肝脏中的Cre活性：靶向肝脏非实质细胞的转基因方法

“条件”Cre表达式

使用细胞特异性启动子元件实现细胞特异性Cre表达。在组成系统中，启动子激活直接导致Cre表达和重组。然而，组成系统不允许在特定时间点标记一组定义的细胞（时间Cre表达），这否定了它们在真实命运映射实验中的应用。此外，构成性Cre驱动的对发育重要基因的消融，即使是细胞特异性的，也可能导致胚胎死亡。因此，近年来，诱导性Cre-lox系统的使用有所增加，在诱导性Cre-lox系统中，需要外源刺激才能允许Cre介导的重组。Cre的这种时间调节可以通过包括Cre融合蛋白或四环素（Tet）系统在内的系统介导。

常用的他莫昔芬诱导系统采用Cre融合蛋白CreER^T2段，包含雌激素受体的突变配体结合域。²这种结构阻止Cre进入细胞核并驱动重组，直到外源性给予他莫昔芬与融合蛋白结合(图1B). Tet-inducible系统有两个主要版本：Tet-ON和Tet-OFF。²两者都依赖于插入子序列感兴趣基因上游的操作员序列和四环素激活物（TA）蛋白（tTA或rtTA）单独并入基因组。Tet给药，通常作为强力霉素，然后促进（Tet-ON）或阻止（Tet-OFF）相关基因的表达。Tet系统的主要优势是潜在的可逆基因激活。它也可以与Cre-lox结合cre公司的下游子序列序列或使用Cre打开rtTA或tTA转录。

三苯氧胺和四苯氧胺系统都需要仔细的剂量滴定，以最大限度地提高重组效率，同时最小化不必要的副作用。低水平的背景重组和低重组效率可能是个问题。三苯氧胺在注射后可能会在肝脏中持续1-4周，较高剂量会导致非特异性重组。^三两者都可能通过标记额外的细胞类型来混淆准确的命运映射。因此，必须仔细考虑实验设计，使用适当的控制措施，以确认观察到的效果是预期的Cre-lox操作的结果。

病毒载体介导的Cre表达调控

病毒载体也可用于在小鼠的特定细胞类型中实现转基因表达。重组腺相关病毒是非致病性辅助依赖性细小病毒，其病毒编码蛋白被感兴趣的基因或结构所取代，例如cre公司该系统已用于使用含Cre的肝细胞靶向腺相关病毒进行肝脏优雅的命运定位研究。^4,5

Flp-FRT公司

类似于Cre-lox，但来源于真菌而非病毒，Flp-FRT公司是一种替代系统，在该系统中，通过翻转酶（Flp）介导的插入翻转酶识别靶点（FRT）的重组进行靶向基因操作。²Flp的重组效率和热稳定性落后于Cre，尽管采用FLPe和FLPo等Flp变体大大提高了其效用。^2,6该系统已被广泛用于在Tg小鼠菌株的产生过程中去除抗生素抗性基因。虽然Flp尚未在肝脏中广泛应用-FRT公司未来几年可能会扩大。具体来说，与Cre-lox结合可以进行独立或顺序的基因操作，这可能大大有助于建立小鼠癌症发展的模型。⁷

Reporter系统

Cre-lox是一种非常强大的工具，可以永久和可遗传地标记细胞，这是命运图谱研究所必需的。ROSA26基因座因其强大且普遍的表达而经常用于产生“Rosa26R”报告菌株。⁸常见荧光报告体(图2)包括ZsGreen、TdTomato、膜靶向TdTomato膜靶向增强型绿色荧光蛋白（mTmG）、增强型绿色萤光蛋白（eGFP）变体和彩色记者，如彩色纸屑。⁹荧光结构不断进化，以最大限度地提高荧光和保真度，并包含额外的改进，例如定位标签，以允许细胞溶质、膜和核靶向。⁹荧光报告子也允许在没有额外抗体染色的情况下进行细胞分选，并且在分离低频率存在的细胞类型时特别有用。

