自然。作者手稿；PMC 2016年1月19日提供。
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尼姆斯：NIHMS632915标准
潜在的转化生长因子-β结构和激活
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2和1
石敏龙
1波士顿儿童医院免疫疾病研究所和哈佛医学院病理学系，马萨诸塞州波士顿02115，美国。
朱江海
1波士顿儿童医院免疫疾病研究所和哈佛医学院病理学系，马萨诸塞州波士顿02115，美国。
王瑞（Rui Wang）
1波士顿儿童医院免疫疾病研究所和哈佛医学院病理学系，马萨诸塞州波士顿02115，美国。
邢晨
1波士顿儿童医院免疫疾病研究所和哈佛医学院病理学系，马萨诸塞州波士顿02115，美国。
李志美
1波士顿儿童医院免疫疾病研究所和哈佛医学院病理学系，马萨诸塞州波士顿02115，美国。
托马斯·沃尔兹
2霍华德·休斯医学院和细胞系马萨诸塞州波士顿龙伍德大道240号哈佛医学院生物学，邮编：02115，美国。
蒂莫西·斯普林格
1波士顿儿童医院免疫疾病研究所和哈佛医学院病理学系，马萨诸塞州波士顿02115，美国。
1波士顿儿童医院免疫疾病研究所和哈佛医学院病理学系，马萨诸塞州波士顿02115，美国。
2霍华德·休斯医学院和细胞系马萨诸塞州波士顿龙伍德大道240号哈佛医学院生物学，邮编：02115，美国。
- 补充资料
支持的。
指南：8F8E406D-0D53-4873-BA3C-9617E02BC273
摘要
转化生长因子（TGF）-β储存在细胞外基质作为一种潜在的复合物及其前体。TGF-β1的激活需要α的结合五整合素与前驱体和对该域的作用力，该域位于潜在TGF-β结合蛋白的细胞外基质。晶体猪二聚体proTGF-β1揭示了一个环状复合物，一种新的折叠前体蛋白，并展示前体蛋白如何保护生长因子免受受体识别并改变其构象。之间的复杂构造α五β6整合素和前体蛋白是不足以释放TGF-β1。强制相关激活需要解开围绕每个成长因素的“紧身衣”单体处于可以被二硫键锁定的位置。所有序列33个TGF-β家族成员显示出类似的前体褶皱。结构深入了解生长和分化家族的调控在形态发生和体内平衡中具有根本重要性的因素。
TGF-β家族是确定后生动物身体计划的关键发展1,2。这个家族的成员，包括节点、激活素、，抑制素、骨形态发生蛋白（BMPs）和生长分化因子（GDFs），指定前轴/后轴、背轴/腹轴、内胚层、中胚层和外胚层，左右不对称和单个器官的细节。转化生长因子-β1，TGF-β2和TGF-反应与肿瘤细胞生长和抑制1,三.
虽然TGF-β受体的合成和表达很普遍，激活局限于TGF-β从潜伏期释放的部位。TGF-β家族成员由大氨基末端前体蛋白合成是正确折叠和二聚羧基末端所必需的生长因子域4。尽管如此furin细胞内分裂，分泌后，非共价结合持续存在TGF-β的二聚体生长因子结构域和前结构域之间其他家庭成员的数量越来越多。前驱体足以给一些家庭成员带来延迟，它还针对许多成员进行存储细胞外基质，与潜在TGF结合蛋白（LTBP）复合或原纤维蛋白5,6.
TGF-β1和TGF-由α识别五整合素。具有整合素结合RGD基序的小鼠突变为RGE后，TGF-β1基因缺失小鼠的所有主要表型都恢复正常，包括多器官炎症和血管生成缺陷，从而证明整合素在TGF-β活化中的作用7.在α中五整合素，整合素的表型β6-零和整合素β8-空鼠标演示α的特殊重要性五β6和α五β8激活TGF-β1的整合素和TGF-β3体内8,9.
仅整合素结合不足以激活TGF-β。激活按α五β6整合素需要结合TGF-β1通过与LTBP的结合进入细胞外基质β的6肌动蛋白细胞骨架的细胞质域5,10,11此外，肌成纤维细胞激活TGF-β需要收缩力8因此假设LTBP–前体蛋白–TGF-β复合物的整合素改变前体蛋白的构象并释放受体的TGF-β结合5,8在这里，我们描述了潜在TGF-β的结构，潜伏期和整合素依赖性激活的机制，以及对TGF-β家族生物活性的调节。
晶体结构
3.05℃时前TGF-β1的结构(和补充表1)使用多重和单波长反常衍射。电子密度图(补充图1)是通过多晶、多域平均每个不对称四个单体进行改进单位。在环状结构中，两个前庭臂域在肘部连接到由两种生长因子单体和围绕每个生长因子的前域“紧身衣”元素单体(和). 环的中心含有溶剂。这个手臂在脖子处并拢，并在领结处与蝴蝶结相连每个肩部都有RGD图案().在环的另一侧，紧绷的前臂交叉的地方，LTBP会与紧身衣残基Cys 4有关，Cys 4在结晶构造().
