WNMD可以访问原始数据。通讯作者可以完全访问所有数据，并最终负责将手稿提交出版。
结果
对所有220个肿瘤样本进行免疫组织化学染色。在这些肿瘤中，有102个有种系SDH公司突变（36SDHB公司，五个SDHC公司和61SDHD公司)SDHB免疫组化均为阴性(). 在四个SDH公司-突变肿瘤(SDHB公司p.Cys98Arg和p.Pro197Arg，以及SDHD公司p.Asp92Tyr和c.169_169+9delTGTATGTTCT）在肿瘤细胞中可见弱而弥散的胞质SDHB免疫反应，与肿瘤内纤维血管网正常细胞中的强斑点模式明显不同(). 然而，具有相同突变的独立肿瘤样本(SDHB公司p.Pro197Arg和SDHD公司p.Asp92Tyr）对SDHB免疫染色明显呈阴性。因此，肿瘤细胞中的这种弱弥散细胞质染色被认为是一种非特异性背景伪影，并被评分为阴性。65个肿瘤在房地产税（24例），VHL（甚高频）（29例），或NF1型（12例，典型诊断），免疫组化均显示SDHB表达(). 在剩下的53个肿瘤中，其中6个肿瘤是SDHB阴性的房地产税,VHL（甚高频）,SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司基因被发现了，也没有NF1型检测到基因参与。结果摘要列于网络附录中提供了肿瘤特征的综合信息，包括突变类型和结果。
SDHB免疫组织化学嗜铬细胞瘤和副神经节瘤SDHB免疫组化。（A） 伴发暗色细胞瘤SDHB公司突变。（B） 伴发副神经节瘤SDHC公司突变。（C） 伴发副神经节瘤SDHD公司突变。（D） 伴发暗色细胞瘤VHL（甚高频）突变。（E） 伴发暗色细胞瘤房地产税突变。（F） NF1患者的暗色细胞瘤（临床诊断）。注：非-SDH公司突变肿瘤（D、E和F）。肿瘤细胞中缺乏SDHB免疫染色SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司-突变肿瘤，在瘤内纤维血管网（A、B和C）的正常细胞中呈阳性染色。在SDHD公司-可见突变肿瘤（C）弥漫细胞质背景染色，与瘤内纤维血管网染色明显不同。
表1
| 编号 | 基因
变异的 | 性别
（男/女） | 年龄范围
（年；平均值） | 暗色细胞瘤 | 副神经节瘤 | SDHB公司
免疫组织化学
积极的 | SDHB公司
免疫组织化学
消极的 |
|---|
| NF1型 | 12 | NF3型 | 3/9 | 29–67 (44·2) | 12 | 0 | 12 | 0 |
| 门2 | 24 | 房地产税 | 8/16 | 18–76（35.6） | 24 | 0 | 24 | 0 |
| VHL（甚高频） | 29 | VHL（甚高频） | 2013年12月（库存4件） | 7–62 (25·6) | 21（库存3件） | 5 | 29 | 0 |
| 暗色细胞瘤-副神经节瘤 | 36 | SDHB公司 | 2012年13月（库存11件） | 10–63 (34·6) | 11（库存7件） | 18 | 0 | 36 |
| 暗色细胞瘤-副神经节瘤 | 5 | SDHC公司 | 2/3 | 15–47 (30·6) | 0 | 5 | 0 | 5 |
| 暗色细胞瘤-副神经节瘤 | 61 | SDHD公司 | 25/35（库存1件） | 16–72 (40·9) | 5（库存3件） | 53 | 0 | 61 |
| 零星的 | 53 | 无 | 第17页，共2页 | 12–79 (49·3) | 34（1U） | 18 | 47 | 6 |
在前瞻性研究中，敏感性和特异性分别为100%（95%CI 87-100）和84%（60-97）。表明SDHB免疫组化检测结果与是否存在SDH公司突变（p<0.0001；Fisher精确检验）。
表2
根据SDH相关和非SDH相关肿瘤亚组的SDHB免疫组化检测结果
| 肿瘤数量 | SDHB免疫组化阴性 | SDHB免疫组化阳性 | 灵敏度（95%置信区间） | 特异性（95%CI） |
