脂质诱导的肝细胞外囊泡通过靶向过氧化物酶体增殖物激活受体γ的MicroRNA调节肝星状细胞

细胞培养

人肝癌细胞系（HepG2）保存在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM；纽约州格兰德岛生命科技公司）中，补充有10%胎牛血清（FBS；CellGro，弗吉尼亚州马纳萨斯市）、5000 U/mL青霉素和5000μg/mL硫酸链霉素，加入0.85%氯化钠和5%丙酮酸钠（西格玛-阿尔德里希，密苏里州圣路易斯市）。实验前，将长链FFA、棕榈酸（Sigma-Aldrich）溶解在95%乙醇（100 mM储备溶液）中，并储存在−20°C下。斯科特·弗里德曼教授亲切地提供了人类永生化肝星状细胞（LX2）；在DMEM中培养，在0.85%NaCl中添加1%FBS（CellGro）、5000 U/mL青霉素和5000μg/mL硫酸链霉素。

肝细胞分离

使用之前在别处描述的两步方法分离小鼠原代肝细胞。²¹简言之，将WT C57/B6小鼠深度麻醉，打开腹腔，用EGTA原位灌注肝脏5分钟，并用胶原酶D（Roche Diagnostics，Indianapolis，in）以10mL/min的流速灌注10分钟。灌注后，切除部分消化的肝脏，消化液通过70μm尼龙网去除未消化的物质。将纯化的肝细胞接种在胶原蛋白涂层培养皿上，并在补充有10%FBS、5000 U/mL青霉素和5000μg/mL硫酸链霉素（0.85%NaCl）的William’s E培养基（Life Technologies）中培养。通过Tripan蓝染色和血细胞仪计数测定肝细胞活力。隔离后第二天进行实验。

肝星状细胞分离

根据先前公布的方案，从WT C57/B6小鼠中分离出原代小鼠肝星状细胞（mHSC）。21,22简单地说，用EGTA原位灌注肝脏5分钟，用蛋白酶E（0.4 mg/mL，Roche Diagnostics）灌注5分钟，胶原酶D（0.5 mg/mL；Roche Diagnostics，和DNAse I（2 mg/mL，罗氏诊断）15分钟。消化后的肝脏通过细胞过滤器过滤，并用Gey的平衡盐溶液清洗。通过在6.4%（w/v）Nicodenz（Axis-Shield PoC AS，Oslo，Norway）/Gey的平衡盐溶液（不含NaCl）中浮选，从其他实质性和非实质性肝细胞中纯化HSC。

通过检测维生素A自身荧光来评估HSC的纯度。对细胞进行计数，约为0.2×10⁶将细胞接种在含有10%FBS、1%青霉素/链霉素和1%HEPES（Sigma-Aldrich）的高糖DMEM培养基中的12孔板上，持续7天。每天用奥林巴斯对比相显微镜（奥林巴斯美国，宾夕法尼亚州中央谷）对细胞成像，并在分离后的第2天和进行实验前48小时用原代肝细胞衍生微粒处理细胞。

细胞外囊泡分离

HepG2和原代小鼠肝细胞（PMH）分别接种在100 mm培养皿或六孔板上，培养至80%至85%的融合。用0.25 mM棕榈酸在无血清DMEM中培养细胞，DMEM补充1.1%青霉素和链霉素，以及1%无内毒素牛血清白蛋白，培养24小时。如前所述，通过差速离心分离细胞外囊泡。¹⁶

简单地说，收集的培养基在1700℃离心两次克15分钟，清除细胞碎片和聚集物。然后将上清液转移到新的试管中，并在100000下进行超离心克在10°C下保持90分钟。²³将上清液收集在新试管中并用作无EV对照，造粒EV（13–15×10^三/mL培养基/100-mm培养皿）再次悬浮在500μL无血清DMEM中，用于随后的体外研究。