proTGF-β1的结构手臂、紧身衣和TGF-β1单体片段的颜色不同。一,b条，整体结构。球体标记最后一个前体蛋白和生长的第一个残基中密度可见的残基因素。混乱的部分用虚线表示。红色箭头表示力的方向在整合素激活期间。钥匙侧链如斗杆所示表现，包括青色RGD基序的Asp和白色。二硫化物键和Cys 4突变为Ser呈黄色。c（c），结构和激活机制示意图。不锈钢，二硫键。d日，RGD的Asp 217附近的疏水残基动机。e（电子），防护域。疏水核心的侧链为显示为金色（也标记为和补充图。2)，与生长相互作用的保守α2-羟基残基因子为粉红色，扣件残留物为银色，蝴蝶结残留物脂肪族为浅绿色，Cys为黄色。f–h,紧身夹克和扣件细节。
ProTGF-β1与LTBP和α五β6整合素和转化生长因子-βa–d，代表性阴性染色电子显微镜类proTGF-β的平均值(一)，proTGF-β的复合物含有TGF-β结合域的LTBP1片段3–EGF–EGF-TGF-β结合域4(b条)和proTGF-β1与α的配合物五β6整合素，用过量proTGF-β1制备(c（c）)或一个α的过量五β6整合素（d）。比例尺，100Å.e（电子），非还原性SDS–复合峰的PAGE来自电子显微镜用S200凝胶过滤d日（车道1), α五β6整合素（通道2）和proTGF-β（3号车道）。LAP，潜伏期相关蛋白（前结构域）。（f），TGF-β1的激活。293T细胞稳定转染带有α五β6整合素或模拟对照另外转染指定的野生型（WT）或突变型proTGF-β1构建物，或与空载体（模拟）共同培养TGF-β指示细胞5.克，293T细胞中所示突变体制成的材料为在80°C下加热并用指示细胞进行分析。中的误差线（f）和克显示3-9个样品的标准电镜1-3个代表性实验。小时,我，西部所示转染剂分泌的proTGF-β1的印迹，使用前体蛋白抗体(小时)或链霉亲和素检测生物素化半胱氨酸(我).
臂结构域残基46–242具有新的折叠12具有不同寻常的特征。它有两个反平行四股β-板具有广泛的疏水表面，但这些只在疏水核心部分重叠(). 疏水面在这两片岩石被α2、α3和α4螺旋埋藏。
β-链β8和β9在双层上延伸连接领结颈部两个手臂区域的假对称轴(). 蝴蝶结是用互惠的胞间二硫键，Cys 194–Cys 196和Cys 196-Cys 194，和疏水残基().
RGD基序的Arg 215位于无序环（残基209–215）。部分订购Gly 216和RGD基序的Asp 217()开始长的12-残基在颈部亲水表面蜿蜒连接前臂近端β10的β片β-薄板。
残余物1-45的紧身衣由α1螺旋和潜伏期套索(和). 延迟套索，一个扩展的循环连接α1和α2螺旋，与其余螺旋几乎没有接触包围每个TGF-β单体尖端的前体蛋白(). 六个脯氨酸残基和三个脂族残基与大量的生长因子芳香族和脂肪族残留物，并帮助这些物质稳定潜伏期套索的构象().
TGF-β家族一，五个代表性前结构域的序列比对。橙色圆圈标记核心疏水残留物，如.抑制素-α；肌肉生长抑制素。TGF-β1序列上的黑点标志着十年残留。垂直虚线线标记解理位点。b条，TGF-β的系统发育树族，基于中的对齐补充图2.
两亲性α1螺旋的高度疏水表面异亮氨酸和亮氨酸残基与Trp 279和Trp 281相互作用一种生长因子单体上的脂肪族侧链(). 色氨酸残基被套索进一步覆盖残基Leu 30、Pro 33和Pro 34().值得注意的是，α1螺旋深埋在两者之间的界面中生长因子单体(). 这个第二单体上的界面包括三个酪氨酸残基().
手臂区域与紧身衣一起完成了对每个生长因子单体。α2螺旋埋藏了转化生长因子-β指(). α5螺旋线从arm域的基础投影()其中，前体蛋白残基Arg 238与Glu形成盐桥348英寸TGF-β1(). 这两个残基在proTGF-β1、proTGF--β2和proTGF-β3中是不变的(补充图。2).
将紧身衣固定在臂杆残留物74–76上(). 在Ala 76的氮和Lys 27的氧覆盖了α1的C末端螺旋线(). 此外，羰基氧Ala 76在α5螺旋中与Arg 238形成氢键(). Lys 27是关键紧固件残留物。它侧链与Tyr 74的侧链形成π-阳离子键，即氢键连接到Tyr 74的主链，氢键连接到Ser的主链和侧链351 (). Van der Waals联系人紧固件残留物Lys 27、Tyr 74和Tyr 75的笨重侧链也可以固定紧身衣。值得注意的是，Lys 27、Tyr 74和Tyr 75在转化生长因子β1、转化生长因子α2和转化生长因子γ3(补充图2).臂β1-股之间的主链氢键加强了紧固残基77和78以及生长因子β-手指，它们连接前体蛋白和超β板中的生长因子().
TGF-β二聚体形成前臂，尽管TGF-α单体也被描述为像手一样13–15(). 每个单体都没有疏水核，除了胱氨酸结图案外，其中一个二硫键在两个之间传递由另外两个二硫键桥接的多肽段。
屏蔽受体结合与受体（R型I和二） （参考。15)叠加在TGF-β二聚体。为了清楚起见，图中只显示了每种单体中的一种。这个受体显示为透明的分子表面。前驱体的成分与受体的冲突被标记。
原结合TGF-β1与以前的TGF-单体取向和元素位置的结构单体内部(和补充图3). 这个所有112个残基的Cα根-平方偏差为7º，并且在最相似的85个残基上加2μ。最大的差异是由前体α1螺旋。它的地位与增长因子相似成熟TGF-β1中的α3螺旋(补充图3). 前体α1螺旋的插入生长因子之间的单体减少了单体之间的总面积从850°2至335奥2.大构象TGF-β1的变化是由生长因子和前体二聚体，埋藏了2,440Å2.
