弥漫性桥脑和中线高级别胶质瘤的空间基因组异质性：诊断活检和靶向治疗的意义

摘要

引言

弥漫性桥脑内胶质瘤（DIPG）是一种侵袭性儿童脑肿瘤，尽管目前有多种治疗方法，但中位生存期不到1年[1,2]. 儿童中线非脑干高级别胶质瘤（mHGG）与DIPG具有相同的临床和生物学特征，预后也同样糟糕[三–5]. 从历史上看，不愿意对这些位置不稳定的肿瘤进行活检以获取组织，阻碍了对其生物学的理解。最近，越来越多的人接受活检的安全性[6–9]，基于自动系统的协议的开发[10–12]高通量测序技术的进步使人们能够对DIPG和mHGG的分子基础进行前所未有的深入研究。基因组研究详细说明了许多典型癌症途径的复发性畸变和新癌基因的突变，如高复发组蛋白突变(H3F3A型或HIST1H3B/C/I公司)和ACVR1型[5,10,13,14].

尽管有显著的基因组发现，DIPG和mHGG的治疗进展仍然是静止的。标准的治疗，即局部放射治疗，只提供短暂的局部控制，无法解决最近报道的这些高度浸润性肿瘤的转移潜能[1,15,16]. 辅助化疗和靶向治疗的临床试验，包括靶向关键途径的试验，如血小板衍生生长因子受体α（PDGFRA）[7–9,17]，几十年来没有改善结果[11,12,18]. 肿瘤内基因组异质性和克隆进化在成人HGG的发病机制和治疗耐药性中得到了公认[19–21]. 我们之前报道过尸检DIPG的肿瘤内组织病理学变化[1]. 然而，在DIPG或mHGG中尚未报告对空间基因组异质性的评估，这对于确定从小型诊断性活检和科学整合分子靶向治疗中获得的分子图谱的通用性具有重要意义。我们使用全外显子组测序（WES）综合评估了8例DIPG或mHGG患儿的肿瘤内基因组空间异质性。

材料和方法

患者队列

组织样本(n个============================================================================38），从8名DIPG患者获得临床数据(n个============================================================================7） 或mHGG(n个============================================================================1） 同意2013-2014年辛辛那提儿童医院医疗中心IRB批准的儿科脑肿瘤库（PBTR）尸检方案（研究：2013-1245）。DIPG的诊断基于快速进展的临床症状和治疗前磁共振成像（MRI）的成像特征（浸润性肿瘤至少累及三分之二的脑桥）。一名双丘脑肿瘤患者接受了活检（未测序）；未对DIPG进行活检。一位神经放射学家（J.L.）对所有患者的诊断和尸检图像进行了集中审查。

尸检协议

从死亡到尸检的中位时间为11.8小时（范围：4.8–20小时）。尸检时间并不影响DNA的质量或数量。从颅骨取脑时，对大体检查可见的正常大脑和肿瘤进行取样，包括脑桥中至少两个位置（通常为左前和右后）。收获后，整个大脑被固定在福尔马林中。Ex-vivo公司使用1.5-Tesla MR系统对7名患者（患者5因采集后解剖结构不良而未成像）的固定全脑进行MRI，该系统采用高分辨率T1和T2加权图像。进行3D渲染以优化梯度回波T1的方向。分别在大脑和小脑上获得冠状和轴向斜视图像。将体积数据集重建为标准解剖方向，并尝试复制平面数据集的标准体内切片方向。病理学家（L.M.）和神经放射学家联合检查了苏木精-伊红（H&E）切片和MRI图像，以确定邻近肿瘤和转移肿瘤的位置。如果肿瘤位于脑桥（或患者8的丘脑）内，则将其归类为“原发性”；如果肿瘤涉及毗邻原发肿瘤的中枢神经系统结构，则归类为“邻近”；如果涉及非邻近中枢神经系统的结构，则分类为“转移性”。对额叶、小脑皮质、大脑/小脑的所有深灰色核团和所有脑干结构进行常规切片，无论其大体和/或MRI异常。两名神经病学家（L.M.和C.H.）独立审查每个肿瘤样本，以指定组织学、分级和肿瘤百分比。为了确保足够的肿瘤含量（图1)从每个冰冻标本、每个福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）块的初始切割和卷轴后的额外FFPE块切割中检查H&E玻片，以提取DNA。

