的Hsp70和Hsp90大肠杆菌蛋白质重构中的直接相互作用

Hsp90水解ATP_Ec公司DnaK受到协同刺激

Hsp90的演示_Ec公司-DnaK-客户端复合物促使我们通过监测客户端蛋白L2对Hsp90联合作用下ATP水解的影响来检查该复合物的功能意义_Ec公司和DnaK。在没有L2的情况下，Hsp90混合物的水解速率_Ec公司DnaK仅略大于每个伴侣各自水解的总和，表明ATP水解可能存在协同刺激(图2A). 如前所示，Hsp90水解ATP_Ec公司L2单独刺激^5,16(图2B-2D)而DnaK的ATP水解不受影响(图2B-2D). 在1μM L2存在下，这对伴侣的水解速率比L2存在时每对伴侣分别水解的加成速率高约1.6倍(图2B-2D). 这些观察表明Hsp90之间的物理相互作用_Ec公司DnaK反映在两个伴侣在刺激ATP水解中的功能协作中。

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图2

热休克蛋白90_Ec公司和DnaK在ATP水解中起协同作用。(A类)用DnaK、Hsp90水解ATP_Ec公司或DnaK和Hsp90的组合_Ec公司7个重复的数据以平均值±SEM表示。单独使用DnaK和Hsp90水解的附加值_Ec公司单独显示为黑色阴影条，旨在帮助读者。(B类)Hsp90水解ATP_Ec公司、DnaK或Hsp90_Ec公司和DnaK在L2浓度增加的情况下。(C类)野生型或突变型Hsp90组合的ATP酶活性_Ec公司和DnaK，无论是否存在1μM L2。在指定位置添加凝胶霉素（30μM）。(D类)野生型或突变型DnaK和Hsp90组合的ATP酶活性_Ec公司无论L2是否存在。在A–D使用1μM野生型或突变DnaK、1μM野型或突变Hsp90测定ATP酶_Ec公司和1μM L2。在B–C类，来自3个或更多重复的数据以平均值±SEM表示C类和D类，虚线表示野生型Hsp90的附加ATP酶活性_Ec公司与L2和野生型DnaK与L2，旨在帮助眼睛。

确定Hsp90是否_Ec公司和DnaK协同作用，或者如果一个伴侣在L2存在下激活另一个伴侣的ATP酶，我们测试了ATP水解物缺陷型Hsp90_Ec公司和DnaK突变蛋白。Hsp90抑制了协同活性_Ec公司E34A公司²⁶被替换为野生型(图2C). 热休克蛋白90的特异性抑制剂——凝胶霉素³⁸也阻断了ATP酶活性的协同刺激(图2C). 此外，DnaK T199A不能用Hsp90刺激ATP酶活性_Ec公司在L2存在的情况下(图2D). 因此，Hsp90引起的ATP水解和/或相关的ATP依赖性构象变化_Ec公司和DnaK对于两位伴侣的合作活动至关重要。

与Hsp90相同_Ec公司-DnaK-L2复合物的形成，两种伴侣的客户端结合对于L2存在下的协同ATP酶刺激至关重要。当Hsp90的客户结合缺陷突变体时，ATP水解不受上述添加剂的刺激_Ec公司，W467R⁵或DnaK、V436F^35,36在用L2进行的ATP酶分析中，被替换为野生型(图2C和2D). 这些结果表明，这两种伴侣必须具有功能性客户结合位点才能协同ATP水解。与三元络合物形成相比，我们没有发现CbpA和GrpE在L2存在下对两个伴侣协同刺激ATP水解的作用(补充图S2A). DnaJ和GrpE轻微抑制DnaK和Hsp90对ATP水解的刺激_Ec公司在L2存在的情况下(补充图S2B).

这些结果共同表明Hsp90_Ec公司和DnaK在客户蛋白存在或不存在的情况下形成物理和功能复合物。

Hsp90 M-结构域的突变_Ec公司在体内引起与DnaK的不良相互作用

我们开发了一种分离Hsp90的筛网_Ec公司DnaK相互作用中潜在缺陷的突变体，目的是确定Hsp90区域_Ec公司与DnaK相互作用。该屏幕利用了我们之前的观察结果，即Hsp90_Ec公司在细菌双杂交试验中，和DnaK在体内相互作用²⁶在我们早期的工作中，携带Hsp90编码基因之间融合的质粒_Ec公司还有一块百日咳杆菌构建了腺苷酸环化酶基因T18，以及DnaK和环化酶另一片段T25之间的基因。当两个质粒在大肠杆菌编码腺苷酸环化酶基因突变的菌株(cya−)和编码Hsp90基因的缺失_Ec公司(Δ高温高压气体)，cAMP报告基因β-半乳糖苷酶表达，菌落在指示板上呈红色²⁶(图3A和3B). 这些结果表明DnaK和Hsp90_Ec公司体内相互作用，但不排除其他细胞蛋白参与相互作用的可能性，例如客户蛋白。然而，Hsp90_Ec公司W467R和其他客户绑定缺陷突变体与DnaK的相互作用类似于野生型Hsp90_Ec公司在双杂交试验中(补充图S3A).