生物合成的含义
活性TGF-β1和激活素A的折叠和分泌需要前体蛋白的共表达4,而TGF-β1前体蛋白可以在缺乏生长因子域16.这些研究结果表明，C末端生长因子结构域同时折叠与N末端前体结合或随后结合。生物合成动力学TGF-β1、激活素和抗苗勒氏激素作用缓慢抗苗勒氏激素，生长因子域的折叠是速率限制17.地区其可能在模板化折叠生长因子域包括β1链，该链与TGF-β手指和α1和α2螺旋生长因子手指两侧的广泛疏水界面(). 残留物Ile 17，Ile 24，α1-螺旋界面中的Leu 25和Leu 28，套索中的Leu30接口()，特别是被确定为TGF-β1相关性的重要因素18.每个生长因子的手指相拥单体可以补充胱氨酸结和间单体的正确形成TGF-β中的二硫键。proTGF-β1的结构使其生物合成过程中二硫醚异构酶对二硫醚的可及性().
生长因子和前结构域单体来源的明确分配由于细胞内被呋喃和243-249残留物密度不足。然而，卵裂是不完全和少量未分离的proTGF-β存在于蛋白质制剂与裂解的proTGF-β共结晶(补充图1d),表明解理后没有发生重大构象变化。A长通过环中心的前体-生长因子连接，跨越~50º，将需要大量构象变化，并将限制访问furin。因此，我们分配了较短的~30°连接，在前体蛋白的C末端和生长的N末端之间因子，位于戒指的同一侧（例如，品红色和金色球体位于).
该赋值表示生长因子单体的互换前体单体拥抱，发生上述亲密相互作用在不同的前体蛋白和生长因子域之间内质网前体中的多肽链（例如黄金和绿色领域). 因此生长因子结构域和前体结构域之间的表面积前体单体（900º2)比那大得多在相同的前体单体（370Å2)并大幅增加生长因子（330Ω）的单体间界面2)和前体蛋白（600°2). 交换在调节生长因子异二聚体的比例，在环境中具有独特功能比如背腹纹19.
LTBP和激活复合物
在大的潜在复合物中，单个LTBP分子被二硫键结合到两个proTGF-β单体。我们通过具有LTBP片段的复合物的多角度光散射质量测量。每个单体（我们结构中的丝氨酸）中的LTBP-交联Cys 4残基为相距40度(). 它们与LTBP将通过将前臂固定在一起来加强紧身衣(). 40Å的大分离可能表示防止两个Cys 4之间二硫键连接的机制残留物。相反，TGF-β结合域3中的两个同源半胱氨酸在没有复杂地层的情况下，LTBP彼此相连。这些半胱氨酸表面暴露并被酸性残基包围，这些残基与proTGF-β（参考文献20,21). 与此一致，紧身衣碱基残余物().此外，在两个前驱体a1-helices之间，有一个凹形生长因子表面含有大量疏水残基，包括脯氨酸和二硫键半胱氨酸可与LTBP相互作用().
proTGF-β的阴性电镜分类平均值为与我们的晶体结构非常一致(和补充的图4). 包含LTBP片段的复合体TGF-β结合结构域3和4以及两个干预的EGF结构域没有显示出主要的proTGF-β部分的构象变化(). 对应于LTBP碎片的附加密度为如我们的晶体结构所预期的那样，存在于环的外围，以及在某些平均等级中，使环与基底成一定角度(、中间面板和补充图4c).
proTGF-β肩部的RGD基序对于整合素结合(). 与许多人相比RGD基序存在于扩展环中，Asp 217的位置稳定通过掩埋Leu 218和218–131主链氢键(). 暴露的疏水侧链在手臂区域的身体附近()可能增加对整合素的亲和力。
整合素α五β6外结构域，带有C末端卡环与钙中的proTGF-β1形成复合物2+和镁2+可以通过凝胶过滤进行分离，证明整合素的异常紧密结合(和补充图4a). proTGF-β1和α五β6整合素的产率为1:1()和1:2()复合物。与配体的结合稳定了整合素腿与整合素的开放构象α五β6耳机(和补充图4d，e). 整合素与proTGF-β结合大密度之间的界面，对应于α五β-螺旋桨区域，密度较小，对应于β6βI结构域，其腿部远离proTGF-β。环上结合位点之间的电子间距显微镜检查（40–50℃）适用于晶体结构（45°）。无重大构象变化proTGF-β1很明显，即使有两个整合素结合()和SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）证实复合物中存在TGF-β1(). 这些生物化学和结构研究表明，与proTGF-β1结合的整合素不足以TGF-β1的释放，与之前的细胞生物学分析一致5,8,10.要求（1）proTGF-β通过LTBP附着于细胞外基质；(2)整合素附着于细胞骨架和（3）细胞收缩表明激活proTGF-β1需要产生张力转化生长因子-β5,8,10,11.
该结构通过以下方式实现TGF-β1活化的整体机制容易预测的作用力(). 肩部RGD图案的张力α五附着在肌动蛋白细胞骨架上的整合素在环的另一端抵抗，其中Cys 4残留在紧身衣与LTBP二硫键相连，LTBP与细胞外基质。拉力将按红色所示方向施加中的箭头.
