突触连接模式编码信息的假说深刻地影响了对长期记忆的研究。在海马，基底CA1的突触主要接受来自海马区CA3的输入，CA3→CA1的投射因其可塑性和在记忆中的关键作用而被广泛研究。与新皮质一样，海马体中的树突状棘是兴奋性突触的良好代表12，激发脊椎延时成像作为监测突触转换的手段7–10.
之前的工作已说明体内急性和近期慢性制剂中CA1棘的成像13–15。我们通过结合衍射分辨率有限的显微显微镜跟踪脊椎长达14周14（0.85 NA），一种用于脑深部延时成像的慢性小鼠制剂4、和Thy1-GFP公司在CA1锥体神经元的稀疏亚群中表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠(,). 组织学分析证实，这种方法诱导的神经胶质细胞活化程度最低()，如前所示4,16.
成年小鼠CA1海马中的树突状棘是动态的(一)CA1背面植入的密封玻璃导管允许延时体内树突棘成像。
(b条)双微镜将激光扫描图案投影到组织中的样本平面上。插图：红线表示光线轨迹。
(c（c）)活的CA1树突棘Thy1-GFP公司鼠标。
(d日)时间推移图像序列。箭头表示脊椎在序列中持续存在（白色箭头）、中途消失（红色）、中途出现然后持续存在（绿色）、中途兴起然后消失（黄色）或消失然后出现在无法区分的位置（青色）。
一个主要的担忧是，在双光子显微镜的分辨率极限内，人们无法区分两个或更多的棘。这个问题对于海马棘的研究至关重要，海马棘比新皮质棘密度更大17为了评估脊椎的外观融合在一起的频率，我们检查了来自Thy1-GFP公司小鼠，使用双光子显微镜和刺激发射损耗（STED）显微镜。后者提供超分辨率（约70 nm FWHM横向分辨率），比前者精细近9倍14（~610 nm），允许对相同CA1树突的成对图像进行比较测试(,).
一个简单的动力学模型足以描述CA1锥体细胞棘动力学(一)同一树突的双光子显微镜和受激发射损耗（STED）成像体外试验。(顶行)双光子图像将比分辨率极限更近的脊描绘为合并的实体。(底部)星号标记了一个示例，直观地标记了脊椎，显示了附近脊椎的情况(正确的)或者不(左边)合并。
(b条)脊椎的分数(N个共151个），即STED成像确定的一个、两个或三个脊椎。误差线：s.d。
(c（c）)双光子成像显示，相邻未融合脊椎和成对脊椎之间出现了分离。打开的灰色圆圈标记每个N个=150个脊椎。黑条：平均值±标准差。
(d日)例如，计算机模拟的延时图像序列，用于量化分辨率限制如何影响测量的脊椎密度和动力学。
(e（电子）)计算模型预测由于有限的光学分辨率，脊柱密度估计不足。蓝色对角线：完美探测所有脊椎。黑色水平虚线：新皮质和海马锥体细胞上脊柱密度的典型范围。红色数据：对不同脊柱密度的树突模拟图像进行视觉评分的结果。黑色曲线：根据评分模型预测，使用600 nm作为正确区分的两个脊椎之间的最小间距。
(（f）)在分辨率有限的图像中，由于相邻脊柱的合并，建模预测了对脊柱稳定性的过高估计。蓝色数据：计算机模拟中实际脊柱翻转的存活分数（平均值±标准偏差）（脊柱密度：2.56μm−1). 红色数据：根据模拟双光子图像的得分，这些模拟树枝状晶的明显更替。黑色曲线：基于评分模型对脊柱存活率的理论预测。
正如预期的那样，我们在STED图像中看到了附近的脊椎，这些脊椎似乎与双光子图像融合在一起(). 双光子图像中显示为单一的23±3.6%（s.e.m.）的脊椎实际上是两个脊椎(). 6.0±1.6%实际上是三根脊柱。双光子图像中合并脊椎之间的距离（0.51±0.14μm；平均值±s.d.）低于（0.61μm）分辨率极限14(). 很明显，合并会导致虚幻的脊椎稳定性，因为两个或多个真实的脊椎必须消失才能使合并的脊椎消失。
为了定量地处理融合效应，我们开发了一个数学框架，允许系统地检查不同动力学模型的周转动力学，以及脊椎外观的融合如何改变双光子成像数据中这些动力学的表现（补充文本；–). 我们使用计算机模拟来研究合并脊椎的密度和表观动力学如何随单个脊椎、脊椎密度、分辨率和脊椎动力学的几何变化而变化（补充文本；). 我们还通过实验检查了脊柱角度和长度的波动，以及脊柱附近树突的半径是否会影响脊柱翻转的测量(,). 通过模拟延时图像序列，我们对各种光学条件、脊柱密度、几何形状和周转动力学的合成数据进行了评分和分析(;,).