|---|
| 回顾性的 |
|
| SDH相关 | | | | | |
| SDHB公司 | 34 | 34 | 0 | 100% (90–100) | ·· |
| SDHC公司 | 4 | 4 | 0 | 100% (40–100) | ·· |
| SDHD公司 | 38 | 38 | 0 | 100%（91–100） | ·· |
| 非SDH相关 | | | | | |
| 房地产税 | 12 | 0 | 12 | ·· | 100% (74–100) |
| VHL（甚高频） | 24 | 0 | 24 | ·· | 100% (86–100) |
| NF3型 | 29 | 0 | 29 | ·· | 100% (88–100) |
| 零星的 | 34 | 三 | 31 | ·· | 91% (76–98) |
|
| 预期的 |
|
| SDH相关 | 26 | 26 | 0 | 100% (87–100) | ·· |
| 非SDH相关 | 19 | 三 | 16 | ·· | 84% (60–97) |
SDHB免疫组织化学在三例嗜铬细胞瘤的冷冻切片上进行SDHD公司突变和一个带有房地产税突变，结果与FFPE组织切片相当：正常细胞中的斑点染色模式和SDHD公司-突变的肿瘤细胞。FFPE和冷冻组织上SDHB免疫反应模式的可比性是免疫组织化学结果特异性的额外指示。SDHB蛋白在两种组织中的表达均降低SDHB公司-突变和SDHD公司-western blotting证实了突变肿瘤(). 此外，通过酶组织化学法测定SDH酶活性的缺失。这个SDHB公司-相关和SDHD公司-除瘤内纤维血管网的正常细胞呈强染色外，相关肿瘤没有SDH活性(). 相比之下，三头肌组织中存在较强的SDH酶活性房地产税-相关肿瘤组织()。
蛋白质印迹和酶组织化学结果（A） 用来自Novus Biologicals NB600-1366（SDHB I）和Sigma HPA002868（SDHB-II）的SDHB抗体以及具有不同突变的嗜铬细胞瘤的β-actin进行Western blot检测。SDHB案例：SDHB公司外显子3缺失；SDHD案例：SDHD公司p.Asp92Tyr错义突变；RET案例：房地产税p.Cys634Arg错义突变；VHL案例：VHL（甚高频）p.Arg64Pro错义突变；NF1病例：临床定义的NF1*正常是指患者淋巴结中的溶血物SDHB公司突变。†正常是健康肾上腺的裂解物。SDH-酶组织化学结果：（B）患有黑色素细胞瘤的肿瘤细胞中SDH活性的丧失SDHD公司p.Asp92Tyr突变，但在瘤内纤维血管网的正常细胞中保持活性（箭头所示）；（C） 在肿瘤和正常细胞中有较强的SDH活性转塔p.Cys634Arg突变。
讨论
本研究结果表明，常规FFPE副神经节瘤和嗜铬细胞瘤的SDHB免疫组化可揭示其存在SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司生殖系突变具有高度的可靠性。肿瘤细胞中未发现SDHB染色，无论是否SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司是突变的，无论突变类型是错义、无义、剪接位点还是移码。使用两种SDHB抗体（Sigma小鼠单克隆21A11和Novus兔多克隆HPA002868）通过免疫组织化学获得的SDHB蛋白表达结果相同。两种抗体均可用于SDHB的免疫组化检测。