拉力的方向和折叠拓扑结构强烈影响展开路径与抵抗力23β-片状蛋白是最具抗力的因此，arm结构域将是前驱体中最具抗力的部分。拉扯RGD图案将通过长曲径传递至β10股。Cys 4残基通过β1链将抵抗紧身衣。β1和β10每根钢绞线与施加的力平行，并在β板中相邻()因此是最具抵抗力的已知的结构几何形状，氢键夹23相比之下紧身衣的α螺旋和长潜伏期套索不适合抵抗武力。Cys 4上的力将杠杆作用于α1的C端螺旋并减弱与紧固件残余物的相互作用。解开后，长没有稳定氢键相互作用的延迟套索将很容易通过施加张力拉长和拉直。因此，通过打开它的紧身衣TGF-β将从前体区释放并被激活受体结合().
前体蛋白不仅持有TGF-β当它游离或结合到受体时，构象也会阻断受体完全访问。TGF-β家族成员被两种I型识别受体和围绕生长因子二聚体的两个II型受体(补充图。第三版)15.的绑定生长因子指尖的II型受体被潜伏期套索和I型受体与生长因子体的结合结构域被前体α1螺旋、α5螺旋和紧固件阻断以及β-链1、3和10的末端(). 尽管去除紧身衣可能足以使II型受体，I型受体相互作用与许多相互作用重叠TGF-β和臂结构域之间()受体需要前体蛋白的完全释放结合。因此，结构表明整合素不能暴露TGF-β如果它仍然与前体结合，则足以激活受体，以及应该寻求其他解释来解释整合素激活的TGF-β作用于邻近细胞而非远处细胞细胞10.
为了测试TGF-β活化过程中放松的重要性残基发生突变。紧固件残基Tyr的非保守取代74和Tyr 75导致自发的非整合素依赖性TGF-β激活(). 在不同的氨基之间Tyr 74和Tyr 75突变的酸，只有苯丙氨酸没有突变激活。作为对照，在疏水界面附近Leu 28的突变TGF-β未激活().这些结果与π键紧固的重要性一致芳香族酪氨酸侧链的范德瓦尔斯相互作用。
在紧固件中，Lys 27和Tyr 75的Cα碳仅为4.1远离，允许K27C/Y75C突变体中形成二硫键，Y75C突变体的自由半胱氨酸标记证实了这一点，但K27C/Y75C没有突变体(). K27C突变严重简化表达式(). 类似地，K27A突变大大降低了表达，也释放了游离TGF-β1（参考。18). Y75C突变体构成活动(). K27C/Y75C双突变与K27C相比，挽救了表达，阻止了在Y75C中发现TGF-β，与野生型相比proTGF-β对整合素-α五β6-依赖激活(). 热等变性可以展开不同于作用力的蛋白质途径23活性TGF-β的热释放量来自野生型和K27C/Y75C突变体(). 因此，二硫键可以永久固定紧身衣防止整合素依赖性激活。这些结果支持以下假设：整合素施加于前体的张力可以释放TGF-β，并且强调解开紧身衣对整合素依赖性的重要性激活。
疾病中的突变
卡穆拉蒂-恩格曼病（CED），其特征是导致长骨柄增厚，肌肉和骨骼疼痛通过TGF-β1前体的突变增加其释放18,24在CED突变中，Y52H破坏α2-螺旋支撑TGF-β手指的残留物(). 电荷反向E140K和H193D突变破坏了二聚化界面中Glu 140和His 193之间的pH-调节盐桥前驱体().“热点”残留物Arg 189被大量埋藏：它形成一个与Tyr 142的阳离子-π键和穿过二聚体界面的盐桥蝴蝶结残留物Asp 197(). 此外，CEDCys 194和Cys 196的突变证明了领结二硫化物的重要性债券。
TGF-β大家族的意义
TGF-β家族由33个成员组成()2.虽然生长因子结构域高度保守，但前体结构域的长度从169到433个残基，不同程度地被描述为序列无关或低同源性。然而，排列显示所有前体蛋白都有相似的折叠(和补充图2). 深深地在臂结构域的核心二级结构元件中埋置的疏水残基，也就是说，α2螺旋和β-链1–3、6、7和10是在所有成员中保存（黄金侧链和橙色圆圈和补充图。2).
大多数家庭成员还包含明确的序列签名a1螺旋的两亲性C末端部分，紧密插入两种生长因子单体(和补充图2). A类抑制素α和抑制素βA的类似插入已被证明转化生长因子β中Ile 24和Leu 28等位基因突变的定位()25许多家庭成员也富含脯氨酸潜伏期套索环的长度与环围相适应生长因子β-手指(和补充图2). 因此，类似于proTGF-β的前体结构，包括紧身衣广泛存在于TGF-β家族中。然而，低序列identity和许多插入和删除都表明存在大量的专业化。
家族成员间前体蛋白二聚化的差异表现为半胱氨酸位置的变化。领结（β-股8和9）及其二硫化物是特殊化的。抑制素-α和-β亚基具有半胱氨酸处于相似的位置，而其他家族成员都有半胱氨酸β7链中的残基或该区域完全缺乏半胱氨酸(和补充图2).
