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细胞生理学杂志。作者手稿；PMC 2015年12月30日提供。
以最终编辑形式发布为：
细胞生理学杂志。2011年11月；226(11): 2925–2933.
数字对象标识：10.1002/jcp.22640
预防性维修识别码：项目经理4695992
尼姆斯：美国国立卫生研究院737746
PMID：21302291

缺氧诱导因子1介导NADPH氧化酶-2在间歇性缺氧反应中的表达增加

袁国祥,1 沙基尔·汗,1 罗微,2,三，4 贾亚斯里·南杜里,1 格雷格·塞门扎,2,三，4和Nanduri R.Prabhakar公司1,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

睡眠呼吸紊乱伴反复呼吸暂停与间歇性缺氧（IH）相关。IH引起的心血管疾病是由前氧化酶，特别是NADPH氧化酶-2（Nox2）产生的活性氧（ROS）增加引起的。先前的研究表明：（i）IH以ROS依赖的方式激活低氧诱导因子1（HIF-1），（ii）HIF-1是IH诱导ROS生成所必需的，这表明存在前馈机制。在本研究中，我们使用多种药理学和遗传学方法，研究了HIF-1是否介导IH诱导的Nox2表达在小鼠中枢和外周神经系统以及培养细胞中。IH增加PC12嗜铬细胞瘤细胞以及野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中的Nox2 mRNA、蛋白质和酶活性。通过RNA干扰或药物抑制（地高辛或YC-1）阻断HIF-1活性或通过MEF中HIF-1α的基因敲除来消除或减弱这种作用。通过用铁螯合剂去铁胺处理PC12细胞20小时或用HIF-1α表达载体转染它们来增加HIF-1α的表达，增加了Nox2的表达和酶活性。野生型小鼠暴露于IH（8小时/天，持续10天）后，大脑皮层、脑干和颈动脉体中的Nox2 mRNA表达上调，但小脑中没有上调。IH没有诱导Nox2在大脑皮层、脑干、颈动脉体或小脑中的表达Hif1a型+/−对IH没有表现出ROS增加或心血管疾病的小鼠。这些结果建立了HIF-1、ROS生成和心血管病理学对IH反应的致病机制。

睡眠呼吸紊乱伴反复呼吸暂停（短暂、重复性停止呼吸）是成人发病率和死亡率的主要原因(Nieto等人，2000年)和早产儿(Poets等人，1994年). 反复呼吸暂停与动脉血氧周期性减少或间歇性缺氧（IH）有关。反复呼吸暂停患者和接触IH的啮齿动物表现出自主神经疾病，包括持续交感神经激活、高血压和循环儿茶酚胺升高(Narkiewicz和Somers，1997年;Peppard等人，2000年;Prabhakar和Kumar，2010年). 关于人类的研究(Narkiewicz和Somers，1997年)和IH的啮齿动物模型(Fletcher等人，1992年;Peng等人，2006年)研究表明，颈动脉体是检测动脉PO变化的主要化学受体2，通过触发交感神经系统的反射激活和肾上腺髓质嗜铬细胞（AMC）儿茶酚胺分泌增加对IH作出反应，导致循环儿茶酚酚胺升高和血压升高(Bao等人，1997年;Kumar等人，2006年;Souvannakitti等人，2009年). IH增加颈动脉体中活性氧（ROS）的水平(Peng等人，2003年)和肾上腺髓质(Kumar等人，2006年;Souvannakitti等人，2009年). 抗氧化治疗可防止颈动脉体功能增加(Peng等人，2003年;Peng和Prabhakar，2004年;Del Rio等人，2010年)，AMC儿茶酚胺分泌增加(Kumar等人，2006年;Kuri等人，2007年;Souvannakitti等人，2009年)和血压升高(Peng等人，2006年;Troncoso Brindeiro等人，2007年)，表明ROS信号传导是IH诱发的自主神经疾病的关键细胞机制。