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图1

儿童DIPG和mHGG的空间组织病理学和基因组景观。脑桥内部或脑桥与邻近或转移部位之间的组织学和WHO分级经常是异质的。体细胞突变（如果与拷贝数改变共存，则由黑框或彩色框的剥离覆盖物表示）H3F3A型（H3.3），HIST1H3B公司（H3.1），ACVR1型,PIK3CA公司,FGFR1号机组、和遇见在所有疾病部位都得到了保护。体细胞突变ATRX、BCOR,MYC公司、和PDGFRA公司和PDGFRA公司扩增在空间上是不均匀的。WHO=世界卫生组织，FFPE=福尔马林固定石蜡包埋

结果

显示空间异质性的基因突变表明二次命中和单一治疗的可能性低

PDGFRA公司8例患者中有2例发生点突变。患者1的所有疾病部位都有两个PDGFRA公司突变（S247L，Y555C），但在患者3的6个疾病部位中只有1个也表现出高水平突变PDGFRA公司放大，包含aPDGFRA公司突变（E229K）（图2).PDGFRA公司在五名患者中观察到增益/扩增，并显示出显著的肿瘤内异质性（附加文件7：图S3），表明该重复遗传事件的克隆性。其他肿瘤内异质性突变包括自动条码读取器,BCOR公司、和MYC公司.杂合子自动条码读取器在患者6（H2254R）和患者8（R2197L）中发现突变；虽然在患者8的所有疾病部位都保持不变自动条码读取器患者6的转移灶中没有突变。杂合子BCOR公司在患者2的单个脑桥部位发现突变（A535V），杂合子MYC公司患者5的两个脑桥部位均发现突变（Q51L），但在转移灶中未发现突变。FISH确认否MYC公司患者5任何肿瘤样本的拷贝数增加。

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图2

患有DIPG的4岁男性患者的肿瘤内异质性（患者3）。每行代表一个不同的疾病部位，包括原发肿瘤中的四个不同区域、右侧基底神经节中的一个相邻病变和一个转移性软脑膜病变。一除右侧基底节病变（WHO III级）外，每个肿瘤位置的H&E均显示WHO IV级组织学，b条P53 IHC显示可变阳性，c（c） PDGFRA公司FISH显示脑桥肿瘤内4个部位中的3个部位出现增益或放大，相邻的右侧基底节病变出现增益，转移性软脑膜病变出现放大，d日 PDGFRA公司ddPCR显示在右后桥中观察到PDGFRA突变，e（电子） H3F3A型桑格测序显示，所有样本都发生了突变，如果样本位置取自新鲜（“初级Pons”，一排)或固定组织(剩余行)尸检时与尸检MRI图像上确定的肿瘤位置相对应(克). 因为尸检成像仅对固定组织进行，所以新鲜组织样本的MRI成像（“Primary Pons”，一排)死亡前大约6周是否进行了尸检MRI

除了TP53型，我们没有检测到参与细胞周期调控的基因中的体细胞突变，例如川东北4/6,CCND1/2/3,CDKN2A/B型或RB1型.放大川东北4/6或CCND1/2/3，在DIPG中更常见[14]，未进行评估。正如预期的那样，H3G34R/V突变，主要在半球儿童HGG中报告[25]也未找到。

讨论

最近的大规模基因组研究确定了儿童HGG的患者间分子复杂性[5,10,13,14,24]; 然而，对空间亚克隆结构的有限理解阻碍了有效治疗方法的发展。据我们所知，我们是第一个报告对DIPG和mHGG中匹配的原发、相邻和转移位点进行多区域遗传分析的人。疾病定义的体细胞突变H3F3A型,HIST1H3B公司、和ACVR1型与影响（RTK）-PI3K-MAPK通路的突变一样，在所有肿瘤部位都是保守的。然而，其他目标分子畸变，如PDGFRA公司，具有空间异质性。这项研究的结果重申了儿童和成人HGG之间的独特生物学特征，对于确定诊断活检的作用以及为这些致命的儿童肿瘤提供治疗策略至关重要。

我们的发现证实了DIPG和mHGG对侵袭性局部和远处转移扩散的倾向（图1)与我们之前的研究一致，在尸检的DIPG中，分别有25%和39%发现脑干外和软脑膜疾病[1]. Caretti等人同样报道了尸检中四分之一DIPG涉及软脑膜[26]. 重要的是，我们通过尸检MRI在5例患者中发现了转移性疾病的组织学证据，这些患者的尸检图像或尸检时均未发现肿瘤。因此，疾病传播是普遍存在的，但在大多数情况下，疾病传播较晚。

空间组织学异质性，常见于成人GBM[27,28]除一名患者外，在我们队列中的所有患者中均观察到（图1). 来自两个DIPG的组织显示了牙内组织学变化，其中一个有WHO II、III和IV级星形细胞瘤的证据。我们之前在尸检DIPG中报告了不同水平脑干的实质性组织学异质性[1]; 其他尸检研究报告对脑桥的一个部位进行了有限的组织学评估，其中大多数是高级别的[12]. 我们队列中的转移性病变倾向于组织学分级较低，这一发现与我们之前的报告一致[1]. 虽然转移区域的变化可能代表肿瘤含量较低区域的取样偏差，但我们发现DIPG中肿瘤密集的脑桥内组织学异质性重申了组织病理学分级用于临床分层的可靠性较差[1].