为了追踪肝细胞衍生的EV（Hep-EV），根据制造商的说明使用PKH26染料（Sigma-Aldrich）。如前所述，通过动态光散射、透射电镜、液相色谱-串联质谱和荧光激活细胞分选对Hep-EV进行了完整表征，包括大小、组成和分布。¹⁶在选定的研究中，Hep-EV与10μg/mL RNase（Roche Diagnostics）在37°C下孵育30分钟，以去除粘附在外叶上的任何RNA。

细胞转染

使用Lipofectamin RNAiMAX转染试剂（Life Technologies）将miR-128-3p MISSION microRNA MIMIC（Sigma-Aldrich）和mirVana miR-128-3 p抑制剂转染到LX2中。简单地说，LX2细胞以0.5–4×10的密度进行电镀⁵细胞/孔置于12孔或24孔板中，并转染75 nM的miR-128-MIMIC或30 nM的AntagomiR-128-3p。将转染细胞与无血清和无抗生素的Opti-MEM在37°C下孵育6小时，然后用补充有1%FBS的标准培养基替换培养基。24小时后，用肝细胞衍生EV或对照处理细胞48小时，然后收获或用于后续实验。使用抗miR阴性对照（生命技术）和miRIDIAN microRNA模拟阴性对照（Sigma-Aldrich）作为阴性对照。

对于使用Dicer1和Drosha沉默RNA（siRNA）混合物转染HepG2，我们根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000（生命技术）。简单地说，HepG2（3×10⁵在Opti-MEM中转染40 nM Silencer Select Dicer1和Drosha siRNA（ID:s23756和s26492；Life Technologies），并在37°C下培养6小时。6小时后，将Opti-MEM替换为含有10%FBS的常规培养基。转染48小时后，用或不用0.25μM棕榈酸（Sigma-Aldrich）或载体（1%无内毒素，低FFA牛血清白蛋白）处理细胞24小时。在与棕榈酸孵育后，分离EVs，并收获细胞用于蛋白质和RNA分离。

通过定量聚合酶链反应（qPCR）和Western blot分析评估沉默效果。根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（Life Technologies）在HepG2中转染mirVana miR-128-3p抑制剂。简单地说，HepG2以0.5–1×10的密度播种⁶在六孔板中，转染30 nM AntagomiR-128-3p。将转染细胞与无血清和无抗生素的Opti-MEM在37°C下孵育6小时，然后用无血清的DMEM替换培养基，用0.25 mM棕榈酸和1%低内毒素无FFA牛血清白蛋白替换培养基24小时。培养24小时后，分离EV。如本文所述分离RNA和miRNAs。

迁移分析

利用LX2细胞和原代小鼠HSC进行了体外迁移研究。根据制造商的说明，通过使用Radius 24孔细胞迁移分析（Cell Biolabs，San Diego，CA）进行伤口愈合分析，以分析HSC非定向迁移（趋化性）。将HSC接种在24孔板的半径上，并用Hep-EV或对照治疗24小时。对迁移到半径上的细胞数量进行分析，并以直方图报告数量。在伤口愈合试验期间，使用丝裂霉素（1μg/mL）抑制细胞增殖。使用孔径为8-μm的细胞培养插入物（Millipore，Billerica，MA）和24孔板，进行Boyden小室分析，以分析HSC定向迁移（趋化性）。每个孔中填充500μL无血清DMEM和Hep-EV或对照。

在一些选定的研究中，HSC与Hep-EV、抗Vanin-1中和抗体、miR-128-3p模拟物、抗miR-128-3 p或从转染Dicer/Drosha siRNA的HepG2分离的Hep-EVs孵育。插入物放置在每个孔的顶部，150μL细胞悬浮液（5×10⁴单元格）。将平板在37°C下孵育过夜，然后取下过滤器，并用含4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的Vectashield安装介质对其进行染色（Vector Laboratories，Burlingame，CA）。用荧光显微镜检测迁移的细胞，并计算每个场细胞核的数量。