NADPH氧化酶（Nox）活性是细胞活性氧的主要来源(Bedard和Krause，2007年). IH导致颈动脉体中几种Nox亚型的表达增加(Peng等人，2009年)、AMC(Souvannakitti等人，2010年)和中枢神经系统（CNS；Zhan等人，2005年)以及培养的PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞，其来源于AMC(袁等，2008). 在各种Nox亚型中，Nox2参与调节IH对颈动脉体功能的影响(Peng等人，2009年)，AMC分泌的儿茶酚胺(Souvannakitti等人，2010年)和睡眠行为(Zhan等人，2005年). 然而，潜在的机制增加了否2对IH反应的基因表达尚未阐明。

转录激活物低氧诱导因子1（HIF-1）是O2通过调节数百个基因的表达来控制多种生理过程的体内平衡(Mole等人，2009年;Semenza，2009年). HIF-1是一种异二聚体蛋白，由组成性表达的HIF-1β亚单位和O2-调节HIF-1α亚单位(Wang等人，1995年). 我们之前报道过IH增加PC12细胞培养物中HIF-1α蛋白水平(袁等，2005,2008)和小鼠(Peng等人，2006年). 在产生儿茶酚胺的PC12细胞中，IH诱导HIF-1α蛋白水平需要ROS依赖性激活磷脂酶Cγ（PLCγ）、蛋白激酶C（PKC）和哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR；袁等，2008). 对暴露于IH的野生型（WT）小鼠的生理学研究表明，它们有显著的自主神经疾病，包括颈动脉体活动增强、血浆儿茶酚胺升高、缺氧通气反应过度和高血压(Peng等人，2006年). 相反，室友Hif1a型+/−在编码HIF-1α的基因座上杂合了一个空[敲除（KO）]等位基因的小鼠，没有表现出任何这些IH诱导的自主反应(Peng等人，2006年). 此外，IH暴露的WT小鼠的CNS中ROS水平显著增加，但在Hif1a型+/−老鼠(Peng等人，2006年). 综上所述，这些结果表明，IH诱导的ROS导致HIF-1激活，从而导致进一步的ROS生成，从而创建前馈机制，这对心血管和呼吸异常的发病机制至关重要。建立HIF-1增加ROS生成的分子机制是理解IH病理生物学的下一个关键步骤。基于上述观察结果，我们验证了一个假设，即HIF-1作为对IH的反应，通过激活否2基因。

材料和方法

细胞培养

PC12细胞（来自L.Green博士的原始克隆）在添加有10%马血清、5%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml）和链霉素（100µg/ml）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养，培养温度为90%空气和10%CO237°C时。在所有实验之前，将细胞置于无抗生素培养基中，并将血清饥饿16小时，以避免血清对HIF-1活性的任何混淆作用。在涉及药物治疗的实验中，细胞用药物或载体预处理30分钟。永生化成纤维细胞来源于WT和Hif1a型−/−先前报道的小鼠胚胎(Feldser等人，1999年).

细胞暴露于IH

如前所述，细胞培养物暴露于IH(袁等，2005). 细胞暴露于1.5%O的交替循环中2持续30秒，然后是20%O2在37°C下保持5分钟。气体流量由定时器控制的电磁阀控制。O（运行）2将电极（加州洛杉矶Lazar Research Laboratories Inc）置于组织培养基和环境O中，对浓度进行监测2液位由O监控2分析仪（Alpha Omega Instruments，加利福尼亚州坎伯兰）。

小鼠接触IH

芝加哥大学动物护理和使用委员会批准了小鼠实验，并在年龄和性别匹配的WT（Hif1a）上进行+/+)和Hif1a+/−老鼠(Iyer等人，1998年). 如前所述，将饲养在饲养笼中的无束缚、自由移动的小鼠（体重20–25 g）每天暴露于IH 8小时，持续10天(Peng等人，2006年). 简单地说，小鼠被放在一个专门的房间里，用纯氮和压缩空气交替循环冲洗。缺氧时，激发O2水平迅速降到5%2.气体流量由定时器控制的电磁阀调节。环境温度O2和CO2试验箱中的液位由O连续监测2/CO公司2分析仪（Alpha Omega仪器，加利福尼亚州坎伯兰；9500系列）。对照实验是在暴露于压缩室内空气交替循环而非同一腔室中缺氧的动物身上进行的。