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图3

Hsp90的鉴定_Ec公司参与体内DnaK相互作用的氨基酸残基。(A、 B)DnaK与Hsp90的相互作用_Ec公司体内细菌双杂交系统中的野生型或突变型，如方法中所述。DnaK融合到百日咳鲍特菌腺苷酸环化酶，T25。热休克蛋白90_Ec公司野生型和突变体各自与另一个结构域T18融合。T25-DnaK与每个T18-Hsp90共表达_Ec公司突变体分别位于塞浦路斯-ΔhtpG公司细胞与DnaK和Hsp90的相互作用_Ec公司通过MacConkey指示板上报告基因β-半乳糖苷酶的表达来监测野生型或突变型(A类)和液体分析(B类). 在A类图中显示了三个独立实验的代表板。在B类β-半乳糖苷酶活性显示为平均值±SEM（n=3）。(C类)Hsp90晶体结构的表面渲染模型_Ec公司载脂蛋白形式的二聚体（pdb:2ioq）¹³C端畴与隔离的C端域（pdb:1sf8）的晶体结构对齐⁵⁵使用PYMOL(网址：www.pymol.org). 一个原聚体是灰色的。其他原单体的NBD、M结构域和C末端结构域分别为淡蓝色、小麦色和淡绿色。对突变的残基进行标记和着色。

我们构建了一个T18-Hsp90_Ec公司含有随机突变的质粒库高温高压发生器。然后我们共同表达T18-Hsp90_Ec公司T25-DnaK质粒突变质粒文库大肠杆菌cya⁻ΔhtpG并在指示板上筛选白色菌落（参见补充方法). 在Hsp90中_Ec公司获得突变体，其中两个含有R355取代；其中一个取代了赛斯，另一个取代勒乌。我们重建了T18-Hsp90中的R355C和R355L突变_Ec公司质粒，因为突变基因也编码了一些额外的氨基酸变化。当T18-Hsp90_Ec公司R355C或T18-Hsp90_Ec公司R355L与T25-DnaK在cya−ΔhtpG菌株，我们观察到菌落在指示板上呈淡粉红色(图3A)β-半乳糖苷酶水平为野生型的~10%(图3B). 这些结果表明Hsp90的R355残基_Ec公司对于与DnaK的体内相互作用很重要。

热休克蛋白90_Ec公司R355位于M域的长α-螺旋中，表面暴露在Hsp90的开放和闭合构象中_Ec公司¹³(图3C和补充图S3B和S3C). 识别其他Hsp90_Ec公司对于体内DnaK相互作用很重要的残基，我们使用定点突变取代R355附近其他表面暴露残基中的氨基酸。在与R355相同的α-螺旋中构建了三个突变体，包括K354C、Q358C和D366C(图3C和补充图S3B和S3C). 还构建了该地区的其他突变体，包括K238C、R267C、E269C和G270A/K271A(图3C和补充图S3B和S3C). 然后在细菌双杂交试验中测试突变蛋白与DnaK的相互作用能力。我们观察到表达T25-DnaK和T18-Hsp90的菌株_Ec公司指示板上的K238C、E269C或G270A/K271A为粉红色(图3A)而那些表达T25-DnaK和T18-Hsp90的_Ec公司R267C、K354C、Q358C或D366C为红色(图3A). 细胞产生的β-半乳糖苷酶水平反映了菌落的颜色：表达T25-DnaK和T18-Hsp90的细胞中β-半乳糖苷酶的水平_Ec公司K238C、G270A/K271A或E269C为野生型的~16%(图3B). 表达其他四个突变体T18-Hsp90的细胞_Ec公司R267C、K354C、Q358C或含有T25-DnaK的D366C产生的β-半乳糖苷酶水平略低于野生型（约为野生型的80%）(图3B). 在对照实验中，所有突变融合蛋白的稳态水平与野生型相似(补充图S3D).

