全身性ADH-1联合Melfalan经隔离肢体输注治疗晚期肢体黑色素瘤的前瞻性多中心II期试验

研究设计

该试验是一项开放性、单臂、多中心II期研究。治疗包括第1天和第8天静脉注射4000 mg ADH-1，并在第1天ADH-1后至少4小时通过ILI局部注射10 mg/L的马法兰（对于上肢），以及针对IBW矫正的下肢注射7.5 mg/L的马法兰（对于下肢）。¹⁶此前已证明4000-mg剂量的ADH-1对患者是安全的，并且是已有广泛安全数据的最高剂量。^29,31ILI的给药如前所述¹⁶在肢体被加热至至少37.0°C后，在动脉导管中快速滴注马法兰（2至5分钟）。

肿瘤反应和毒性评估

在ILI后3个月的一个时间点，根据针对皮肤病变修改的实体瘤反应评估标准（RECIST）评估肿瘤反应。¹⁶患者分为CR、部分缓解（PR）、稳定疾病（SD）或进展疾病（PD）。使用美国国家癌症研究所（National Cancer Institute）的《不良事件通用毒性标准3.0版》（CTCAEv3）评估毒性。

药代动力学评价

使用高效液相色谱法测量马法兰输液回路的浓度，并在给药前测量ADH-1的浓度。^16,32

免疫组织化学

生物技术公司（北卡罗来纳州希尔斯堡）进行了N-cadherin IHC染色和评分。从石蜡块中包埋的肿瘤样本中处理切片进行IHC染色。载玻片与第一抗体（Invitrogen 18-0224，Carlsbad，CA；1:200稀释）或小鼠同种型阴性对照（Invitrogen 08-6599；Invitrogen）在4°C下孵育过夜，然后与第二抗体（生物素化山羊抗小鼠；Jackson Immunoresearch Laboratories 115-066-071，West Grove，PA；1:500稀释）孵育在室温下保持30分钟。ABC试剂（Vectastain Elite ABC Kit，Vector Labs，加利福尼亚州伯林盖姆）用于切片，并在37°C下培养30分钟。切片在二氨基联苯胺中在室温下显影7分钟，并用苏木精复染。

定量聚合酶链反应

使用Lysing Matrix A（MP Biomedicals，Solon，OH）和迷你bead-beater（Biospec Products，Bartlesville，OK）对肿瘤活检进行均质。如前所述，分离RNA，合成cDNA，并进行定量聚合酶链反应（qPCR）。³³N-cadherin表达值归一化为β-肌动蛋白，并表示为人类参考RNA样本的倍差（Stratagene，La Jolla，CA）。参考RNA的值为1；患者样本值<1被认为是阴性，而患者样本值≥1被认为是N-钙粘蛋白阳性。

微阵列基因表达分析

在杜克大学微阵列核心设施，RNA被逆转录、标记并杂交到Affymetrix人类基因组U133plus2（HU133+2）基因芯片（Affymetix，Santa Clara，CA）。肿瘤样本的基因表达数据可在Gene expression Omnibus（登录号{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE22968”，“term_id”：“22968”}}GSE22968标准). 基因表达数据通过使用Affymetrix expression Console软件（v1.0；Affymentrix）使用MAS5.0算法进行标准化，通过使用MATLAB log2函数（Mathworks，Natick，MA）转换log2，并使用贝叶斯因子回归模型针对69个Affymetix管家基因探针进行标准化。³⁴通过贝叶斯因子回归建模进行Pearson相关性分析，归一化匹配患者数据（ADH-1前和ADH-1后；20个样本，10名患者），得出Pearson相关系数第页.根据第页筛选出绝对相关系数小于0.6的基因，得到100个基因的列表。数据以基因和阵列为中心，采用无监督的层次聚类法进行聚类（Cluster v3.0，^第34页无中心相关相似性度量和平均连锁聚类）；生成了热图图（Java TreeView；加利福尼亚州斯坦福大学医学院）。³⁵

临床反应

在本研究的45名患者中，9%（n=4）的患者没有反应，38%（n=17）有CR，22%（n=10）有PR，13%（n=6）有SD，18%（n=8）有PD。CR率的90%CI（38%）为0.26至0.51。17名CR患者的估计中位反应持续时间为5个月（95%可信区间为3.0至不可估计）。到本次分析时，这些患者中有12例在现场取得进展；五名没有进展的患者中位随访时间为22个月。所有41名可评估患者的TTP-I中位数为4.6个月（95%可信区间为4.0-7.1个月）。到本次分析时，其中有31名患者在现场取得进展；10名没有进展的患者的中位随访时间接近20个月。所有45名患者的中位场外进展时间为10.2个月（95%可信区间为6.2-19.0个月）。到本次分析时，45名患者中有28名已经进展出视野；17例无进展患者的中位随访时间为19.4个月。75%（28例中的21例）的淋巴结转移。图2将本试验的有效率与M-ILI的多中心回顾性研究的有效率进行比较（n=66）。图3将本试验的TTP-I（中位数4.6个月）与杜克大学59名仅接受M-ILI的患者（中位数3.2个月）进行比较。¹⁶这些比较是探索性的，协议中没有具体说明。