化学制品

除非另有说明，否则所有化学品和试剂均为分析级，并从西格玛化学公司（密苏里州圣路易斯市）获得。

免疫印迹分析

如前所述进行免疫印迹分析(袁等，2005). 简单地说，通过7.5%PAGE–SDS凝胶电泳对细胞提取物（25µg）进行分级，并转移至聚乙烯吡咯烷酮二氟化物膜（Immobilon-P，Millipore，Bedford，MA）。用含有5%非脂肪乳的Tris缓冲盐水（TBS-T）封闭膜，并在封闭缓冲液中以1:500稀释度与抗HIF-1α单克隆抗体（Novus Biologicalsm，Littleton，CO）孵育。用山羊抗兔二级抗体结合辣根过氧化物酶（Chemicon，Temecula，CA；1:2000稀释）处理膜，并使用增强化学发光检测系统（Amersham BioSeciences，Piscataway，NJ）观察免疫复合物。采用类似程序对Nox2（加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯，稀释度1:2000）、α-微管蛋白（密苏里州圣路易斯市西格玛，1:3000）、PLCγ1（马萨诸塞州丹佛市细胞信号；1:1000）、磷酸化PLCγ1，和磷酸化PKC（抗泛PKCγ通过514; 细胞信号；1:1,000).

瞬时转染和报告基因检测

为了分析HIF-1转录活性，将细胞与两种报告质粒共同转染：p2.1，其中包含SV40启动子下游的萤火虫荧光素酶编码序列和人类68 bp缺氧反应元件（HRE）ENO1公司基因(Semenza等人，1996年); 和pRSV-LacZ，包含RSV启动子和β-半乳糖苷酶（β-gal）编码序列。荧光素酶与β-半乳糖活性的比值是衡量HIF-1转录活性的一个指标。如前所述，使用Lipofectamine（Invitrogen，Carlsbad，CA）将质粒DNA转染细胞(Yuan等人，2005年). 简单地说，细胞被放置在密度为1×10的60 mm组织培养板中5含有生长培养基的血清中的细胞/平板。24小时后，将含有1µg p2.1和0.25µg pRSV-LacZ以及10µg Lipofectamine的DNA-脂质体混合物添加到细胞中，并在2 ml无血清培养基中培养4小时，然后添加2 ml完整（含血清）培养基。24小时后，细胞在无血清培养基中饥饿18小时，并暴露于20%的O2或IH。Bright-Glo™荧光素酶分析系统（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）用于测量细胞裂解液中的荧光素素酶活性。使用蛋白质分析试剂盒（加州里士满Bio-Rad）进行蛋白质分析。我们验证了所有报告基因分析都在线性范围内。用HA3-HIF-1α质粒瞬时转染的方案与用p2.1质粒瞬时转染的方案相同。

NOX和HIF-1αmRNA表达的测量

如前所述，使用MiniOpticon系统（Bio-Rad）和SYBR GreenER两步qRT-PCR试剂盒（Invitrogen）进行实时逆转录酶（RT）-PCR(Peng等人，2009年). 简而言之，使用TRIZOL从PC12细胞、小鼠颈动脉体、大脑皮层和脑干提取RNA，并使用上标III（Bio-Rad）逆转录1µg等分。实时RT-PCR扩增的引物序列如所示表1根据比较阈值（C）计算相对mRNA水平（R）T型)使用公式R=2的方法-ΔCT，式中ΔCT型是正常氧和IH中给定靶mRNA的阈值周期之间的差异。CT型该值被视为一个分数循环数，在此分数循环数下，样品的发射荧光超过基线的固定阈值，并且该值被归一化为内部标准（18S公司rRNA）。通过省略模板和执行标准熔融曲线分析，确认所有产品的纯度和特异性。