模拟和数学建模证实，由于合并以及由此产生的稳定性增加的错觉，对双光子数据的幼稚分析不适合于CA1中的脊椎密度（补充文本；). 对于稳定性分析，我们遵循了先前的研究7–9在我们使用存活率曲线时，S公司(t吨)，在获取的初始图像中出现的脊椎部分t吨=0和当时的情况t。的形状和渐近值S公司(t吨)为营业额的动力学模型和永久性脊椎的比例提供强有力的约束(即脊椎丢失的速率常数为零）7–9（补充文本）。引人注目的是，模拟图像的视觉评分(;)低估了脊柱密度()而且明显高估了脊椎的寿命(). 但至关重要的是，我们的处理方法准确地预测了实际密度和视觉上确定的低估值之间的关系，并正确地解释了明显的周转动态，S公司(t吨)根据实际动力学(,和). 总的来说，模拟结果表明，来自CA1的双光子图像的面值解释是不可信的，但只要能正确解释光学分辨率，就可以对脊椎动力学做出定量正确的推断。使用相同的框架，我们接下来分析了实际数据。
最初的分析集中于四只小鼠，其中我们每三天采集一次CA1锥体细胞和追踪棘的图像堆栈，持续21天【共60个树突；每次治疗50±7（平均±s.d.）】(). 无论何时，在两次或多次连续治疗中，当个别脊椎出现在难以区分的位置时，我们将其确定为对同一脊椎的观察结果。总的来说，我们每天进行4903次脊柱观察[613±71（平均值±标准日）]。脊椎密度随时间变化不变()（Wilcoxon符号秩检验；n个=每两天比较16–50个树突；对28项比较进行Dunn-s idák校正后，显著性阈值=0.0018；P（P）>0.047（所有比较），以及脊柱体积(P（P）= 0.87; Kruskal-Wallis方差分析）()，以及换手率，即自上次手术以来出现或消失的脊椎比例7()（Wilcoxon符号秩检验；14–40个树突；20次比较校正后显著性阈值=0.0025；P（P）>所有比较均为0.31）。50%以下的脊椎（46±2%；平均值±标准偏差。；n个=4只小鼠）()尽管我们的模拟结果表明，这种幼稚的观察结果高估了脊椎的稳定性。
NMDA受体阻滞剂，而非环境富集剂，改变了脊柱周转动力学(一)基线成像会话的时间表。
(b条)未测量脊椎密度(上面的)非周转率(降低)在家里的笼子里，老鼠的情况各不相同。水平线：平均脊柱密度和周转率
(c（c）)脊椎存活(上面的)和新生儿脊柱存活(降低).
(d日)环境富集研究时间表。
(e、 （f）)在脊柱密度方面，基线（黑点）和富集条件（红色）之间不存在显著差异(e、，
上面的)、营业额、(e、，
降低)，生存(f、，
上面的)或新生儿脊柱存活(（f）,降低).
(克)NMDA受体阻断研究时间表。。
(小时)MK801导致脊柱密度显著下降。数据来自MK801给药前（黑色）四次和给药（绿色）六次的小鼠图像。黑色和绿色水平线分别表示MK801治疗最后四天基线期间的平均密度。密度下降非常显著（Wilcoxon符号秩检验；n个=29枝晶；P（P）= 0.0007).
