肠神经胶质表达蛋白脂质蛋白1，是哺乳动物神经系统中一个转录上独特的胶质细胞群体

免疫细胞化学

对于免疫染色冰冻切片，肠段固定在4°C的4%PFA/PBS中2h，在4°C的30%蔗糖/PBS中平衡过夜，并嵌入OCT中。获得14μm切片，在封闭溶液中培养1h（PBS+0.1%Triton+1%热灭活山羊血清[HINGS]）然后在4°C下在封闭溶液中稀释的一级抗体中过夜。用PBS冲洗玻片3次，在室温（RT）下用1:500稀释的二级抗体培养1h，用PBS洗涤3次，然后装在含有DAPI的Vectashide中（Vector Labs H-1200）。为了进行整体免疫染色，将肠段解剖，修剪成1.5厘米的圆柱体，沿着肠系膜边界打开，平钉在Sylgard板上，并在4°C下用4%PFA/PBS固定75分钟。样品在PBS中漂洗两次，并按照Li等人（2011年）描述的改良方案进行处理。将样品解开，用PBST（PBS+0.5%Triton）洗涤6×20min，在室温下用封闭溶液稀释的一级抗体（PBST+20%DMSO+5%HINGS）孵育48–72小时，用PBST/6×20min洗涤，室温下用二级抗体孵育24小时，用PBST洗涤6×20分钟，通过分级甲醇系列，用1:1甲醇平衡：BABB溶液[BABB=1份苯甲醇到2份苯甲酸苄酯]2小时，然后在BABB中培养过夜以进行光学清除图1,​,22和​和44表示内源性GFP荧光。使用的主要抗体：大鼠抗PLP1 1:500（W.Macklin赠送）、兔抗S100β1:500（DAKO Z0311）、兔抗体GFAP 1:1000（Sigma G9269）、鸡抗GFAP 1:100（Millipore AB5541）、山羊抗Sox10 1:50（Santa Cruz sc-17342）、鸡抗体GFP 1:1000（Aves GFP-1020）、兔对抗GFP 1:100（Invitrogen A11122）、，和兔抗DsRed 1:500（Clontech 632496）。所使用的二级抗体是在山羊或驴子（Invitrogen）中产生的Alexa Fluor 594、568或488缀合物。

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图1

PLP1在小鼠肠道中表达，并与在PLP1启动子控制下表达的eGFP共定位

（A，D）在P28来自PLP1 eGFP转基因小鼠的肠横截面中的PLP1蛋白的免疫染色。

（B，E）eGFP荧光和蓝色DAPI核染色。

（C，F）合并图像。方框区域在相应图像下方以较高的放大倍数显示。

比例尺表示50μm（面板A–F）或20μm（板A′–F′）。

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图2

PLP1和S100β在成年小鼠肠道中共同表达

PLP1-eGFP转基因小鼠肠道中P56处的（A，D，G）eGFP荧光，DAPI核染色为蓝色。

（B，E，H）S100β免疫染色

（C、F、I）合并图像。在相应图像下方高倍放大显示的方框区域显示，大多数表达PLP1的胶质细胞共同表达S100β，但存在罕见的GFP⁺S100β细胞⁻(*). 比例尺表示50μm（面板A–I）或14μm（板G′–I′）。

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图4

GFAP在PLP1表达细胞的子集中表达

PLP1-eGFP转基因小鼠P56处的（A，D，G）eGFP荧光，DAPI核染色为蓝色。

（B，E，H）GFAP免疫染色

（C、F、I）合并图像。在相应图像下方以较高放大倍数显示的方框区域显示，环形肌中许多节外型表达PLP1的胶质细胞表现出低（*）或无可检测（箭头）的GFAP免疫反应性。比例尺表示50μm（面板A–I）或14μm（板G′–I′）。