因此，这些突变体定义了Hsp90中的一个区域_Ec公司M域对体内与DnaK的相互作用很重要。然而，双杂交分析不能区分二元相互作用和涉及其他细胞成分的相互作用。

DnaK相互作用缺陷型Hsp90_Ec公司体内鉴定的突变蛋白在体外DnaK结合中有缺陷

确定Hsp90_Ec公司我们鉴定的突变蛋白在与DnaK的直接相互作用中存在缺陷，我们纯化了这些突变蛋白并测试了它们在没有其他蛋白的情况下体外结合DnaK。使用超滤分析，我们先前表明，在野生型Hsp90存在下，标记的DnaK被特异性地保留在100kDa MWCO过滤器上_Ec公司²⁶(图4A). 当我们测试Hsp90时_Ec公司突变蛋白，我们观察到Hsp90_Ec公司与野生型相比，R355L、R355C、G270A/K271A、E269C、R267C和K354C在DnaK结合中存在部分缺陷(图4A和4B). 热休克蛋白90_Ec公司Q358C和D366C类似于野生型(图4B). 这些结果表明，Hsp90_Ec公司体内DnaK相互作用中缺陷最大的突变体在体外DnaK交互作用中有缺陷。

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图4

热休克蛋白90_Ec公司M域突变体在体外DnaK相互作用中存在缺陷。(A类)DnaK与Hsp90的相互作用_Ec公司通过测量[^三H] 野生型或突变型Hsp90浓度增加时，纤维素过滤器上的DnaK具有100-kDa排除极限_Ec公司，如方法中所述。(B类)DnaK与Hsp90的相互作用_Ec公司通过超滤测定野生型或突变型或BSAA类使用1μM Hsp90_Ec公司. (C类)DnaK D45C-生物素与野生型或突变型Hsp90的相互作用_Ec公司在L2和CbpA存在的情况下，按照方法中的描述进行测定。采用免疫印迹分析和SDS-PAGE考马斯蓝染色分析DnaK相关蛋白。在A、 B，来自至少3个重复的数据显示为平均值±SEMA类野生型R355C、R355L、G270A/K271A和E269C的表观Kd值分别为0.42、1.49、1.79、1.53和0.85μM。在C类，2.4μM DnaK，3.6μM Hsp90_Ec公司使用了2.3μM L2和0.4μM CbpA，并显示了来自三个独立实验的代表性凝胶。

接下来，我们在下拉实验中测试了突变蛋白，再次发现在双杂交实验中非常有缺陷的突变蛋白Hsp90_Ec公司R355C、R355L、K238C、G270A/K271A和E269C在含有或不含有CbpA的L2的情况下与生物素化DnaK结合的能力也有缺陷(图4C和补充图S4A). 在双杂交试验中部分缺陷的突变体R267C和K354C在L2存在下与DnaK相互作用的能力降低(图4C). 总之，我们的结果表明Hsp90的一个区域_Ec公司R355附近的M域对于与DnaK的二元相互作用以及在存在或不存在CbpA的情况下与DnaK和L2的三元相互作用都很重要。

DnaK结合缺陷的Hsp90_Ec公司突变体在体外与DnaK的功能协作中受损

基于体内和体外蛋白质相互作用结果，我们预测DnaK相互作用缺陷的Hsp90突变体在与DnaK协同刺激ATP水解时也会有缺陷。在对照实验中，我们观察到突变型Hsp90_Ec公司蛋白质的ATP水解基本速率与野生型相似，表明突变不会导致ATP水解缺陷(图5A). 此外，在存在客户蛋白的情况下，Hsp90的L2、ATP酶活性_Ec公司突变体受到类似于野生型的刺激(图5A). 由于客户结合缺陷Hsp90导致ATP水解_Ec公司突变体不受L2刺激⁵(图2C)，这些观察表明Hsp90_Ec公司DnaK交互中有缺陷的突变体在客户端绑定中没有缺陷。

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图5

热休克蛋白90_Ec公司DnaK相互作用缺陷的突变体在与DnaK的功能协作中存在缺陷。(A类)野生型或突变型Hsp90的ATP酶活性_Ec公司在无L2或L2存在的情况下，按照方法中的描述进行测量。(B类)在存在野生型或突变型Hsp90的情况下测定ATP酶活性_Ec公司DnaK和L2。在L2和Hsp90存在下，DnaK水解ATP的附加值_Ec公司第二语言中的WT或突变体用灰色条显示，以帮助读者阅读。(C类)按照使用Hsp90的方法中所述，随着时间的推移，监测热变性荧光素酶的反应_Ec公司结合DnaK、CbpA和GrpE的野生型或突变型。野生型，黑色；R267C，橙色；K354C，紫色；E269C，蓝色；G270A/K271A，粉红色；R355L，红色；R355C，绿色；K238C，浅蓝色；仅DnaK、CbpA、GrpE，黑色，带开圆圈；热变性荧光素酶单独，灰色。在A–C，来自至少3个重复的数据显示为平均值±SEM。