成人HGG存在显著的时空遗传和表观遗传异质性，包括已知驾驶员突变的区域变异表皮生长因子受体,遇见,PTEN公司、和川东北6[19]以及MGMT公司启动子甲基化[29]. 我们是第一家对儿童DIPG和mHGG的空间基因组景观进行综合评估的公司。迄今为止，在DIPG和mHGG中最重要的基因组发现是进化高度保守组蛋白基因的反复突变H3F3A型和HIST1H3B公司，导致赖氨酸27被甲硫氨酸（K27M）取代；这些相互排斥的体细胞变化发生在大约80%的DIPG中[14]和50%的儿童丘脑GBM[4,5]. 与成人HGG中驾驶员突变的显著肿瘤内异质性不同，我们证实了HGG患者中存在杂合K27M突变H3F3A型或HIST1H3B公司在四个和三个DIPG中，所有疾病分区的100%肿瘤细胞中。这一发现建立在先前的报告的基础上，该报告显示，所有原发性DIPG肿瘤细胞中组蛋白突变的等位基因频率持续较高，采用深度测序[1,30]和Kambhampati等人，在一名DIPG患者尸检中发现IHC在脑桥和脑室肿瘤扩展之间保护H3.3-K27M[11]. 激活点突变ACVR1型，存在于20–30%的DIPG中[5,14]并且潜在的靶向性，在所有肿瘤分区中也得到了保护。ACVR1型如前所述，突变与H3.1-K27M密切相关[14]. 此外，激活突变的空间守恒FGFR1号机组,PIK3CA，和遇见支持在DIPG中靶向（RTK）-PI3K-MAPK通路的治疗相关性。空间同质性PIK3CA公司特别是突变，支持了它们在儿童HGG中作为“创始突变”的作用，正如Wu等人所建议的那样，他发现了一种常见的PIK3CA公司来自诊断和复发的匹配mHGG样本的多个肿瘤亚克隆中的突变（Q546K），不仅表明空间上的保守性，而且表明纵向上的保守性[14]. 尽管TP53型所有肿瘤分区都存在畸变，畸变的类型和位置各不相同，表明它们是关键的，但可能是二次打击。

与成人HGG相似，我们观察到PDGFRA公司我们这群人中的反常现象。患者3的空间异质性尤其明显，在6个肿瘤位置中的3个位置观察到扩增（图2). Fontebasso等人同样报道了治疗无效的mHGG中五个原发肿瘤部位之一的扩增[5]. 有趣的是，在患者3中，一个脑桥部位出现高水平PDGFRA公司放大也有错义PDGFRA公司突变（E229K）；其他网站PDGFRA公司增益/扩增为野生型，具有足够的读取覆盖率，表明该激活突变在PDGFRA公司-扩增的克隆。我们的发现与Puget等人报告的PDGFRA公司三种治疗药物DIPG的突变和扩增[31]但与Paugh等人的报告不同，Paugh等发现43个DIPG中分别有26个和5%的扩增和突变具有互斥性[32]. 虽然很明显PDGFRA公司突变和拷贝数变化出现在亚克隆群体中，需要进一步研究以确定其时间顺序和功能后果。