成像和量化

在LSM710或尼康A1R共焦显微镜上获得除以下图像外的所有图像的冰冻切片和整体支架的单平面图像补充图1和2（体素大小0.31–0.50μm×0.31–0.5μm×1μm，分辨率2–3像素/μm）。中的图像补充图1和2表示16μm堆栈的最大强度投影（体素大小0.31μm×0.31μm×2μm，分辨率3.2像素/μm）。使用ImageJ软件分解成各个通道(Schneider等人，2012年). Plp1的量化⁺，S100β⁺和GFAP⁺使用CellProfiler对冷冻切片中的细胞进行分析(Carpenter等人，2006年)然后进行手动分析。从3只对S100β或GFAP进行免疫染色的PLP1-eGFP小鼠（每个肠段中每个标记物至少分析1200个细胞）的每一个肠段（十二指肠、回肠和结肠）获得10个区域的图像。所有阈值均使用Otsu Global方法和两级阈值计算，使用强度区分具有以下标准的对象：DAPI⁺细胞核（阈值校正因子4，直径6–40像素单位），S100β⁺单元格（阈值校正因子10，直径14–100像素单位），Plp1⁺单元格（阈值校正因子7，直径14–100像素单位）和GFAP⁺单元（阈值校正因子14，直径14–100像素单位）。对于每张图像，使用核染色手动勾画出肌间神经节、肌肉层（纵肌和环肌）和非肌肉层的轮廓，并进一步筛选CellProfiler识别的细胞，以消除组织区域外的细胞（即肠腔内的细胞）或者没有相关的细胞核。Plp1的细胞数⁺/GFAP公司⁺，第1页⁺/S100β⁺，仅Plp1⁺，仅S100β⁺而且只有GFAP⁺然后对每层细胞进行定量，并计算每只动物每类细胞的百分比。然后通过非配对t检验比较每个肠段的S100β和GFAP百分比。使用ImageJ Cell Counter宏对Sox10-PLP1共定位进行量化，以分析每个肠段（n=4只动物）6张图像中的300μm×300μm感兴趣区域。

肠神经胶质细胞的分离及RNA序列测定

从P20和P27之间的PLP1-eGFP小鼠上切下4cm的回肠和结肠段，切成1mm的片段，然后在37°C的消化培养基（1X HEPES、胶原酶A 1mg/mL、Dispase II 2.9mg/mL）中培养1h。研磨后，样品在600g下旋转8分钟，并在37°C的0.25%胰蛋白酶EDTA中培养5分钟。添加FBS，将细胞在600g下旋转8分钟，再悬浮在HBSS中，用一系列火焰抛光吸管研磨，然后通过70μm细胞过滤器过滤。再次旋转细胞，并用碘化丙锭（1μg/ml）将其重新悬浮在HBSS中。在BD-Aria流式分选机上进行FACS，并在Trizol中收集细胞。用于收集的闸门如图所示补充图2将细胞在Trizol中均质，将来自3只动物的裂解物分别混合在4个样品（回肠GFP+和−、结肠GFP+与−）中，然后使用Qiagen RNEasy Micro试剂盒纯化总RNA。生物分析仪PicoChip对RNA质量的测量显示RIN>8.0。然后使用Total RNA-Seq IntegenX-Low Input试剂盒对总RNA（10ng）进行逆转录以构建文库。每个样本中的一微克DNA被剪切生成文库，然后由Illumina HiSeq 2000测序，以获得100bp的配对读码。