β4和β5中两个臂结构域之间的界面链的大小适中，缺乏疏水性和保守的残基。GDF1和GDF15特别缺乏β4和β5链，它们在β片边缘的序列和结构(和补充图2). 因此，臂区二聚化似乎是在一些家庭成员中可变或缺失。
TGF-β、myostatin和GDF11的近亲，它们也是潜在的，显示紧固件残基Lys 27和Tyr 75的保守性(和补充图2).肌肉生长抑制素调节肌肉质量并储存在细胞外基质中，与LTBP3.从潜伏期释放肌生成抑制素和GDF11需要分裂BMP1和tolloid金属蛋白酶在Arg 75和Asp 76之间的前体裁判。26). 这种分裂是在α2螺旋线和紧固件(). 因此，至少解开紧身衣的两种不同方法，用力和蛋白水解，可以从延迟中释放家庭成员。
越来越多的TGF-β家族成员被认可以在分泌后保持与其前结构域相关，BMP10、GDF2、GDF5和GDF8（参考。27).此外，许多前体蛋白与纤维蛋白-1和纤维蛋白-2。前体蛋白对细胞外基质的靶向性可能很广调节TGF-β家族生物活性的重要性6此外，绑定到LTBP或纤维蛋白似乎增强了前体蛋白-生长因子复合物6因此，尽管只有有限的TGF-β家族成员的数量是潜在的前体蛋白-生长因子复数，当其他成员考虑了与LTBP和纤维蛋白的生理相关复合物。
BMP4的信号范围体内增加了furin-like蛋白酶在第二位点对前体蛋白的细胞外裂解前体-生长因子裂解位点上游28值得注意的是，第二个站点位于TGF-β1中含有RGD精氨酸的无序环(). 中间β10链损失这两个切割位点导致BMP4前体与其结合的丢失生长因子27.
Nodal的前体与Cripto结合，靶向Nodal，通过邻近细胞分泌的蛋白酶29.大量分泌抗苗勒管激素未分离并与原结构域结合可大大增强其活性体内30.参与建立双侧不对称性的左侧蛋白质未被裂解在臂和生长因子域之间，而在α2螺旋和紧固件31(). 值得注意的是紧身衣应足以使II型受体进入生长因子域。
结论性观点
我们描述了潜在TGF-β1和a的结构α激活它的力依赖机制五整合素。它值得注意的是，TGF-β家族的许多成员与纤维蛋白相关或与LTBP，它们在结缔组织的弹性纤维中共同组装组织6.作用于弹性纤维会延伸纤维蛋白和LTBP，我们推测这可能削弱其与TGF-β家族成员的联系，使其能够释放和激活。因此，TGF-β的力依赖性调节是可能的家族激活可以超越整合素依赖机制在多种情况下都很重要，包括骨骼和组织的调节增长。虽然TGF-β家族中的前体蛋白多种多样，但其序列物种间高度保守2.需要进一步研究，以解决前体蛋白调节TGF-β潜伏期和激活的机制家庭。
方法
转化生长因子β1
大鼠血清白蛋白先导物构建猪proTGF-β1序列（MKWVTFLLLLFISGSAFS），然后是八个组氨酸残基，a链霉亲和素结合肽（TTGWRGGHVVELAGELEQLRARLEHH PQGQREP）32和HRV-3C蛋白酶位点从pcDNA-GS-TGF-β1（参考文献。33). 带有C4S突变的猪proTGF-β1从后一种结构中放大。C4S突变增加proTGF-β1表达33和避免不适当的二硫键形成34。用此方法未获得晶体构造。N147Q和N107Q/N147Q中删除了一个或两个N-连接位点构造，其表达类似于野生类型35.最好的晶体是用N147Q获得；N107Q/N147Q突变体产生的针叶优化。通过电穿孔和用10μg ml培养−1嘌呤霉素。克隆是用夹心酶联免疫吸附试验筛选表达（ELISA），具有前结构域-1的捕获抗体（R&D Systems）和针对His标签（Qiagen）的生物素化检测抗体。最高的克隆proTGF-β1的表达（~2 mg l−1)已扩展并在装有J/J培养基和5%胎牛血清（FBS）的滚筒瓶中培养。每5天收集上清液，离心澄清，浓缩十倍切向流过滤（Vivaflow 200，Sartorius Stedim），用10 mM Tris-HCl、0.14 M NaCl（TBS，pH 8.0）稀释五倍，然后浓缩了五倍。将材料调整为0.2 M NaCl，并使用Ni-NTA琼脂糖（Qiagen）（每5升培养上清液25毫升），然后用三柱体积为0.6 M NaCl，0.01 M Tris（pH 8.0），用0.25 M洗脱TBS中的咪唑。将材料调节至pH 7.4，应用于Strep-tachin琼脂糖（IBA）（每5升培养上清液3毫升）并用TBS（pH）清洗7.4). 然后4 ml重组His-tagged HRV-3C蛋白酶（Novagen，100 U毫克−1，1毫克毫升−1)，在TBS中稀释20倍（pH 7.4）和10%的甘油，施加在4°C，持续16 h。双柱体积TBS的流通（pH 7.4），将含有未标记proTGF-β1的药物浓缩至1 ml，并应用于MonoQ和Superdex S200柱串联并与TBS平衡（pH值7.5）。纯化的proTGF-β1浓缩至约15 mg毫升−1在10 mM Tris（pH 7.5）中，75 mM NaCl用于晶体96 well Greiner微孔板的筛选（100 nl悬挂滴气相扩散格式），使用蚊子结晶机器人（分子尺寸）在20摄氏度。使用悬滴蒸汽在24孔板中优化打击扩散。然而，更好的衍射晶体只能从含有等量12-15μl蛋白质和在6.5–7.5%PEG 3500优化条件下的良好溶液，17–18%异丙醇和0.1 M柠檬酸钠（pH 5.6），添加4-5%甘油，以减缓晶体生长并改善晶体尺寸形状。最大单晶尺寸达到450μm×150μm×40μm。在液体中将晶体冷却至100 K之前氮气，PEG 3350浓度增加三轮（每轮增加12小时每循环增加8%）36.最终PEG 3350大约31%的浓度足以进行冷冻保护。晶体是总结于补充的表1每个不对称单元有两个复合体，一个是马修斯系数2.9º三Da公司−1，提供溶剂含量为57.8%。
为了制备Se-Met proTGF-β1，用PBS（pH 7.4）清洗细胞，补充1%FBS，然后用无蛋氨酸培养8小时补充50 mg l的α-MEM（SAFC Biosciences）−1L-Se-Met（Sigma）和10%透析的FBS。用相同的培养基替换后，细胞培养4天，Se-Met proTGF-β1，产量为1.5 mg我−1，纯化和结晶与天然proTGF-β1。此外，通过浸泡获得了重原子衍生物含0.4 mM HgBr母液中的晶体2持续4小时。