表1

定量实时RT-PCR分析的引物

姓名核苷酸
序列		大小基因银行#
rNox2-FWD（序号2）GTGGAGTGTGTGAATG公司219NM_023965号
rNox2-REV号TTTGGTGGAGGATGTGAGA公司
rHIF-1α-FWD中国民航总局150NM_024359
rHIF-1α-修订TCAAGTCGTGCTGAATAATC公司
r18S-FWD（前进档）GTAACCCGTTGAACCCAATT公司151×1117
r18S-版本CCATCCAATCGGTAGCG公司
mNox2-FWD型AGCTAGAGGTGTGAGTTAGTGG公司88NM_007807
mNox2-REV号CACAATATTGTACCACACACTGAG公司

NADPH氧化酶（Nox）活性的测定

从PC12细胞和各种组织中分离出膜富集蛋白组分(Li和Shah，2002年)用细胞色素c还原法测定Nox活性(Li等人，2001年;Khan等人，2010年). 简单地说，100µg等分膜蛋白在带有150µm细胞色素的25 mM HEPES缓冲液（pH 7.0）中培养c（c）在有无超氧化物歧化酶（Sod；200 U/ml）的情况下，100µm NADPH在37°C下保持30分钟。细胞色素c（c）通过测定550nm处的吸光度来测量还原度。使用21 mM的消光系数计算以nmol/min/mg蛋白质表示的SOD抑制Nox活性的量−1厘米−1.

短干扰RNA（siRNAs）的研究

PC12细胞（5×105)将其置于IV型胶原（BD Biosciences，Bedford，MA）包被的培养皿上，并培养24小时，然后使用DharmaFECT 2（Dharmacon Research）以100pmol/ml的浓度用HIF-1α、Nox2特异性的siRNA（Santa Cruz）或加扰（对照）序列转染。转染细胞在完全培养基中培养48小时，然后暴露于60个周期的IH或常氧环境中。

数据分析

数据表示为3-5个独立实验的平均值±SEM，每个实验一式三份。通过方差分析（ANOVA）和P（P）-值<0.05被认为是显著的。

结果

IH增加培养PC12细胞中Nox2的表达和活性

PC12细胞，代表O的细胞培养模型系统2-颈动脉体和肾上腺髓质等敏感的儿茶酚胺产生细胞(袁等，2005,2008)，暴露于由交替低氧循环（1.5%O230秒）和再氧（20%O2持续5分钟）。在这些条件下，Nox2 mRNA(图1A)，Nox2蛋白(图1B)和氮氧化物酶活性(图1C)随着IH持续时间从10次增加到30次，逐渐增加到60次。采用siRNA-介导的功能丧失方法来确定Nox2对IH诱导的Nox活性增加的贡献。用Nox2 siRNA或对照干扰siRNA转染细胞，然后暴露于60个周期的IH（IH60)或常氧。IH公司60-在转染Nox2 siRNA的细胞中，Nox2蛋白表达和Nox酶活性的诱导增加被阻断，但在转染打乱siRNA细胞中则没有被阻断(图1D、E). 这些结果表明，Nox2是IH诱导PC12细胞中Nox活性增加的主要亚型。因此，在接下来的实验中，我们研究了IH导致Nox2表达增加的分子机制。