RNA测序数据的绘制与分析

4个样本中的每个样本都获得了大约8000万到1亿个100bp的读取，并使用Bowtie和Tophat映射到小鼠基因组(Trapnell等人，2012年). 线粒体核糖体和核核糖体占总读取量的52-79%。未映射的读取占4-9%，主要由可能对应于3′mRNA的长polyA和polyT延伸组成。在其余读取中，约60%是在注释基因内唯一映射的。假设mRNA丰度为5×10⁵每个细胞的总mRNAs（Galau等人，1977年），该测序深度对应于每个细胞表达1拷贝mRNA的平均10-20个映射片段。为了防止线粒体过度表达导致的偏倚，我们采用了两阶段绘图策略。首先使用Bowtie2将读数映射到包含线粒体染色体和核核糖体序列的“污染文库”（Langmead和Salzberg，2012）。如果在映射到污染库的一对中读取任何一个，则这两个读取都将被排除在进一步分析之外。然后将这个“修剪”的库（包含1800万到4000万个读取，占总读取数的20–50%）与小M使用TopHat2的基因组（UCSC版本mm10）(Trapnell等人，2012年). 在映射到基因组的其余部分之前，将读数与带注释的转录本对齐（选项-G）。接下来，使用CuffLinks将映射的读数汇编成成绩单(Trapnell等人，2012年)使用带注释的鼠标转录组指导组装。使用CuffLinks中的上四分位归一化、片段偏差校正和多读校正选项校正了转录物丰度估计值。最后，用Cuffdiff测试差异表达(Trapnell等人，2012年)，治疗GFP⁺和GFP⁻回肠和结肠样本作为生物复制品。<10个比对的位点被排除在假设检验之外。

定量PCR（qPCR）

为了进行qPCR验证，从如上所述的PLP1-eGFP动物中获取RNA（每组由1只动物的FACS分类细胞生成，用于n=3个生物复制），用iScript（BioRad）进行反向转录，然后在7500快速实时PCR系统（Applied Biosystems）上用SYBR Green Select（AppliedBiosystes）作为qPCR的模板。使用标准7500快速方案，然后进行热变性步骤。所有反应重复进行，GAPDH平行运行。使用7500 Fast System SDS软件2.0.6版（Applied Biosystems）对数据进行分析，并在实验之间对每个基因的阈值进行标准化。所有引物对阳性对照cDNA的扩增效率均≥97%，PCR产物经测序证实。组织（结肠与回肠）对5个测试基因的影响不显著（p=0.7，双向方差分析，不包括未检测到信号的样本），因此将结果汇总用于GFP的比较⁺至GFP⁻GFP表达差异的.P值⁺和GFP⁻样本采用Mann-Whitney U检验进行估计，并使用Holm的方法对多个假设进行校正。

肠神经胶质细胞的转录谱分析

肠神经胶质细胞来源于神经嵴；然而，它们与肠神经元的关系以及它们在充满多种细胞类型（如纤维细胞、巨噬细胞、平滑肌、淋巴细胞、肠细胞和肠内分泌细胞）的环境中的位置，使得它们在哺乳动物PNS和CNS的胶质细胞中是独一无二的(Bohorquez等人，2014年;Liu等人，2013年). 为了深入了解胃肠道胶质细胞的功能，我们测定了PLP1的转录谱⁺细胞通过RNA-Seq。我们专注于急性分离的GFP⁺P21-P28岁PLP1-eGFP小鼠回肠和结肠的胶质细胞。由于胃肠上皮在断奶前后发生重大变化(亨宁1981)，我们推断，这个年龄的肠胶质细胞可能会上调对其在成熟ENS中的功能至关重要的基因。之所以选择回肠和结肠，是因为它们是胃肠道的物理邻近部分，具有不同的功能、微生物群和上皮表面。开发了一种从小鼠肠段制备单细胞悬浮液的方案，并对其进行了优化，以通过台盼蓝排除法实现至少75%的细胞存活率。GFP公司⁺然后通过荧光激活细胞分选（FACS；补充图4)占回肠活细胞的0.8%，结肠活细胞的2%。RT-PCR显示S100β的表达仅限于GFP⁺细胞，表明肠神经胶质细胞已从GFP中成功清除⁻样品(图7A). 相反，绒毛蛋白1是肠上皮细胞唯一表达的基因(el-Marjou等人，2004年)在两个样本中都检测到(图7A). 因为这表明上皮细胞并没有从GFP中完全清除⁺制备后，我们分析了两种GFP中的基因表达⁺和GFP⁻细胞以识别富含GFP的转录物⁺肠神经胶质。从GFP中获得的总RNA⁺和GFP⁻对PLP1-eGFP动物回肠和结肠细胞进行测序，并评估转录物的差异表达。GFP公司⁺结肠和回肠样本作为生物复制品处理，并与GFP进行比较⁻样本，这代表了一种保守的策略，应该强调肠神经胶质细胞中选择性表达的基因。