(我)MK801治疗早期脊椎密度下降是由于脊椎丢失率（暗条）和获得率（亮条）之间的短暂、高度显著差异引起的（Wilcoxon符号秩检验；n个=29枝晶；P（P）= 0.0008). 灰度和绿色阴影条表示MK801给药前和给药期间治疗过程中脊椎获得和丢失的百分比。
所有误差条均为s.e.m。
脊柱密度和周转率的时间不变性表明，通过我们的数学框架，我们可以确定支配周转的潜在动力学参数。S公司(t吨)总脊柱和新生儿脊柱的曲线表面上与新皮质的曲线相似7–9(). 然而，与新皮质不同的是，所有疗程中46%的脊椎都与在两个遥远的时间点在同一位置观察两次脊椎的概率有显著差异，这是由渐进值S公司(t吨) (73 ± 3%). 这种差异表明，正如我们的模型所示，许多CA1棘可能会消失，并在无法区分的位置以持续的方式重新出现。
接下来，我们测试了长期的环境富集是否会改变脊柱的翻转。来自大鼠的先前数据表明，环境富集后，基础CA1脊椎密度可以增加~10%18。来自小鼠的数据仅限于CA1顶端树突，并且得出了相互矛盾的结果19,20（补充讨论）。在三只小鼠中，我们每隔三天进行16次实验，共观察到55个基底树突[39±14（s.d.）/天](). 第八节课结束后，我们将小鼠转移到一个丰富的环境中，在那里它们度过了第9-16节课。我们的脊椎总数为8727根[545±216（标准日）/天]。
基线和强化条件的比较显示脊柱密度或翻转没有差异() [n个=10-53枝晶；P（P）>0.10，8对密度比较；P（P）>0.039，离职率的7对比较；经过多次比较修正后，Wilcoxon签名秩检验的显著性阈值分别为0.006和0.007。脊柱存活率也没有差异(P（P）>0.057；7个时间点；n个=10-49枝晶；Wilcoxon符号秩检验；Dunn-s idák矫正后的显著性阈值为0.007，新生儿脊柱存活率也不显著(P（P）> 0.29; 6个时间点；n个=5–35个枝晶；显著性阈值为0.008；). 因此，在小鼠中，持续富集不会实质性改变CA1基底树突上的脊椎动力学。然而，稳定脊柱的平均体积略有[7±3%（s.e.m.）]，但在富集后显著下降（Wilcoxon符号秩检验；P（P）= 0.007; 追踪60根脊椎，共16次训练）(). 长期增强（LTP）的结构效应数据对这些发现提供了解释；LTP诱导后CA1脊柱密度短暂升高，但2小时后恢复到基线值21，这意味着持续富集不会导致脊椎密度发生净变化（补充讨论）。
接下来，我们研究了NMDA谷氨酸受体的阻断是否会影响脊柱周转。这些受体参与多种形式的神经可塑性，包括CA1区22在新皮层中，NMDA受体阻断通过减缓棘的消除而稳定棘，同时保持棘的形成速率不变10。我们在第四个疗程后及以后每隔三天对服用NMDA受体阻滞剂MK801的小鼠进行10个疗程的CA1脊髓追踪(). 我们检查了26个树突[25±1.4（s.d.）/疗程]，进行了5020次脊柱观察[502±32（s.d；P（P）= 0.0007) (). 这源于脊柱丢失率与增加率之间的短暂差异[丢失率为增加率的215±42%（标准偏差）；Wilcoxon符号秩检验；25个树突；P（P）=0.0008](). 这些结果表明CA1棘的存活率取决于NMDA受体的功能，说明我们检测脊柱动力学变化的能力，并表明CA1和新皮质棘对NMDA受体阻断有不同的反应。