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IH上调PC12细胞中的Nox2。A： Nox2 mRNA表达分析。细胞暴露于20%O2（N） 或10–60次IH循环（1.5%O下30秒2在20%O下交替5分钟2). 实时反转录PCR检测Nox2 mRNA与18的比值S公司rRNA。结果被归一化为正常氧细胞的结果。B： Nox2蛋白表达。对暴露于0-60周期IH的细胞裂解物进行Western blot分析。顶部零件，代表性Nox2免疫印迹。底部零件，将Nox2蛋白的密度分析标准化为微管蛋白表达，并表示为与常氧对照的百分比变化（N）。C： 氮氧化物酶活性分析。如材料和方法中所述，对暴露于0-60个IH循环的细胞的膜组分中的Nox活性进行分析。在IH暴露前向细胞中添加的落叶松素（500µM）和AEBSF（300µM60-暴露的细胞。D： Nox2 siRNA防止IH60-诱导Nox2蛋白上调。用Nox2或干扰siRNA转染细胞，然后暴露于IH60.顶部零件、代表性Nox2和微管蛋白（对照蛋白）免疫印迹分析。底部零件Nox2蛋白的密度分析归一化为微管蛋白表达，并表示为常氧对照的百分比（N）。E： IH对siRNA-转染PC12细胞中Nox酶活性的影响60显示平均值±SEM（n=3–5）**P（P）与对照组相比<0.01（N）。

HIF-1的药理学抑制阻断对IH的Nox2表达

为了研究HIF-1是否是IH诱导的Nox2表达所必需的，首先采用了药理学方法。地高辛和其他心脏苷已被证明抑制HIF-1α蛋白合成(Zhang等人，2008年b). 因此，我们检测了地高辛对IH中HIF-1激活、Nox2 mRNA表达和Nox酶活性的影响60-暴露的PC12细胞。IH公司60HIF-1α积累增加和地高辛以浓度依赖的方式阻止了这种反应(图2A). 为了证明地高辛对HIF-1转录活性的影响，用报告基因p2.1转染PC12细胞，其中萤火虫荧光素酶的表达由SV40启动子上游的HIF-1依赖性HRE驱动(Semenza等人，1996年). 我们以前曾报道，在PC12细胞中，HRE依赖性转录活性的诱导需要120个IH周期(袁等，2005). 如所示图2B地高辛抑制HIF-1介导的HIF-1报告基因对IH的转录激活。最后，地高辛在阻断HIF-1激活的相同浓度下显著减弱了IH诱导的Nox2 mRNA表达(图2C)和氮氧化物酶活性(图2D).

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地高辛阻断IH对HIF-1的激活和Nox2的上调。A： 地高辛抑制IH60-以浓度依赖性方式诱发HIF-1α积聚。顶部零件，代表性HIF-1α免疫印迹。底部零件HIF-1α蛋白水平的密度分析归一化为微管蛋白水平，并表示为与常氧对照组相比的百分比变化（N）。B： 地高辛通过IH抑制HIF-1依赖性报告基因的表达。将含有SV40启动子和荧光素酶编码序列上游HRE的p2.1和含有RSV启动子和β-gal编码序列的pRSV-LacZ与PC12细胞共转染。将转染的细胞暴露于20%O2（N） 或120次IH循环（IH 120）。C、 D：地高辛抑制对IH反应中Nox2 mRNA表达（C）和Nox酶活性（D）的上调。显示平均值±SEM（n=3-5）**P（P）与对照组相比<0.01（N）。

为了进一步证明药理方法的有效性，我们将PC12细胞暴露于YC-1，YC-1是一种结构独特的HIF-1抑制剂，可诱导HIF-1α的降解(Yeo等人，2003年). 与地高辛一样，YC-1阻断了IH诱导的HIF-1α积累(图3A)和HIF-1转录活性(图3B). YC-1还显著减弱了Nox2 mRNA表达的诱导(图3C)和氮氧化物酶活性(图3D).