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图2。

本试验中患者的反应（蓝色）与孤立肢体输液（ILI；gold）的回顾性多中心研究中的反应进行比较。CR，完全响应；PR，部分响应；SD，稳定疾病；PD，进展性疾病；不适用。

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图3。

本研究中患者的进展时间曲线（蓝色虚线）与在杜克大学接受单独肢体注射马法兰（M-ILI）治疗的患者进行比较（纯金线）。在本研究中，进展的中位数时间为4.6个月（95%可信区间为4.0至7.1个月），而在先前仅接受M-ILI的研究组中，进展时间的中位数为3.2个月（95%CI为3.1至9.9个月）。

毒性

该治疗通常耐受性良好，添加ADH-1似乎不会增加M-ILI单独的毒性。主要与ILI相关的常见1级毒性是15名患者（33%）出现皮疹/红斑，12名患者（27%）出现肢体疼痛。共有9种4级毒性：5名患者出现血清学4级毒性（4名患者肌酸激酶[CK]升高，1名患者中性粒细胞减少症缓解），4名患者出现临床4级毒性。CK值在区域化疗后常规测量，作为肌肉毒性的标志物。^16,17本研究中CK升高4级的4名患者接受地塞米松治疗，CK随后恢复正常。正如先前研究所预期的那样，经历3至4级毒性的患者比经历1至2级毒性的患者具有更高的CKs峰值，并且更有可能是女性。¹⁶

4级临床毒性为动脉损伤、急性呼吸窘迫综合征、肺炎和肺浸润。动脉损伤发生在ILI后24小时，为股浅动脉剥离，远端栓塞可能由动脉导管置入引起。患者接受了Fogarty血栓切除术和股浅动脉末端切除术。ILI后约1年，该患者因血管疾病进展而截肢。ILI和并发症是否加剧了这种情况尚不清楚。三种4级肺毒性均发生在同一患者身上。术后第二天，患者出现急性呼吸窘迫，需要重新插管24小时。支气管镜检查显示近端支气管粘膜发炎，有瘀点出血。尽管排除了误吸、肺栓塞、心力衰竭和细菌性肺炎，但该事件的病因尚未明确。患者在服用类固醇和抗生素后恢复，并于术后第10天出院。

N-卡德林

通过IHC和/或qPCR检测20名受试者的N-钙粘蛋白；其中20名患者（69%）的N-钙粘蛋白检测呈阳性。29名患者中的22名患者也进行了疗效评估。在这26名患者中，18名N-cadherin阳性患者的CR率为39%；8名阴性患者的CR率为63%。11例患者的肿瘤组织经qPCR检测N-cadherin的表达。10例患者的qPCR结果与IHC一致；在一名患者中，肿瘤组织中的N-钙粘蛋白经IHC检测为阴性，但经qPCR检测为阳性。

药物动力学

在杜克大学（n=24）接受治疗的患者中检测ADH-1的药代动力学。目的是在ADH-1初始剂量后给药约3-4个半衰期（6-8小时），以模拟临床前动物模型中使用的初始剂量，其中ADH-1预处理显著提高了M-ILI的疗效。^27,36ADH-1剂量与马法兰给药之间的中位数时间为7.7小时（范围为5至12小时）。一般来说，在服用马法兰之前测得的ADH-1血浆浓度较低，因为服用ADH-1后的时间较长(图4). ADH-1的中位血浆浓度为5818 ng/mL；当根据响应状态（CR/PR）计算时v（v）SD/PD），血浆中浓度相似。

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图4。

ADH-1剂量和通过隔离肢体输注（ILI；单位：小时）输送美拉法仑与ILI开始时测量的ADH-1血浆浓度（μg/mL）之间的时间曲线。正如预期的那样，所有患者的ADH-1浓度随着时间的推移而降低(第页=0.40）。蓝色方块代表完全缓解（CR）或部分缓解（PR）的患者；金钻代表患有进展性疾病（PD）或稳定性疾病（SD）的患者。

对28例患者进行了Melfalan药代动力学分析。melfalan的中位剂量为50.1 mg；ILI期间美拉法仑的中位峰值血浆浓度为25.8μg/mL。有无反应（CR+PR）的患者v（v）SD/PD）的马法兰剂量和峰值血浆浓度的中位数相似。同样，具有和不具有3至4级毒性的患者具有相似的中位数。正如预期的那样，ILI期间的马法兰峰值血浆浓度与马法兰给药剂量相关（皮尔逊相关系数0.58）。