为了确定支配脊柱翻转的基本时间常数，我们比较了S公司(t吨)从各种候选动力学模型的视觉评分脊柱曲线到预测(). 在每个模型中都有一个子集（0-100%）的永久脊柱；剩下的脊椎是非永久性的，具有特征性的寿命，τ。由于环境富集使观测到的脊椎动力学保持不变，我们将基线和丰富的数据集合并，以将分析扩展到更长的时间尺度(). 通过改变实际脊椎密度、稳定脊椎分数和不稳定脊椎的特征寿命，我们确定了最适合S公司(t吨)曲线，使用最大似然准则（补充文本）。该模型具有100%的非永久性棘，实际密度为2.6μm−1和τ~10天(). 这是新皮质棘瞬态亚群5天寿命的两倍7–9也有具有永久性和非永久性脊椎的模型，虽然与CA1数据的拟合度较差，但它们都是合理的(). 至关重要的是，我们的分析确定了所有模型的拟合度明显低于最佳模型（白色区域,P（P）< 0.05; 似然比检验）；我们认为这些在解释CA1数据时不令人满意（补充文本）。
CA1和新皮质棘表现出不同的周转动力学(一)多个动力学模型与脊柱存活数据一致。每个模型都有两个亚种群：永久性和非永久性脊椎。横坐标：无常刺的平均寿命纵坐标：永久刺的分数。每个基准用于单个模型；颜色表示模型可能被拒绝的统计显著性级别。红点表示最适合数据的模型。没有结果显示与数据不兼容的模型的结果(P（P）< 0.05). 最适合CA1数据的模型具有~100%的无常棘，寿命约为10d（绿色箭头）。也有一些具有永久性子群体的模型在统计上无法被拒绝(例如红色箭头）。年龄和性别匹配的小鼠模型最适合新皮质脊椎翻转模式（黑箭头）7与CA1相比，这里使用的人具有约50-60%的永久性脊椎，而非永久性脊柱的寿命（约5天）更短。缺乏永久性脊椎的模型与新皮质数据不太吻合。灰色箭头标记了年的灰色曲线模型d日。四个箭头表示生成颜色对应曲线拟合的模型b、 d日.
(b条)CA1脊椎的经验确定存活曲线（黑色数据：平均值±标准偏差；数据集)超过46天，与中两个模型的预测（实心曲线）相比一（绿色和红色箭头在一). 绿色曲线：最适合的模型，没有永久的脊椎。红色曲线：具有稳定和不稳定脊椎的示例模型。
(c（c）)由于CA1的脊椎密度高于新皮质(插入)，的光学合并在CA1中更为常见。考虑到似乎是一根脊椎，垂直条表示根据计算模型确定的概率，实际观测值为1-5根脊椎。使用插入物的脊椎密度值计算概率，0.75μm是区分相邻脊椎所需的最小间距。误差线：的结果范围L（左）0.5–1.0μm范围内。
(d日)根据经验确定的新皮质棘的存活曲线（数据集来自参考文献。7)超过28天，与两种不同模型的脊柱翻转预测（实体曲线）相比一（灰色和黑色箭头在一). 黑色曲线：通过稳定的脊椎亚群获得最佳拟合。灰色曲线：模型缺乏永久性脊椎，数据拟合不佳。
(e（电子）)CA1和新皮质的脊柱在永久性与。短暂的脊椎、脊椎寿命、NMDA受体阻断的影响以及学习或新体验。
我们的研究结果表明，CA1中只有一个不稳定的脊髓群体，这与成人新皮质的研究结果形成了鲜明对比，其中超过50%的脊髓似乎是永久性的7–9为了进行公平的比较，我们使用我们的框架重新分析了支持这一结论的新皮质的已发表数据7由于新皮质棘密度较低，融合问题就不那么严重了()，我们的模型证实了约60%的新皮质棘在很长的时间尺度上是稳定的，支持了过去的结论7.