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YC-1抑制接触IH的PC12细胞中HIF-1激活和Nox2上调。A： YC-1区块IH60-以浓度依赖性方式诱发HIF-1α积聚。顶部零件，代表性的HIF-1α免疫印迹。底部零件HIF-1α蛋白水平的密度分析归一化为微管蛋白水平，并表示为与常氧对照组相比的百分比变化（N）。B： YC-1抑制HIF-1依赖性报告基因表达以应对IH。C、 D:YC-1阻断IH上调Nox2 mRNA表达（C）和Nox酶活性（D）。显示平均值±SEM（n=3-5）**P（P）与对照组相比<0.01（N）。

HIF-1α基因消融阻断IH诱导Nox2表达

利用siRNA的表达进一步确定HIF-1在IH上调Nox2中的作用。用靶向HIF-1α的siRNA转染PC12细胞，然后暴露于IH60在转染HIF-1αsiRNA的细胞中，未发现IH诱导的HIF-1βmRNA、HIF-1蛋白和HIF-1转录活性的增加(图4A-C). 在HIF-1αsiRNA转染的细胞中，IH-voked诱导的Nox2 mRNA表达和酶活性显著降低，但在用打乱siRNA处理的对照细胞中没有显著降低(图4D，E).

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siRNA沉默HIF-1α可消除IH暴露细胞中的Nox2上调。A–C：转染HIF-1αsiRNA的IH暴露PC12细胞中没有HIF-1βmRNA上调（A）、蛋白积累（B）和HRE报告基因表达（C）。细胞转染HIFα或对照扰民（Scr）siRNA，然后暴露于IH。上部零件在B中，HIF-1α和微管蛋白免疫印迹的代表性示例。下部在B中，HIF-1α蛋白的密度分析标准化为微管蛋白表达，并分别以常氧对照的百分比表示。D、 E:IH公司60-在用HIF-1α转染的细胞中，诱导的Nox2 mRNA表达上调（D）和Nox2活性上调（E）显著减弱，但用Scr、siRNA转染的细胞没有减弱。显示了平均值±SEM（n=5）**P（P）与对照组相比<0.01（N）。

为了确定是否在其他细胞类型中观察到IH的影响，用HIF-1α缺陷（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行实验；Feldser等人，1999年). 与WT MEF相比，KO MEF的基础HIF-1依赖性报告活性显著降低(P（P）< 0.01; n=5）和IH120WT中HIF-1依赖性转录活性增加，但KO、MEF中没有(图5A). 与WT MEF相比，KO中基础Nox2 mRNA的表达显著减少(P（P）< 0.01; n=5）。与PC12细胞一样，WT MEF对IH的反应是Nox2 mRNA、蛋白质和酶活性增加，而KO MEF中没有这些反应(图5B–D). 因此，针对HIF-1α在两种不同细胞类型中失去功能的两种不同药物抑制剂和两种不同的遗传策略表明，HIF-1激活是诱导Nox2表达和活性以响应IH所必需的。

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暴露于IH的HIF-1α缺陷小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中无Nox2激活。A： IH激活HRE报告基因表达120在野生型（WT）MEF中，HIF-1α基因敲除（KO）MEFs中没有这种反应。B–D：无IH60-诱导KO MEF中Nox2 mRNA（B）和蛋白（C）表达及酶活性（D）上调。显示平均值±SEM（n=5）**P（P）< 0.01; #P（P）< 0.05; 和N.S.，不显著(P（P）>0.05）。

HIF-1α增加上调Nox2表达和活性

为了进一步建立HIF-1α和Nox2表达与活性之间的联系，我们检测了增加HIF-1β表达（功能增强）的效果。为此，用铁螯合剂去铁胺（DFO；1 mM）处理PC12细胞20小时或转染HIF-1α表达载体。用DFO处理的细胞HIF-1α蛋白水平和HRE活性显著增加(图6A、B). HIF-1激活增加与Nox2 mRNA表达和Nox2酶活性显著增加相关(图6C、D). HIF-1α过度表达后在PC12中也获得了类似的结果(图6E、H). 综上所述图2–6证明增加HIF-1α水平对于增加IH细胞中Nox2的表达是必要的，并且足以增加HIF-α表达载体转染细胞中的Nox2。