在分析的220个独立肿瘤中，102个有种系SDH公司突变（36SDHB公司，五个SDHC公司、和61SDHD公司)SDHB免疫染色均为阴性。65个肿瘤在房地产税（24例），VHL（甚高频）（29例）或NF1型（12例，表型诊断），免疫组化均显示SDHB表达。在剩下的53个肿瘤中房地产税,VHL（甚高频）,SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司基因，也不是NF1型检测到基因参与，但有6个肿瘤的SDHB免疫染色呈阴性。这六种肿瘤中SDHB蛋白的缺失可能是由于SDH公司通过所使用的DNA测序和MLPA方法（例如，未经研究的基因的非翻译区、内含子区或启动子区的有害突变）或通过表观遗传学沉默SDH公司基因。这六名患者中有两名没有SDH公司突变，但SDHB免疫组织化学阴性肿瘤的临床信息表明存在嗜铬细胞瘤-副神经节瘤综合征：一名患者有副神经节癌家族史，一名患者患有多发性副神经节肿瘤（网络附录）。此外，其他四种SDHB阴性肿瘤中有三种没有SDH公司-基因突变在年轻时被诊断（阑尾；179A、180B和220C例），表明可能涉及生殖系。A否定SDH公司与SDHB免疫组化阴性相关的基因检测可能表明患者可能患有色素沉着细胞瘤或副神经节瘤遗传综合征，我们建议对患者进行随访，随访方式与已证实的色素沉着细胞瘤或副神经节瘤遗传综合征相同。SDHB免疫组化检测结果与是否存在SDH公司突变。SDHB免疫组化检测对是否存在SDH公司突变。在六个SDHB阴性肿瘤中未发现的可能性SDH公司基因突变-这些突变未被检测到，意味着SDHB免疫组织化学检测嗜铬细胞瘤-副神经节瘤综合征的敏感性和特异性甚至高于此处的估计。
FFPE肿瘤标本的免疫组化结果的可靠性还体现在两个不同实验室对三个不同肿瘤系列（鹿特丹和巴黎的回顾性系列和鹿特丹的前瞻性系列）应用两种不同抗体获得的类似结果，以及冷冻切片、western blotting和SDH酶组织化学得到的一致结果。我们的结果表明，在具有各种突变的肿瘤细胞中(SDHB公司; 15种不同的错义，两种不同的无义，六种不同的移码，三种不同的外显子缺失，三种可能影响剪接的突变），SDHC公司; 两种不同的错义，一种无意义，两种外显子缺失，以及SDHD公司; 五种不同的错义、两种不同的无义、三种不同的移码和三种可能影响剪接的突变，未检测到免疫反应性SDHB蛋白。这些结果与Douwes-Dekker及其同事的初步发现一致，22据who报道，11例患者的弥漫性胞质SDHB表达普遍降低SDHD公司-相关（两个不同SDHD公司突变）副神经节瘤和散在肿瘤和正常细胞中的强颗粒表达。此外，Dahia和同事23据报道，5例患者的SDHB表达出现类似下降SDHB公司-相关，一个SDHD公司-相关的，和六个VHL（甚高频）-相关的嗜铬细胞瘤。然而，在本研究中，我们能够区分VHL（甚高频）-相关肿瘤SDH公司-SDHB免疫组化显示相关的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤，这可能是应用免疫组化程序或组织处理不同的结果。
SDHB蛋白浓度的差异可能不是转录效率差异的结果，因为有迹象表明SDHB mRNA浓度与SDHB蛋白质丰度不平行。23此外，之前已经表明，无论SDH亚单位发生突变，无论是锚定（SDHC和SDHD）还是催化（SDHB），都会使SDH公司该基因诱导肿瘤中SDH酶活性完全消失，表明复合物II发生构象变化或不稳定，随后发生蛋白水解。7,22,24此外，利马及其同事25结晶学显示五种临床验证的SDHB蛋白的严重结构后果SDHB公司错义突变。Cervera及其同事26最近获得的证据表明，三个错义突变的SDHB蛋白可以到达线粒体并正常定位，尽管与野生型蛋白相比，三个错误突变的SDHB蛋白中有两个蛋白的表达降低。这些结果与最近的证据相吻合，即基因中最罕见的错义变体是有害的。27
在本研究中，四个SDHB免疫染色阳性的肿瘤具有非同义多态性(SDHB公司p.Ala3Gly、p.Arg11His,p.Ser163Pro，以及SDHD公司p.His50Arg），无伴随致病性SDH公司-基因突变，表明这些变异确实是中性多态性。15,28