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图2

用荧光报告物标记肝脏NPC。（A和B）未经治疗（A）和CCl的整个肝脏中qHSC和aHSC的Lrat-Cre-driven ZsGreen标记₄-治疗（B）小鼠。经麦克米伦出版有限公司许可改编：Nat Commun，¹²© 2013. Pdgfrb-Cre中qHSC和aHSC的（C和D）Pdgfrp-Cre驱动膜GFP标记（绿色）；使用橄榄油（对照，C）或慢性CCl的mTmG小鼠₄（D） 管理。经麦克米伦出版有限公司许可改编：Nat Med，¹³© 2013. （E） 他莫昔芬诱导的Cdh5-PAC-核心^T2段-驱动LSEC的TdTomato（红色）标签。细胞核（蓝色），α-SMA⁺单元格（绿色）。根据补充信息改编为以前的作品，²⁹经作者许可。（F） LysM-Cre驱动的未损伤肝脏巨噬细胞膜GFP标记（绿色）；mTmG小鼠（K.P.C.和N.C.H.，未公布数据）。

靶向造血干细胞和肌成纤维细胞

肌成纤维细胞是肝脏中主要的促纤维化细胞，现在有大量体内有证据表明，位于Diss间隙的肝特异性周细胞HSC是其主要前体。¹²因此，肝干细胞和肝肌成纤维细胞对寻找有效的抗纤维化治疗方法具有深远的兴趣。

卵磷脂-视黄醇酰基转移酶

这种HSC靶向策略利用了它们在类视黄醇储存中的特殊作用，使用了一只Tg小鼠，其中Cre的表达由卵磷脂视黄醇酰基转移酶（Lrat）驱动，Lrat是一种在HSC脂滴形成中起关键作用的酶。¹²在两个荧光报告系统中，Lrat-Cre标记99%的HSC（通过流式细胞仪上的维生素A荧光定义）。共聚焦显微镜显示与HSC标记物、结蛋白和血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）的强共定位。此外，在任何其他类型的肝细胞中均未发现Lrat蛋白表达。仅观察到血管平滑肌细胞（VSMC）的罕见标记（<1/200 HSC）。因此，该策略有效且具有高度特异性地针对HSC。

在中毒性、胆汁淤积性和脂肪性肝病模型中，Lrat-Cre-driven报告基因表达表明，82%-96%的肝肌成纤维细胞（部分由胶原（Col）-GFP转基因（其中GFP在Col-α1（I）启动子/增强子的控制下表达）的伴随表达确定）来自HSC。然而，HSC并不是上皮祖细胞。联合Lrat-Cre和Cre诱导的白喉毒素受体导致CCl后HSC显著耗竭，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和促纤维化基因表达减少₄再次强调了HSC在肝纤维化过程中基质沉积的中心作用。

血小板衍生生长因子受体β

Pdgfrb-Cre小鼠代表了一种靶向HSC和肌成纤维细胞的替代策略。¹³这些小鼠在一种Pdgfrb公司在静止的HSC（qHSC）和活化的肌成纤维细胞中，基因片段和驱动高效重组具有高度的特异性。¹³Pdgfrb-BAC-eGFP报告人证实了qHSC表达PDGFRβ，并为HSC的荧光标记提供了额外的遗传策略。Pdgfrb-Cre策略确定了肌成纤维细胞αv整合素在调节包括肝、肺和肾在内的几个实体器官的纤维化中的关键作用。HSC中αv整合素的选择性缺失可保护CCl小鼠₄-诱导的肝纤维化和αv-null HSC激活潜在转化生长因子β的能力降低。使用小分子抑制剂靶向αv整合素进一步验证了这些发现，该整合素可改善肝和肺纤维化。