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HIF-1α过度表达增加Nox2的表达和活性。A： 去甲氧胺（1mM；DFO）处理20小时可增加PC12细胞中HIF-1α的积累。顶部零件，代表性的HIF-1α免疫印迹。底部零件HIF-1α蛋白水平的密度分析归一化为微管蛋白水平，并表示为与对照组相比的百分比变化（C）。B–D:DFO增加HIF-1依赖性基因表达（B）Nox2 mRNA表达（C）和Nox酶活性（D）。E： 用1µg碱性载体（pBS）或HIF-1α质粒（HA）转染PC12细胞三-HIF-1α）。顶部零件，代表性HIF-1α免疫印迹。底部零件HIF-1α蛋白水平归一化为微管蛋白水平的密度分析。F–H：HIF-1α过度表达增加HIF-1依赖基因表达（F）、Nox2 mRNA表达（G）和Nox酶活性（H）。显示平均值±SEM（n=4）**P（P）与对照组（C）或pBS相比<0.01。

IH对WT和WT中Nox2表达的影响Hif1a型+/−老鼠

先前的研究表明，IH暴露的WT大脑皮层ROS增加，但没有Hif1a型+/−老鼠(Peng等人，2006年). 因此，我们将小鼠暴露于IH 10天，并分析了Nox2在中枢神经系统和颈动脉体不同区域的表达。IH增加了WT小鼠大脑皮层和脑干中的Nox2 mRNA、Nox2蛋白、Nox酶活性和HIF-1α蛋白，但对小脑没有影响(图7A–C). IH还增加了颈动脉体中的Nox2 mRNA水平(图7A). 由于组织数量有限（湿重25µg），颈动脉体中未测定Nox2蛋白和酶活性。腹腔注射地高辛（1 mg/kg/天）可阻断IH对WT小鼠HIF-1α蛋白和Nox2 mRNA、蛋白和酶活性的影响(图7A–C). 在IH-暴露中Hif1a型+/−小鼠未观察到HIF-1α蛋白积累增加和Nox2表达上调(图7A–C).

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IH对大鼠中枢神经系统和颈动脉体中Nox2表达的影响Hif1型α+/+野生型（WT）和Hif1型α+/−杂合敲除小鼠。A–C：年龄和性别匹配的WT小鼠暴露于常氧（N）或IH（8小时/天×10天），并同时给予溶媒（IH）Origoxin（IH+D；1毫克/千克/天IP）和同窝鼠Hif1型α+/−小鼠暴露于Nor IH。分析大脑皮层、脑干和小脑中的Nox2 mRNA（A）、HIF-1α和Nox2蛋白（B）以及Nox酶活性（C）。在相同的小鼠中测定颈动脉体中的Nox2 mRNA水平（A）。显示平均值±SEM（每组5只小鼠）**P（P）<0.01和N.S.，不显著(P（P）>0.05）。

我们以前报道过ROS依赖性磷酸化和PLCγ、PKC和mTOR的激活对HIF-1α在接触IH的PC12细胞中的积累至关重要(袁等，2008). 如所示图8IH增加了IH暴露小鼠大脑皮层和脑干中的磷酸-PLCγ、磷酸-PKC和磷酸-mTOR水平，但不增加小脑中的磷酸-mTOR水平。这些结果与IH暴露小鼠小脑中缺乏IH诱导的HIF-1α蛋白和IH诱导Nox2 mRNA、蛋白和酶活性一致(图7). 由于存在前馈机制，尚不清楚IH诱导的小脑ROS→PLCγ/PKC/mTOR→HIF-1→NOX2→ROS通路在什么时候被阻断。然而，HIF-1α和Nox2在大脑不同区域和WT与Hif1a型+/−小鼠强烈支持HIF-1在IH反应中激活Nox2表达的关键作用。

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IH对小鼠大脑皮层、脑干和小脑中磷酸化PLCγ、PKC和mTOR水平的影响。成年雄性BALB/c小鼠暴露于常氧（N）或IH（8小时/天×10天）。通过对大脑皮层、脑干和小脑的组织裂解物进行免疫印迹分析，测定磷酸-PLCγ（p-PLCγ）、总PLCγ（PLCγ），磷酸-PKC（p-PKC）、总PKC（PKC），磷酸化mTOR（p-mTOR）和总mTOR的水平。