我们对DIPG和mHGG的空间基因组景观的描述为诊断活检的实用性和选择治疗靶点背后的生物学原理提供了关键的见解。自20世纪80年代以来，影像而非组织诊断一直是DIPG和大多数mHGG的标准。最近，由于治疗前活检的发病率较低，因此得到了更广泛的接受[7,8]以及发现潜在可行的基因改变，可能为治疗提供信息[5,6,14]. 尽管儿科神经肿瘤学界的观点发生了显著转变，但对内在异质性的持续担忧、从旁观者突变中破译驱动因素的能力差以及立体定向活检产生的小组织产量的取样偏差阻碍了治疗前活检以指导治疗的统一实施。我们的研究为DIPG和mHGG的诊断活检提供了一些重要见解，包括明确证明疾病驱动组蛋白突变在肿瘤内是保守的。一些大型临床基因组研究已经证明H3突变与预后相关[33,34]. 对治疗前组织的持续采集将使基于组蛋白突变的风险组和分子标记得以细化，这有可能阐明致癌机制和耐药途径。我们的研究结果还表明，对最安全的颅内疾病部位进行立体定向活检可以提供真诚地某些分子畸变的表现，消除了在原发性或转移性肿瘤的不同部位进行多次活检以阐明可用于指导治疗的分子特征的需要。此外，本报告和其他报告的发现[1,32]原发性和转移性肿瘤部位可能表现出不同的星形细胞瘤组织病理学分级（II-IV级），而不影响预后或确定风险组，这也支持限制活检部位数量的建议。DIPG和mHGG的立体定向活检只能在专业医疗中心进行，并由受过此类技术培训的熟练儿科神经外科医生进行，以将风险降至最低。

辅助治疗的发展应侧重于针对高度保守的遗传变异，这可能是真正的疾病驱动因素。有前景的临床前数据表明，去甲基化酶抑制剂（如GSKJ4）具有逆转DIPG中H3突变诱导的广泛表观遗传失调和转录特征的有效能力，支持对此类药物进行临床翻译的持续努力[三,7,8]. Grasso等人还报道了令人信服的体内数据，证明了多组蛋白脱乙酰酶抑制剂panobinostat对H3-突变DIPG异种移植物的治疗效果，包括与GSKJ4的协同作用[5,6,14]. ALK2抑制剂的持续工作ACVR1型-突变体DIPG也令人鼓舞[10,33,34]. 针对DIPG和mHGG亚克隆变体的治疗，如PDGFRA公司不应放弃，而应采用联合疗法而非单一疗法。我们的研究结果的治疗意义应该在实施活检导向靶向治疗的临床试验中进行正式测试。事实上，基于活检结果的靶向分层已经在几个正在进行的新诊断DIPG临床试验中进行({“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT01182350”，“term_id”：“ncT01182300”}}编号01182350,{“类型”：“临床试验”，“属性”：{“文本”：“NCT02233049”，“term_id”：“ncT0223304”}}NCT02233049号).

结论

虽然我们的研究结论必须在更大的队列中进行验证，最好包括用于纵向比较的诊断和尸检组织，但我们的发现对DIPG和mHGG儿童具有直接的临床相关性，因为我们支持更广泛地实施诊断性活组织检查，以促进正在进行的生物学发现，进一步明确分子危险组，并告知治疗策略。

脚注

参与者信息

Lindsey M.Hoffman，电子邮件：gro.cmhcc@namffoh.yesdniL.

Mariko DeWire，电子邮件：gro.cmhcc@eriwed.okiram公司.

斯科特·雷尔，电子邮件：ac.sdikkcis@llayr.ttocS.

巴维尔·布茨科维奇，电子邮件：ac.sdikkcis@zciwokzcub.lewaP.

詹姆斯·利奇，电子邮件：gro.cmhcc@hcael.semaj.

莉莉·迈尔斯，电子邮件：gro.sruomen@selim.ilil.

阿伦·拉马尼，电子邮件：ac.sdikkcis@inamar.nura.

迈克尔·布鲁德诺，电子邮件：ac.sdikkcis@ondurb.leahciM公司.

Shiva Senthil Kumar，电子邮件：gro.cmhcc@ramuk.avihs公司.

拉希德·德瑞西，电子邮件：gro.cmhcc@issird.dihcar公司.

菲利普·德克斯海默，电子邮件：gro.cmhcc@remiehxed.pillihp公司.

拉尔夫·萨卢姆，电子邮件：gro.cmhcc@muollas.hplar.

莱昂内尔·周，电子邮件：gro.cmhcc@wohc.lenoil公司.

特伦特·汉梅尔，电子邮件：gro.cmhcc@lemmuh.tnert.

查尔斯·史蒂文森，电子邮件：gro.cmhcc@nosnevets.selrahC.

问：理查德·卢，电子邮件：gro.cmhcc@ul.drahciR.

布莱斯·琼斯，电子邮件：gro.cmhcc@senoj.esialb.

David Witte，电子邮件：gro.cmhcc@ettiw.divad.

布鲁斯·阿罗诺，电子邮件：gro.cmhcc@wonora.ecurt.

辛西娅·E·霍金斯，电子邮件：ac.sdikkcis@snikwah.aihtnyC.

玛丽亚姆·福拉迪，电话：513-803-0721，电子邮件：gro.cmhcc@idaluof.mayraM公司.

参考文献