增殖试验

根据制造商的说明，通过使用CyQuant直接细胞增殖测定法（Life Technologies）掺入5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）检测DNA合成来进行HSC增殖测定。HSC被镀在96毫米的板上（0.15×10⁵细胞/孔），并用对照或测试化合物处理48小时。使用底部阅读板阅读器检测异硫氰酸荧光素阳性信号。在定量图中报告了相对荧光作为对照的倍数变化。

Western Blot分析

HSC在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏诊断）的400μL放射免疫沉淀分析缓冲液中消化。细胞裂解后，将30–50μg蛋白质溶解在Laemmli缓冲液中，通过4%–20%的标准Tris-HCl凝胶电泳系统（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）进行分离，并转移到0.2μm的硝化纤维素膜（Bio-Rad实验室）。初级兔多克隆或小鼠单克隆抗体抗人TGF-β（Cell Signaling Technology，Beverly，MA）、α-SMA、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）、Dicer1、微管蛋白、结缔组织生长因子（CTGF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（1:1000；Genetex，Irvine，CA）和肌动蛋白（1:5000；Generetex）在4°C下培养过夜。使用适当的辣根过氧化物酶-二级抗体（细胞信号技术）检测一级抗体。蛋白质通过超信号West Pico化学发光试剂进行可视化（皮尔斯生物技术公司，伊利诺伊州罗克福德）。Western blot数据来自三个独立的实验，图中显示了一个代表性凝胶。

RNA的分离和定量实时聚合酶链反应

根据制造商的说明，使用RNeasy试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen）分离总RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Read Laboratories）逆转录。根据制造商的说明，使用SYBRGreen实时PCR主混合液（马萨诸塞州沃本市Kapabiosystem）对BioRad Cycler（Bio-Rad Laboratories）进行定量实时PCR（qRT-PCR）。内控基因为β2-微球蛋白（B2M）。用于扩增每个基因的PCR引物列于补充表1.

使用miRNeasy Mini试剂盒（Qiagen）从肝细胞、Hep-EV、HSC或小鼠肝组织中分离出miRNA，并在7300实时PCR系统（Life Technologies）上使用TaqMan microRNA逆转录试剂盒和TaqMan-Universal PCR试剂盒（Life Technologies）分析miRNA的表达。结合来自三种预测算法的计算数据：miRanda、TargetScan和mirWalk，评估靶向PPAR-γ的miRNAs的识别。我们选择了三个最保守的miRNAs：miR-130b、miR-128-3p和miR-27b。在单独的反应中使用选定miRNAs的特异性引物（生命科技），并计算所有样本相对于对照的折叠表达。使用U6小核糖核酸作为对照（生命科技）。

EVs在肝星状细胞中的整合及RNA的转移

在0.15×10孵育后，通过共焦显微镜评估Hep-EV并入HSC的情况⁵HSC/在四孔组织培养载玻片中加入PKH26阳性EV长达6小时。在选定的研究中，Hep-EV与Vanin-1（Genetex）中和抗体（4μg/mL）在4°C下孵育过夜，以抑制EV内化为HSC。为了分析Hep-EV向HSC的RNA转移，我们按照制造商的说明，用RNA荧光素异硫氰酸盐阳性染色剂SYTO RNASelect（Life Technologies）培养Hep-EVs，然后用PKH26（Sigma-Aldrich）标记EV膜。HSC与PKH26/SYTO阳性EVs孵育6小时，并通过Olympus FV1000光谱共焦显微镜评估荧光强度。在不同时间点（3小时、6小时、16小时和24小时）通过qRT-PCR评估miRNA向HSC的转移。我们用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚染色（DAPI）标记细胞核。显微照片的放大倍数为40倍。