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图7

来自PLP1的RNA⁺从出生后肠道分离的细胞富含肠道神经胶质标记基因

（A） 用于RNA序列分析的FACS分选细胞提取RNA的RT-PCR显示，GFP中S100βmRNA富集，但Villin1不富集⁺分数。

（B） GFP RNA序列数据中细胞类型特异性基因表达的相对差异⁺与GFP相比⁻样品。在基因表达非常弱的情况下，为了避免数值不稳定（除以0），在计算折叠富集度之前，将0.01的假计数添加到所有测量的FPKM中。一般来说，这将减少估计的褶皱变化，从而提供更保守的值。

为了验证我们的RNA-Seq结果，我们检查了几种肠细胞类型的已建立标记基因的测量表达。肠神经胶质基因S100β、Gfap、Plp1和Sox10在GFP中高度富集⁺样本中，上皮细胞、平滑肌和内皮细胞的标记物均已耗尽(图7B). 尽管我们的GFP中怀疑存在一些上皮细胞⁺样本中，我们的比较分析策略成功地将胶质基因与上皮基因区分开来。肠神经胶质细胞不表达的一部分神经元基因在GFP中有所富集⁺样品(图7B)这表明这个样本中含有一些神经元。无论如何，胶质细胞基因的富集水平至少是GFP中神经元基因的20倍⁺样本；因此，一些神经元的存在不太可能干扰进一步的分析，而进一步的分析侧重于最差异表达的基因。

我们确定了292个GFP差异表达基因⁺和GFP⁻样本的错误发现率（FDR）截止值为0.1。表1列出了富含PLP1的前25个基因⁺肠中的细胞，其中包括以前报道的对肠神经胶质发育重要的几个基因，如Sox10和Foxd3(Laranjeira等人，2011年;蒙代尔等人，2012年). 为了进一步验证我们的RNA-Seq结果，我们选择了5个基因进行额外分析。已知肠神经胶质细胞表达其中2个基因，Sox10和Entpd2(Braun等人，2004年;Lavoie等人，2011年)3个基因（Gjc3、Sema3E和Kcna1）之前未进行过测试。GFP 3个生物复制品的定量RT-PCR（qPCR）⁺和GFP⁻细胞显示5个基因中有4个在GFP中检测不到⁻细胞和富含GFP⁺细胞，验证我们的分离技术和RNA-Seq结果(图8A–B). 这5个基因中只有一个在GFP中检测到⁻细胞Entpd2在GFP中的表达增加了27倍⁺单元格(图8B). 与此相一致，Entpd2免疫反应主要在小鼠肠道的胶质细胞中发现，但也在靠近隐窝和浆膜的少数非胶质细胞中观察到(图8C-E). 值得注意的是，Entpd2由许多但不是所有的PLP1表达⁺胶质细胞。与GFAP类似，在许多节外肌内胶质细胞中未检测到Entpd2(图8C-E). 总之，这些发现表明肠道PLP1的RNA-Seq图谱⁺细胞识别了所有肠神经胶质细胞表达的基因以及一些仅通过亚群表达的基因，并支持将该数据集用作肠神经胶质中基因表达的有效资源。

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图8

RNA-Seq鉴定富含肠神经胶质的基因

（A–B）根据RNA-Seq定量RT-PCR验证富含肠神经胶质的基因。（A） qPCR数据的代表性RT-PCR（B）条形图琼脂糖凝胶电泳显示，相对于Gapdh（n=6），每个基因表达水平的中位数绝对偏差为+/-1.48倍；*=p<0.05，Mann-Whitney U检验）。