讨论

我们以前曾报道过（i）IH增加颈动脉体和中枢神经系统中的氧化应激和HIF-1α表达，（ii）用自由基清除剂治疗可阻断IH诱导的HIF-1β表达、高血压和对缺氧的增强通气反应。这些结果表明，导致HIF-1激活的IH诱导的ROS是颈动脉体反应所必需的，颈动脉体的反应导致心血管和呼吸生理学的改变，即HIF-1作用于ROS下游。我们随后描述了IH诱导的ROS导致PC12细胞HIF-1激活的PLCγ/PKC/mTOR信号转导途径(Yuan等人，2005年,2008). 然而，我们还发现IH增加了大脑皮层的氧化应激并诱发了WT的高血压，但没有Hif1a型+/−，只老鼠(Peng等人，2006年)这表明HIF-1作用于ROS生产的上游。这些发现表明ROS诱导HIF-1的前馈机制，导致ROS生成和下游致病性后遗症进一步增加。IH诱导PC12细胞中Nox2 mRNA、蛋白表达和酶活性(袁等，2008)啮齿动物的颈动脉体，以及否2−/−小鼠对IH的颈动脉体反应不足(Peng等人，2009年). 在本研究中，使用遗传和药理学方法来影响HIF-1α功能的丧失或获得，我们证明HIF-1介导增加Nox2表达以响应IH，从而为IH中ROS和HIF-1之间的前馈关系提供了分子机制。需要进行额外的研究来确定HIF-1是否直接与否2基因并激活其转录以响应IH。

综上所述，本研究的结果和之前发表的工作(Peng等人，2006年)证明HIF-1α通过增加Nox活性在IH的形成中发挥促氧化作用。相反，HIF-2α通过介导Sod2的表达发挥抗氧化作用，HIF-2α水平下降是对IH的反应(Nanduri等人，2009年). 因此，HIF-1α依赖性Nox2表达增加和HIF-2α依赖性Sod2表达减少的联合作用是导致IH反应中观察到的ROS水平急剧增加的原因。HIF-1在IH的适应不良（病理）环境中的促氧化作用也与HIF-1在持续缺氧的适应（生理）反应中的抗氧化作用形成对比，其中HIF-1介导调节或减少线粒体呼吸和ROS产生的多种途径的表达(Kim等人，2006年;福田等人，2007年;Zhang等人，2008a;Chan等人，2009年;Chen等人，2010年;Favaro等人，2010年).

在本研究中，我们还发现IH在大脑皮层和脑干中诱导ROS和HIF-1α，但在小脑中不诱导。从这些数据中可以得出两个重要结论。首先，除外周神经系统（即颈动脉体）外，HIF-1α→Nox2→ROS通路也可能介导中枢神经系统对IH的反应。其次，HIF-1α→Nox2→ROS通路的激活似乎在中枢神经系统中具有解剖学选择性。IH导致小脑HIF-1激活缺失与PLCγ、PKC和mTOR（HIF-1上游激活物）磷酸化缺失以及Nox2表达缺失（下游HIF-1靶基因）有关。阐明组织特异性HIF-1激活和Nox2表达对IH的反应的分子基础和功能后果是未来研究的重要目标。最后，正如除颈动脉体外，中枢神经系统中HIF-1的激活可能在介导IH相关的自主神经疾病中发挥关键作用一样，除此之外，其他HIF-1靶基因否2也可能作为下游效应器参与。需要进一步的研究来验证HIF-1不仅在IH自主反应的启动中，而且在系统整合中发挥中心作用的假设。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院、心肺血液研究所HL-90554、HL-76537、HL-86493、HL-089616（N.R.P.）的资助，以及约翰斯·霍普金斯细胞工程研究所的资助。G.L.S.是约翰斯·霍普金斯大学医学院的C.Michael Armstrong教授。

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