脂毒性肝细胞释放的胞外囊泡诱导肝星状细胞迁移和增殖

在肝纤维化期间，HSC的激活、迁移和增殖迅速发生，以响应细胞外环境中的各种刺激，并在肝损伤期间释放。为了研究脂毒性诱导的HSC促纤维化反应期间释放的Hep-EV，我们将LX2暴露于Hep-EVs，并测试定向迁移（趋化性）、非定向迁移（化性）和增殖。LX2暴露于Hep-EVs导致细胞趋化性的显著刺激(图2A类和B类)，趋化(图2C类和D类)DNA合成作为增殖指标(图2E类)与未经处理的细胞或用无EV上清液处理的细胞相比。为了进一步分析阻断Hep-EV内化是否可以减少HSC的激活，我们在Hep-EV表面中和了Vanin-1。值得注意的是，我们观察到LX2迁移（趋化性和趋化性）和增殖显著减少(图2A类–E类). 综上所述，这些发现表明，暴露于脂毒性棕榈酸的肝细胞释放的EV在一个过程中有效地内化到HSC中，该过程至少部分取决于EV表面上VNN1的表达，并且它们诱导HSC活化。

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图2

肝细胞衍生的细胞外囊泡（EVs）可诱导肝星状细胞的迁移、创伤愈合反应和增殖。(A类)代表性显微照片（10倍放大）和(B类)暴露于HepG2衍生EVs（Hep-EV）16小时的人类永生化肝星状细胞（LX2）的Boyden腔分析的相应量化直方图。(C类)代表性的显微照片和(D类)经Hep-EV处理24小时的LX2伤口愈合试验的相应量化图。(E类)经Hep-EV治疗48小时的LX2增殖试验定量图。使用Vanin-1中和抗体阻止Hep-EV的内化。数值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）< .05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。

细胞外囊泡通过转移特异性过氧化物酶体增殖物激活受体-γ-靶向MicroRNAs介导肝星状细胞的纤维化效应

一些研究支持PPAR-γ作为关键介质在维持正常肝脏中静止HSC表型中的中心作用。24,25,26值得注意的是，已经证明PPAR-γ在体外原发性HSC激活期间逐渐减少，并且在完全激活的HSC中完全耗尽。25,27HSC激活期间PPAR-γ表达变化的分子机制尚不完全清楚。为了研究肝细胞衍生EVs是否通过调节PPAR-γ的表达而诱导HSC从静止状态向激活状态转变，我们将LX2细胞暴露于Hep-EVs，并测定PPAR-β的mRNA和蛋白表达水平。LX2暴露于Hep-EV，尤其是16小时(补充图3A类)与未经处理的细胞和用无EV上清液处理的细胞相比，PPAR-γmRNA表达减少了50%(图3A类). 暴露于Hep-EV 24小时后，PPAR-γmRNA水平的降低伴随着PPAR-β蛋白水平的显著降低(图3B类). 为了进一步证实这些发现，我们将PMH暴露于棕榈酸中，并收集和量化PMH衍生的EV(补充图2A类和B类).

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图3

肝细胞衍生的细胞外小泡（EVs）通过穿梭特异性microRNA下调过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）。(A类)定量聚合酶链反应（qPCR）分析用HepG2衍生EVs（Hep-EVs）处理16小时的人永生化肝星状细胞（LX2）中的PPAR-γ，包括或不包括Vanin-1中和抗体（VNN1-nAb）。(B类)在存在或不存在VNN1 nAb的情况下，用Hep-EV处理24小时的LX2中PPAR-γ蛋白水平的Western blot分析。(C类)定量PCR分析用原代小鼠肝细胞衍生EVs（PMH-EVs）处理16小时的原代小鼠肝脏星状细胞（mHSCs）中PPAR-γ的表达，包括或不包括VNN1-nAb。β2-微球蛋白（B2M）作为看家基因进行定量PCR，肌动蛋白作为Western blotting的负荷对照。(D类)PKH26阳性Hep-EVs内化的典型共焦显微照片（60倍放大）(红色)和用SYTO RNA标记的EV-RNA含量(绿色). (E类)用Hep-EVs处理LX2中PPAR-γ靶向miR-128-3p、miR-27b和miR-130b 16小时（含或不含VNN1 nAb）的定量PCR。(F类)定量PCR分析用0.25μM棕榈酸或载体处理24小时后从HepG2分离的EVs中的miR-128-3p。(G公司)对（mHSC）中PPAR-γ靶向miR-128-3p进行定量PCR，用Hep-EVs处理16小时，加或不加VNN1-nAb。(H（H）)定量PCR分析从经0.25μM棕榈酸或载体处理24小时的PMH-EVs中分离的EVs中的miR-128-3p。使用U6作为对照。数值表示三个独立实验的平均值±标准偏差*P（P）<.05, **P（P）< .005, ***P（P）<0.0005，Kruskal-Wallis检验和事后Mann-Whitney检验以及Bonferroni校正。