结构确定和细化
天然硒多波长异常色散（MAD）和收集了单波长异常色散（SAD）汞导数数据在100 K的波束线23-ID处，然后使用HKL2000进行处理（参考。37)和XDS38。统计数据在补充表1.使用Se-MAD和Hg-SAD，非对称单元中24个硒位点中有19个和14个汞位点使用PHENIX定位39.Se-Met相位的电子密度图，四倍后计算非晶体学对称（NCS）平均，明确定义了方向每个单体的。成熟的TGF-β1同型二聚体很容易对接到使用模型1KLC和MOLREP绘制地图40CCP4中（参考。41).prodo-main是手动构建到地图中的。一个粗略的模型proTGF-β1是在PHENIX进行刚体精炼后获得的域作为一个刚体。同一模型对接到Hg-SAD密度中两个同型二聚体，使用MOLREP。
为了改进相位并将其扩展到更高的分辨率，多晶体平均（共两个晶体：Se-MAD和Hg衍生物），多域平均（每个前体蛋白和TGF-β有单独的掩模使用DMMULTI公司42来自CCP4套件。每个域的掩码由CCP4中的NCSMASK计算，NCSLSQKAB计算了分子和晶体之间每个域的矩阵在CCP4中。PHENIX对每个晶格进行了刚体细化平均地图的基础。然后使用每个晶格的新模型为DMMULTI的下一个周期计算一组新的NCS矩阵。这些台阶循环了两次。
COOT中的建模43基于多晶体、多域平均电子密度图和2F类o（o）–F类c（c）地图。NCS约束和平移-振动-螺旋（TLS）组用于PHENIX的精制。使用硒异常图确认序列-结构寄存器。这个使用精细结构重复进行多晶体、多畴平均在R（右）自由的约为33%，无重大差异已找到。来自3C蛋白酶位点的两个残基留在N末端解理后。结构包括残基0–62、70–208、，216–241、250–361和1N个-乙酰葡萄糖胺（NAG）残留物（链A）；残基1–62，70–208，216–242，250–299、310-361和两个NAG残基（链B）；残基1–62，68–208、216–241、250–361和三个NAG残基（链C）和残基0–62、69–208、216–242、250–361和2NAG残留物（链D）。使用的验证和Ramachandran统计数据摩尔廉洁性44.全部结构图是使用Pymol（DeLano Scientific）生成的。
在晶体的不对称单元中，第二个前TGF二聚体延伸每个两个品牌的β带形成一个四股间二聚体超β-片，其中Leu 203形成疏水晶格接触。在其缺失，Leu 203可能介导领结内的疏水相互作用。
突变
将野生型人proTGF-β1插入pEF1-puro质粒。使用QuikChange（Stratagene）进行定点突变。所有突变均经DNA测序证实。
游离半胱氨酸标记和前体蛋白检测
使用Polyfect试剂（Qiagen）转染HEK-293T细胞根据制造商的说明，使用2μg在70-80%的融合率下，每6厘米培养皿中的proTGF-β1 cDNA。这个然后在FreeStyle无血清培养基（Invitrogen）中培养细胞3天。上清液与450μM生物素-BMCC反应（1-生物酰胺-4-（4′-（马来酰亚胺乙基环己烷）-甲酰胺基）丁烷）在22°C下（穿孔）60分钟，然后添加40 mMN个-乙基马来酰亚胺。ProTGF-β1被免疫沉淀1.5μg抗人前体蛋白-1（LAP-1）抗体（研发系统）和蛋白A琼脂糖珠（GE Healthcare）在4°C下放置2小时，然后将SDS减少10%PAGE。转移到聚偏二氟乙烯膜后（Millipore），使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶和ECL-plus western印迹试剂盒（GE Healthcare）。总proTGF-β1为使用生物素化人前体蛋白-1在单独的印迹上检测到类似结果（LAP-1）抗体。
TGF-β1活化试验
转化水貂肺上皮细胞（TMLC）稳定转染纤溶酶原激活物抑制剂启动子1下荧光素酶的构建（参考文献。5)由D.Rifkin（新约克大学）。稳定表达HEK-293T细胞转染子α五和β6用嘌呤霉素筛选和G418。表达高水平整合素的克隆α五β6通过免疫荧光筛选抗β抗体流式细胞术6抗体。电池稳定用空载体转染作为对照。这些细胞是随后瞬时转染人类野生型或突变型proTGF-β1，使用每孔0.4μg质粒DNA的脂质体胺在一个48度的板块里。16–24小时后，每个孔用于播种3孔一个包含15000个细胞的96-well板，与15000个共同培养在100 ml DMEM中加入0.1%BSA的TMLC，持续16–24 h。TGF-β1诱导用荧光素酶测定法测定细胞裂解物中的荧光素酶活性系统（Promega）。为了评估热释放TGF-β1，细胞被除polyfect用于6孔板外，其余均按上述方法转染。2天后，收集细胞并在150μl含0.1%BSA的DMEM中加热至8050°l等分样品中TGF-β1活性为使用TMLC荧光素酶分析测定。
阴性电子显微镜
从293T的上清液中分离出一个大的潜在复合片段用天然人前转化生长因子-β和人LTBP片段包含与上面使用的相同的N末端标记proTGF-β。LTBP片段包含TB3和TB4结构域以及两个干预EGF-like结构域（残基Thr 1333–Asn 1578，未成熟编号）。多角度光散射提供了米第页119400，与计算的米第页第页，共120400页对于2:1的proTGF-β：LTBP片段（proTGF--β为2×46400，包括3个高甘露糖N-连接位点的2×7500，再加上27600对于LTBP片段）。α五β6外域使用C末端α-螺旋线圈和标记进行表达；净化，然后如前所述进行阴性染色电子显微镜检查描述45.净化与LTBP片段（20μg），proTGF-β1（30μg）摩尔过量α五β6（20μg），或夹住α五β6（60μg）过量将proTGF-β（10μg）置于Superdex S200色谱中TBS（pH 7.5），含1 mM Ca2+和1 mM Mg2+.峰值分数与纯化的蛋白质或复合物相对应负染电子显微镜。粒子选择、对齐、，如前所述进行分类和平均46.