（C） 第21页PLP1-eGFP小鼠结肠的Entpd2免疫染色。高倍镜下紧邻各图像下方的方框区域显示，肌层中神经节内表达PLP1的胶质细胞表现出较强的Entpd2免疫反应性，而神经节外胶质细胞则较暗（*表示非胶质细胞表达Entpd2）。比例尺表示50μm（面板C–E）或11μm（板C′–E′）。

“髓鞘基因”在非髓鞘性胶质细胞中的表达

我们数据中的一个观察结果是，PLP1在肠神经胶质细胞中广泛表达。利用这种表达，我们利用PLP1-eGFP转基因小鼠从小鼠肠道分离PLP1-e表达细胞并进行RNA-seq。结果的转录谱显示，肠神经胶质细胞不仅表达PLP1，还表达许多其他对致密和非致密髓鞘形成重要的基因，包括髓鞘碱性蛋白（MBP）、髓鞘蛋白零（MPZ）、2′，3′-环核苷酸3′磷酸二酯酶（CNP）和Sox10。在过去的50年里，许多超微结构研究已经仔细研究了啮齿动物ENS中神经元和胶质细胞之间的关系，并且没有发现小肠或大肠中有髓鞘形成的证据(库克和伯恩斯托克1976;加贝拉1971;加贝拉1972;Wilson等人，1981年). 因此，尚不清楚为什么肠神经胶质细胞表达这些特殊基因。髓鞘基因在成熟的非髓鞘性胶质细胞中的表达在神经系统中并不是前所未有的。例如，PLP1启动子在突触周围雪旺细胞和内耳支持细胞亚群中也很活跃，两者都不形成髓磷脂(Duregotti等人，2015年;Gomez-Casati等人，2010年;Morris等人，2006年). 然而，这些分子在髓磷脂外所起的作用尚不清楚。

我们发现，不仅PLP1启动子在肠神经胶质细胞中转录活跃，而且PLP1蛋白在这些细胞中广泛检测到(图1). PLP1是一种极疏水的完整膜蛋白，与髓磷脂碱性蛋白（MBP）一起，占中枢神经系统髓磷脂中蛋白质的50%以上(德伯和雷诺兹1991). 类似地，髓鞘蛋白零（MPZ；P0）和MBP一起构成PNS髓鞘中高达65%的蛋白质(Garbay等人，2000年). 为什么肠道中的非髓鞘性胶质细胞表达经典髓鞘蛋白？一种可能性是髓鞘蛋白可能在胶质细胞中发挥的不仅仅是结构作用。对培养的少突胶质细胞的研究表明，PLP1可以改变其他髓鞘基因的表达并抑制少突胶质前体细胞的分化(Karim等人，2007年;宫本茂等人，2012年). 同样，MBP被越来越多地认为是一种多功能分子，具有作为支架蛋白的潜在作用(Harauz和Boggs 2013年). 虽然肠神经胶质不形成髓磷脂，但PLP1和MBP等蛋白质对于组织将特定分子聚集在一起的信号微域可能很重要。蛋白质组学研究评估肠神经胶质内这些经典髓鞘蛋白的相互作用伙伴，可以为这些蛋白的信号传递和其他功能提供新的见解。

本研究得到了NIDDK（M.R.，F32DK098903）、NASPGHAN青年研究者奖（M.R）、NINDS（G.C.，R01 NS35884）、发展残疾研究中心（DDRC）国家卫生研究院拨款（G.C.、P30-HD18655）、NSF研究生奖学金（B.D.N.）、Milton基金（G.C.）的试点拨款、，以及波士顿儿童医院和哥伦比亚大学医学中心儿科胃肠病学、肝病学和营养科的研究支持。我们感谢W.Macklin提供的PLP1抗体；N.Francis和E.Lamousé-Smith，协助FACS分析；A.Chalazonitis和L.Waldron对手稿进行了批判性阅读，以及波士顿儿童医院的DDRC成像和FACS核心设施。