从WT小鼠分离的原代小鼠静止HSC在分离后第2天与PMH-EV孵育24小时，此时它们仍具有静止表型(补充图2C类). 正如之前在LX2细胞中观察到的那样，与未经处理的细胞（对照组）和用无EV上清液处理的mHSC相比，EV处理的原代mHSC中PPAR-γmRNA表达下调了90%(图3C类). 与对照组相比，在人类永生化和原代小鼠HSC中，通过用Vanin-1中和抗体（VNN1-nAb）阻止EVs内化，PPAR-γmRNA和蛋白水平没有变化或没有显著变化(图3A类–C类).

据广泛报道，EV携带和转移多种不同的生物活性分子，如mRNA、miRNAs、蛋白质和脂质16,28,29,30,31从原始单元格到目标单元格。目前，已发现miRNAs在HSC分化、增殖、凋亡和迁移中发挥重要作用。研究表明，HSC中miR-126的上调通过下调IkBα促进肝纤维化。³²在其他研究中，miR-150和miR-194的过表达通过抑制c-myb和rac1的表达，导致LX-2的细胞增殖抑制，以及1型胶原和α-SMA的减少。33,34此外，以前的报告已经确定并验证了几种靶向PPAR-γ的微RNA。35,36在这里，我们测试了Hep-EV是否携带一些靶向PPAR-γ的特异性microRNAs并将其转移到HSC中，从而增强其促纤维化活性。用SYTO绿色荧光核酸染色对脂肪肝细胞分离的EV进行EV-RNA和EV膜PKH26双重标记。共聚焦显微成像发现，暴露6小时后，含有RNA的EV并入HSC(图3D类).

我们进一步确定了靶向PPAR-γ的三种经验证的miRNA的水平：miR-128-3p、miR-27b和miR-130b。35,37,38,39我们在暴露于Hep-EV的LX2中鉴定了所有三种miRNAs。我们观察到，与未经处理的细胞相比，LX2细胞在所有三种miRNAs中都富集，但只有miR-128-3p的量通过中和EV上的Vanin-1而显著减少，这表明EV内化是将miR-128-3 p穿梭到靶细胞中的关键机制(图3E类).

为了证实这些结果，我们量化了从棕榈酸处理的HepG2中分离的EV中miR-128-3p的数量，并观察到EV与对照处理的Hep G2相比，该miRNA特别丰富(图3F类). 在用棕榈酸处理的PMH-EV孵育的原代小鼠HSC中的类似结果证实了这些结果(图3G公司和H（H）). 这些发现表明，Hep-EV携带并穿梭HSC中PPAR-γ靶向miRNAs，从而促进其活化。

作者感谢加州大学圣地亚哥分校神经科学中心（UCSD Neuroscience Core），特别是詹妮弗·桑蒂尼（Jennifer Santini）提供的显微镜协助，以及加州大学圣地亚分校摩尔癌症中心生物统计和生物信息学部的李红英博士提供的统计咨询。