然后，我们测试了突变体在L2存在下与DnaK结合协同刺激ATP水解的能力。当Hsp90_Ec公司用R355C、R355L、K238C、E269C或K354C替代野生型，未观察到ATP酶的协同刺激；相反，水解作用类似于每一个伴侣单独与L2水解的总和(图5B). Hsp90水解ATP_Ec公司L2存在下的G270A/K271A或R267C和DnaK大于加性，但刺激性小于野生型Hsp90_Ec公司(图5B). Hsp90水解ATP_Ec公司含有DnaK和L2的Q358C或D366C与野生型Hsp90的协同刺激相似或更大_Ec公司带有DnaK和L2(图5B). 这些结果提供了体外证据，表明M结构域中R355周围的区域对Hsp90之间的功能协作很重要_Ec公司和DnaK。

蛋白质

热休克蛋白90_Ec公司野生型和突变体²⁶，DnaK野生型和突变体⁵⁰、DnaJ⁵⁰、CbpA⁵²，组E⁵⁰和His-tagged L2¹⁶按所述进行隔离。经SDS-PAGE测定，所有蛋白质纯度>95%。突变型Hsp90_Ec公司蛋白质表现出ATP酶活性，凝胶过滤色谱图与野生型相似(图5A和补充图S4B). 荧光素酶和荧光素分别来自Promega和Roche。给出的浓度适用于Hsp90_Ec公司、DnaJ、CbpA和GrpE二聚体以及DnaK、L2和荧光素酶单体。使用20倍过量的马来酰亚胺-聚乙二醇标记DnaK D45C₁₁-使用1.5倍过量的NHS-PEG标记生物素（Thermo，Life Technologies）和DnaK野生型、T199A和V436F₄-制造商推荐的生物素（Thermo，Life Technologies）。通过透析去除多余的生物素试剂。DnaK D45C-生物素在荧光素酶活化方面与野生型相似(补充图S1A). DnaK标记为^三H如所述（740 cpm/pmol）⁵³.

荧光素酶活化

荧光素酶重新激活如前所述，并进行了修改²⁶将.40 nM热变性萤光素酶在24℃下在含有25 mM Hepes、pH 7.5、50 mM KCl、0.1 mM EDTA、2 mM DTT、10 mM MgCl的反应混合物（75μl）中孵育₂、50μg/ml牛血清白蛋白（BSA）、3 mM ATP、ATP再生系统（25 mM磷酸肌酸、6μg肌酸激酶）、0.95μM DnaK、0.15μM CbpA、0.05μM GrpE和0.5μM Hsp90_Ec公司野生型或突变型。在指定的时间去除等分样品，并使用Tecan Infinite M200Pro在发光模式下测量光输出，积分时间为1000 ms。与非变性荧光素酶对照相比，测定了反应。

ATP酶活性

如前所述，使用1μM Hsp90测量稳态ATP水解_Ec公司野生型或突变型^5,8L2（1μM）、DnaK野生型或突变型（1μM）和格尔德霉素（30μM）。

超滤分析

Hsp90协会_Ec公司和DnaK是使用前面描述的改良超滤法测定的²⁶0.13微米[^三H] 将DnaK在含有20 mM Tris-HCl、pH 7.5、75 mM KCl、10%甘油（vol/vol）、0.05%Triton X-100（vol/vol）、5 mM DTT和Hsp90的反应混合物（100μL）中24°培养5分钟_Ec公司如图所示，野生型或突变型或BSA。反应通过Microcon DNA快速流动过滤器（Millipore）在3200×克持续10分钟。用10%SDS回收保留的蛋白质，并测量放射性。通过减去[^三H] 在没有Hsp90的情况下保留DnaK_Ec公司(<10%).

蛋白质相互作用分析

使用下拉法测量Hsp90的相互作用_Ec公司使用DnaK。将2.4μM DnaK D45C-生物素在含有PD缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.5，75 mM KCl，10%甘油（vol/vol），0.01%Triton X-100（vol/vol），2 mM DTT，10 mM MgCl）的反应混合物（50μL）中在23°C下孵育5分钟₂，2 mM ATP）和3.6μM Hsp90_Ec公司野生型或突变型，2.3μM L2，0.4μM CbpA和0.13μM GrpE。然后添加20μL中性白细胞介素琼脂糖（Thermo，Pierce），并在23°C下孵育5分钟。用0.4 mL PD缓冲液稀释反应，在1000×克回收的琼脂糖珠用0.4 mL PD缓冲液洗涤两次。结合蛋白用含有2 M NaCl的缓冲液洗脱，并在SDS-PAGE后通过免疫印迹分析或考马斯蓝染色进行分析。如有指示，使用生物素化DnaK野生型、DnaK T199A或DnaK V436F。

我们感谢Dan Masison、Michael Reidy和Aurelia Battesti进行了许多有益的讨论。这项研究得到了NIH、NCI、癌症研究中心的院内研究计划的支持。