致谢
我们感谢P.Sun提供的猪TGF-β1 cDNA，感谢K.Koli提供的人TGF-人LTBP1 cDNA和转化水貂肺上皮细胞的LTBP1基因cDNA，D.Rifkin细胞和高级光子源普通医学科学和美国国家癌症研究所（APS-GM/CA-CAT）束线23-ID。
脚注
作者贡献M.S.克隆、表达和纯化proTGF-β1，使蛋白质结晶，收集并处理X射线数据，对结构进行了改进和分析，设计并进行了生化分析并撰写了论文。J.Z.收集并处理X射线数据分析了结构并进行了电子显微镜研究。R.W.设计并进行TGF-β1分析。X.C.进行了电子显微镜研究。L.M.处理了X射线数据。T.W.提供电子显微镜监督。T.A.S.公司。设计和监督项目，细化和分析结构写论文。
作者信息X射线结构沉积在蛋白质数据库，注册号为3RJR。
完整的方法以及中提供的任何相关参考该论文的在线版本www.nature.com/nature（自然）.
补充信息链接到联机版本的论文www.nature.com/nature（自然）.
工具书类
1Wu MY，Hill CS。TGF-β超家族在胚胎发育和平衡。开发单元。2009;16:329–343.[公共医学][谷歌学者] 2Derynk R、Miyazono K。In：TGF-β家族。Derynck R，Miyazono K，编辑。冷泉港实验出版社；2008年，第29-43页。第2章。[谷歌学者] 三。Blobe GC，Schiemann WP，Lodish HF.转化生长因子β在人类中的作用疾病。北英格兰。医学杂志。2000;342:1350–1358.[公共医学][谷歌学者] 4.格雷AM，梅森AJ。激活素A和转化生长因子-β的需求同二聚体组装中的1个前区。科学。1990;247:1328–1330.[公共医学][谷歌学者] 5Annes JP、Chen Y、Munger JS、Rifkin DB。整合素αV（V）β6-调解的激活潜在的TGF-β需要潜在的TGF-β结合蛋白-1。《细胞生物学杂志》。2004;165:723–734. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Ramirez F，Sakai LY。纤维蛋白组合的生物发生和功能。细胞组织研究。2010;339:71–82. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Yang Z等，整合素介导的TGFβ1活化缺失在里面活泼地概述TGFβ1-null的表型老鼠。《细胞生物学杂志》。2007;176:787–793. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Wipf PJ、Hinz B.整合素与潜在转化生长因子的激活β1-亲密关系。《欧洲细胞生物学杂志》。2008;87:601–615.[公共医学][谷歌学者] 9.Aluwihare P等人。缺乏αV（V）β6-和αV（V）β8-整合素复制的异常Tgfβ1-和Tgfβ3-使鼠标无效。细胞科学杂志。2009;122:227–232. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10.Munger JS等，整合素αV（V）β6绑定和激活潜在TGFβ1：调节肺功能的机制炎症和纤维化。单元格。1999;96:319–328.[公共医学][谷歌学者] 11Yoshinaga K等.转化生长因子（TGF）-β1的扰动与潜在TGF-β结合蛋白相关会导致炎症和肿瘤。程序。美国国家科学院。科学。美国。2008;105:18758–18763. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12.Holm L，Kaariainen S，Rosenstrom P，Schenkel A.使用DaliLite搜索蛋白质结构数据库第3版。生物信息学。2008;24:2780–2781. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13.Daopin S，Piez KA，Ogawa Y，Davies DR.转化生长因子-β2的晶体结构：an超家族的不同寻常的褶皱。科学。1992;257:369–373.[公共医学][谷歌学者] 14Schlunegger MP，Grutter MG。2.2的晶体结构揭示了一个不寻常的特征人类转化生长的奥数分辨率因子-β2。自然。1992;358:430–434.[公共医学][谷歌学者] 15Radaev S等，转化生长因子-β1三元复合物研究异型体特异性配体识别和受体招募超家族。生物学杂志。化学。2010;285:14806–14814. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Gentry LE，Nash BW.前转化生长因子β1的前域当独立表达时是成熟的功能性结合蛋白生长因子。生物化学。1990;29:6851–6857.[公共医学][谷歌学者] 17.Belville C等人。患者抗苗勒管激素基因的突变持续性苗勒管综合征：生物合成、分泌和异常蛋白质的处理和三维分析模型。分子内分泌。2004;18:708–721.[公共医学][谷歌学者] 18Walton KL等。潜伏相关肽坐标的两个不同区域潜在转化生长因子β1的稳定性复杂。生物学杂志。化学。2010;285:17029–17037. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19.Little SC，Mullins MC。骨形态发生蛋白异二聚体组装异聚型I受体复合物对背心轴形成模式。自然细胞生物学。2009;11:637–643. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Lack J等人LTBP1第三个TB结构域的解决方案结构提供洞察隐藏潜伏物的大型潜伏复合体的组装转化生长因子-β。分子生物学杂志。2003;334:281–291.[公共医学][谷歌学者] 21Chen Y，等。转化生长因子-β-潜能形成的氨基酸需求TGF-β结合蛋白复合物。分子生物学杂志。2005;345:175–186.[公共医学][谷歌学者] 22罗B-H，卡曼CV，施普林格TA。整合素调节的结构基础和发出信号。每年。免疫学评论。2007;25:619–647. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23福曼·JR、克拉克·J。蛋白质的机械展开：对生物学的见解，结构和褶皱。货币。操作。结构。生物。2007;17:58–66.[公共医学][谷歌学者] 24Janssens K等人。卡穆拉蒂-恩格尔曼病：临床、放射学、，24个家族的分子数据及其对诊断和治疗。医学遗传学杂志。2005;43:1–11. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Walton KL等。一种常见的生物合成途径控制二聚体和抑制素及相关转化生长因子β的分泌（TGFβ）配体。生物学杂志。化学。2009;284:9311–9320. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Anderson SB、Goldberg AL、Whitman M.确定新的细胞外肌生成抑制素原池骨骼肌。生物学杂志。化学。2008;283:7027–7035.[公共医学][谷歌学者] 27Sengle G等。骨形态发生蛋白-生长因子复合物的靶向性纤维蛋白。生物学杂志。化学。2008;283:13874–13888. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Cui Y等。成熟BMP-4的活性和信号传导范围受前体中两个位点的顺序分裂前辈。基因发育。2001;15:2797–2802. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29Blanchet MH等人。Cripto招募Furin和PACE4并控制Nodal贩运在蛋白水解成熟过程中。EMBO J。2008;27:2580–2591. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30.Wilson CA等。苗勒抑制物质需要其N末端生物活性维持领域转化生长因子-β超家族。分子内分泌。1993;7:247–257.[公共医学][谷歌学者] 31Ulloa L等。左旋蛋白表现出独特的加工和激活MAPK通路。生物学杂志。化学。2001;276:21387–21396.[公共医学][谷歌学者] 32Keefe AD、Wilson DS、Seelig B、Szostak JW。重组蛋白的一步纯化纳米亲和链霉亲和素结合肽SBP-标签。蛋白质实验。净化。2001;23:440–446.[公共医学][谷歌学者] 33邹Z，孙帕德.人转化生长因子-β1的过度表达使用重组CHO细胞表达系统。蛋白质实验。净化。2004;37:265–272.[公共医学][谷歌学者] 34Gentry LE等。1型转化生长因子β：扩增表达和中国仓鼠卵巢成熟多肽和前体多肽的分泌细胞。分子细胞。生物。1987;7:3418–3427. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Brunner AM等人转化生长因子β1（TGF-β1）和TGF-α2（414）成熟TGFβ1内的前体和半胱氨酸残基：对分泌和生物活性。分子内分泌。1992;6:1691–1700.[公共医学][谷歌学者] 36赫拉斯B，马丁JL。提高衍射质量的后结晶处理蛋白质晶体。《水晶学报》。D。2005;61:1173–1180.[公共医学][谷歌学者] 37Otwinowski Z，Minor W.处理振荡中收集的X射线衍射数据模式。方法酶制剂。1997;276:307–326.[公共医学][谷歌学者] 38Kabsch W.输入：国际结晶学表格，第F卷：结晶学生物大分子。Rossmann MG，Arnold EV，编辑。施普林格；2001年，第730-734页。第25.2.9章基本数据。[谷歌学者] 39.Adams PD，et al.PHENIX：构建自动化晶体学的新软件结构确定。《水晶学报》。D。2002;58:1948–1954.[公共医学][谷歌学者] 40Vagin A，Teplyakov A.用MOLREP进行分子替换。《水晶学报》。D。2010;66:22–25.[公共医学][谷歌学者] 41Bailey S.CCP4套件：蛋白质程序结晶学。《水晶学报》。D。1994;50:760–763.[公共医学][谷歌学者] 43Emsley P，Cowtan K.Coot：分子建模工具绘图。《水晶学报》。D。2004;60:2126–2132.[公共医学][谷歌学者] 44Davis IW等人。摩尔概率：全原子接触和结构验证蛋白质和核酸。核酸研究。2007;35：W375–W383。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Takagi J、Petre BM、Walz T、Springer TA。细胞外整合素的整体构象重排外入和内出信号中的域。单元格。2002;110:599–611.[公共医学][谷歌学者] 46Chen X，et al.开放式头部构造激活的要求白细胞整合素αX（X）β2.程序。美国国家科学院。科学。美国。2010;107:14727–14732. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