胶质纤维酸性蛋白

许多研究使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）-Cre组成性或诱导性靶向HSC。^14–17然而，有人认为GFAP-Cre并不以高特异性靶向HSC。使用GFAP-Cre小鼠（其中人类GFAP启动子控制Cre表达）与GFP报告基因杂交，在HSC和胆道系统导管细胞中检测到GFAP、Cre重组酶和GFP报告蛋白。¹⁴GFAP在人和大鼠肝脏中也有表达。随后，GFAP-Cre报告员证明了胆管和表达细胞角蛋白19的胆管细胞的标记，而不是结蛋白⁺HSC或产生胶原蛋白的肌成纤维细胞。¹²因此，GFAP-Cre似乎并不专门针对HSC，其在小鼠肝脏疾病研究中的整体效用尚待完全阐明。

α-SMA

肌成纤维细胞通过α-SMA表达进行经典鉴定。¹⁸一种与α-SMA连接的诱导型Cre（α-SMA Cre-ER^T2段)已被用于靶向肝肌成纤维细胞。^17,19当使用α-SMA-Cre-ER时，获得了较高的重组率（57%-81%）^T2段废除α-SMA的平滑表达⁺肝细胞和平滑的Hedgehog信号传导的丧失破坏了胆管结扎（BDL）后的纤维化减少。在BDL或部分肝切除术（PH）后，肌成纤维细胞积聚和肝细胞增殖也受到抑制。有趣的是，当α-SMA-Cre-ER^T2段将小鼠与黄色荧光蛋白（YFP）报告基因杂交，发现在PH或BDL作用下，YFP在8%-34%的肝细胞中表达。这一发现提高了α-SMA的可能性⁺肌成纤维细胞群体包括肝细胞前体，这与目前的教条相反，随后受到替代命运映射方法的挑战。^12,20,21

胶原蛋白

活化的HSC（aHSC）是肝脏胶原蛋白的主要来源，^12,22,23以及一些以胶原蛋白表达细胞为靶点的Tg小鼠株。¹⁶在Col-GFP-Tg小鼠中，CCl肝损伤2个月后₄占全部GFP的92.6%⁺非实质部分的细胞为α-SMA⁺对肌成纤维细胞具有良好的特异性。这些GFP的进一步表征⁺细胞提示HSCs（维生素A⁺和结蛋白⁺)是肝损伤模型中肌成纤维细胞的主要来源（92%）。Col-GFP小鼠也能够对GFP进行表型分析⁺BDL后的肌成纤维细胞群。²⁴与CCl相比₄损伤，维生素A⁻胆汁淤积性肝损伤后，细胞最初（BDL后第5天和第17天）形成大多数肌成纤维细胞。定义了Thy1的其他特征⁺，弹性蛋白⁺和结蛋白⁻建议由门静脉成纤维细胞组成的人群。

Col-α1（I）和Col-α2（I₄，>92%的α-SMA⁺细胞和>94%的结蛋白⁺这些细胞表达YFP报告基因，为肌成纤维细胞/aHSC高效重组提供了证据。¹⁶此外，当他莫昔芬诱导的Col-α2（I）-CreER与mTmG报告子杂交时，～35%的结蛋白⁺在CCl治疗7周后，用7天剂量的三苯氧胺标记HSC₄.

这三种靶向报告策略表明，在CCl消退过程中，肝肌成纤维细胞可以恢复为非活性HSC表型₄-诱导纤维化。¹⁶在Col-α2（I）-CreER靶向策略中，14%的结蛋白⁺HSC为GFP⁺恢复1个月后，几乎一半的数字标记为峰值纤维化。在酒精诱导的肝纤维化模型中也观察到类似的结果。值得注意的是，Col-GFP小鼠接受第二疗程CCl₄在第一次完全康复后，与之前未经治疗的接受CCl的同窝对照相比，出现了更严重的纤维化₄这是第一次。

波形蛋白

波形蛋白是一种细胞骨架丝蛋白，在间充质细胞，特别是肌成纤维细胞中强烈表达。波形蛋白启动子控制下的他莫昔芬诱导的Cre被用于跟踪肝损伤停止后HSC和肌成纤维细胞的激活和逆转。²⁵在未损伤的肝脏中检测到最小的报告基因表达，这表明这种策略不适合靶向qHSC。慢性CCl后₄损伤，约25%的HSC被标记，所有标记细胞结蛋白⁺.