双等位基因灭活SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司基因已在SDH公司-相关肿瘤。17,24,29我们的结果表明SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司在肿瘤中导致相同的表型结果，即缺乏免疫反应性SDHB蛋白。这些观察结果已经被描述为复合物I基因的突变，这些突变被证明会影响整个复合物I和其他线粒体复合物（如复合物III）的组装和稳定性。30观察到所有患者均无SDHB免疫反应SDH公司-FFPE和冷冻肿瘤组织中的免疫组织化学和变性凝胶电泳后的western blotting显示的突变肿瘤，以及抗牛SDHB的单克隆抗体和抗人SDHB重组羧基末端部分的亲和分离多克隆抗血清，提供了强有力的证据，证明在SDH公司-突变肿瘤。正如之前在其他线粒体疾病中所报道的那样，因此，改变组装或复杂稳定性可能是SDH公司基因突变，而不是催化位点功能障碍。它证实了免疫学方法诊断线粒体疾病的准确性。31
通过我们的应用程序，副神经节瘤和嗜铬细胞瘤上的SDHB免疫组织化学可以检测到具有明显散发表现的嗜铬细胞细胞瘤-副神经节细胞瘤综合征患者。此外，可以推测，最近描述的与副神经节瘤相关的肿瘤的综合征受累，例如Carney–Stratakis二联体的胃肠道间质瘤和家族性肾细胞癌，也可以通过SDHB免疫组织化学检测到。29,32事实上，其中一个生殖系的组织SDHB公司突变的肾细胞癌可用于研究，该肿瘤的SDHB表达似乎为阴性（数据未显示）。
对于Lynch综合征的诊断，肿瘤的检测通常从不匹配修复基因产物的免疫组织化学开始，SDHB免疫组织化学可能在未来的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的基因检测中发挥重要作用()。33由于标准免疫组织化学程序和数据解释的简单性，免疫组织化学检测可以很容易地应用于世界各地的病理诊断服务。常规检测所有嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的SDHB表达在技术和经济上都是可行的，尤其是在没有特定形式遗传性嗜铬细胞癌或副神经节肿瘤的家族或临床适应症的情况下。我们的结果表明SDHB公司,SDHC公司、和SDHD公司只有当肿瘤的SDHB表达免疫组织化学阴性时，才需要进行种系突变检测。显然，我们提出的诊断测试只能在患者接受手术且肿瘤组织可用于研究后进行。由于术前和术后基因检测以及对患者管理的影响存在国际争议，我们的检测对患者管理产生的影响尚不清楚。尽管如此，通过常规进行SDHB免疫组化SDHB公司,SDHC公司，或SDHD公司具有高度的可靠性。
暗色细胞瘤和副神经节瘤分子遗传学检测的建议算法嗜铬细胞瘤相关或副神经节瘤相关遗传病的家族或临床标准的存在应导致目标基因检测。在缺乏标准的情况下，需要进行SDHB免疫组化。SDHB免疫组化阳性结果应导致VHL（甚高频）和房地产税基因检测，SDHB免疫组化阴性应导致SDH公司(SDHD公司,SDHB公司、和SDHC公司)基因检测，从SDHD公司在头颈部副神经节瘤或开始SDHB公司胸腹或盆腔副神经节瘤。
致谢
基金：荷兰科学研究组织、荷兰癌症协会、范德尔斯基金会、癌症研究协会、国家圣特医学研究所，以及PHRC为COMETE网络提供的COMETE 3赠款。
我们感谢Frank van der Panne帮助我们准备数据。
脚注
贡献者
JF、A-PG-R、RRK和WNMD领导了研究设计。PK、KP、PJP、MM、J-PB、AP、SN、AAV、APB、ERM、TM、CB、JB、LA、DA、EM、WWH、M-PFMVP、AL、JWML和A-PG-R提供了数据和肿瘤样本。FHN、JG、JF、EK、RAO、JR、HD、B-JP、FT、FF和JF进行突变分析。FHN、JG、EMCAB、HFBMS、PD进行免疫组化分析和质量控制。WCJH为研究的统计评估做出了贡献。FHN、JG、JF、EK、A-PG-R、RRK和WNMD起草了报告。所有作者都修改了报告。
利益冲突
提交人声明没有利益冲突。
请参见在线的用于网络附录
工具书类
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