针对LSEC

肝窦内皮细胞由一个独特的内皮细胞亚群组成。它们在形态和功能上都不同于其他器官的内皮细胞，具有众多的窗孔，没有基底膜，并且发挥着不同的作用。²⁶尽管目前还没有针对LSEC的Cre驱动因素，但最近成功地将一种针对内皮细胞的Cre驱动器用于针对LSEC。

血管内皮钙粘蛋白

血管内皮钙粘蛋白是一种细胞间糖蛋白，由cdh5基因，是LSEC表达的主要钙粘蛋白。²⁷其主要功能是内皮细胞的内聚和细胞间连接组织。他莫昔芬诱导的Cdh5-PAC-核心^T2段菌株，最初用于血管生成研究，²⁸成功瞄准LSEC。²⁹三苯氧胺后，TdTomato报告基因在内皮细胞中广泛表达，但没有标记结蛋白⁺，PDGFRβ⁺，或α-SMA⁺细胞。Cdh5-PAC-核心^T2段然后采用该策略敲低C-X-C趋化因子受体（CXCR）4、CXCR7或成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）的LSEC表达。LSEC特定抄送7敲除显著降低急性肝损伤后肝细胞增殖（单剂量CCl₄)以及慢性损伤（BDL或慢性CCl₄)损伤再生并促进纤维化。相反，LSEC中CXCR4或FGFR1的缺失限制了BDL后发生的纤维化前改变，表明FGFR1介导的CXCR4上调可以平衡LSEC促再生反应并促进纤维化。因此，LSEC通过CXCR7和CXCR4在肝脏损伤和修复中发挥关键作用。

靶向肝脏中的巨噬细胞

肝损伤刺激枯否细胞（KCs）、肝旁巨噬细胞的激活和循环巨噬细胞的浸润。巨噬细胞亚群对纤维生成及其分解至关重要，³⁰因此，有必要剖析调控这些不同损伤反应的潜在机制。目前，Tg靶向肝巨噬细胞的最大挑战尚未解决，即区分巨噬细胞与髓系其他细胞，以及靶向肝旁巨噬细胞与招募巨噬细胞群的能力。³¹尽管存在这些局限性，但下文概述的Tg方法已被证明是针对肝脏内髓细胞群的有用工具。

M溶菌酶

在小鼠中，M溶菌体（LysM）在髓细胞中特异性表达，并在巨噬细胞激活后上调。³²在LysM-Cre小鼠中，经典巨噬细胞标记物F4/80阳性的腹腔巨噬细胞的重组率为83%-95%。³³然而，在高达99%的巯基乙酸合法化的腹腔中性粒细胞和少数树突状细胞（DC）中也观察到重组。最近，研究表明巨噬细胞亚群的可变LysM表达可导致差异重组，与成熟的组织旁巨噬细胞相比，未成熟的巨噬细胞表现出更少的重组。³⁴这项工作也很好地证明了巨噬细胞亚群在血吸虫病诱导的肝纤维化中的不同作用。

LysM-Cre与GFP报告人一起，也被用于追踪Ad5腺病毒感染后KC膜完整性的丧失，³⁵以及进一步的基因缺失研究。^36–38使用LysM-Cre敲低过氧化物酶体增殖物激活物受体γ（PPAR-γ）表明，PPAR-β亚型的巨噬细胞表达降低至基线水平的25%以下，在急性和慢性CCl中₄-诱导肝损伤后，这些小鼠表现出肝损伤和纤维化加重。³⁸