然而，我们发现CA1和新皮质脊柱转换动力学之间存在非常显著的差异(;P（P）= 0.01; 可能性比测试）。仅具有非永久性脊椎的模型（很好地描述了CA1）是不够的(P（P）< 10−62; 新皮质的似然比检验(). 两个区域中无常棘的不同寿命[~10d（CA1）与。~5d（新皮质）]进一步导致不相容(). 相反，解释新皮质脊柱翻转的模型与CA1数据不一致(P（P）= 0.01; 可能性比测试）。单靠建模并不能排除CA1基底树突具有某些永久性棘的可能性，但如果存在任何此类棘，则其所占比例远小于新皮质。因此，CA1和新皮质具有不同的脊柱动力学、无常脊柱的百分比和周转时间常数。
进一步区分CA1和新皮质是NMDA受体阻断的相反作用(和). 在新皮质中，MK801通过减少脊椎丢失来促进稳定性10和阻止脊椎添加11; 相反，NMDA受体的激活可能通过增加新的棘和去除支持旧记忆的原有新皮质棘来加速转换。在CA1中，MK801加快了周转并促进了不稳定性()表明NMDA受体激活可能会暂时减缓转换并稳定脊椎。确实，CA1中LTP的诱导与现有脊椎的稳定和新脊椎的生长有关5,23,24.
一种自然的解释是，脊柱动力学可能因大脑区域而异，以适应信息保留的持续时间。新皮质是一个更为永久的存储库，可能需要长时间的棘来永久存储信息，而短时间的棘则可以在需要时稳定下来8,9海马，一个明显的瞬时信息库，可能只需要瞬时的脊椎。~100%非永久性CA1棘的平均寿命约为1-2周，这意味着约3-6周内突触连接模式几乎完全消失，与持续时间相匹配，啮齿类动物的空间和情节记忆依赖于海马1,2（但也可参见参考。25). CA1神经元的整体位置码也会在~1个月后刷新16这可能是由于细胞突触输入的转换引起的。因为75–80%的CA3→CA1输入是单突触的26CA1脊椎无常可能意味着整个成年期CA3→CA1连接的持续重新模式化，这是由于突触的剪切数和稀疏连接不太可能两次假设相同的配置。
支持这些解释的是，人工神经网络通常显示出突触寿命和记忆寿命之间的对应关系27尽管在一些模型中，脊椎翻转和记忆擦除可以分离28,29计算研究还表明，消除旧突触可以增强记忆能力29,30更广泛地说，能够改变突触寿命（不仅仅是连接强度）的网络可以更稳定地存储长期记忆，同时快速编码新记忆27.
这里的数据与单个类别的CA1棘一致，但未来的研究应检查更替的精细动力学特征和细胞或网络机制23.通过使用荧光标签标记正在发生塑料变化的脊椎，体内成像可能有助于将连接强度、脊椎寿命和记忆性能联系起来。最后，研究人员应该在动物学习执行海马依赖性行为时调查其脊椎翻转情况，并在此基础上寻找CA1脊椎稳定性和学习之间的直接关系。
方法
动物和手术准备
斯坦福APLAC批准了所有程序。我们对小鼠表达绿色荧光蛋白的神经元进行成像，该绿色荧光蛋白由您的1-促进剂31（杂合雄性10–12周龄，GFP-M系，C57Bl6×F1背景）。我们没有对动物组进行任何随机分组。我们进行了之前发表的手术4但做了一些修改。我们用异氟醚（1.5–3%，O）麻醉小鼠2)并将不锈钢螺钉植入大脑右半球上方的头盖骨。我们使用直径为1.8毫米的环钻在左半球（脑桥后方2.0±0.3毫米，中线外侧2.0±0.3毫米）进行了开颅手术，并植入了光导管，其窗口正好在CA1区的背面，但不在CA1区内，从而保留了小腹。
导管和微透镜
导管为玻璃毛细管（内径1.5 mm，外径1.8 mm或内径2 mm，外径2.4 mm；长度2–3 mm）。我们使用光学环氧树脂（诺兰光学粘合剂81）将一个直径与毛细管外缘直径相匹配的圆形盖玻片连接到导管的一端。我们使用了直径为1.0mm、衍射极限分辨率（0.8 NA，在水中工作距离为250μm）的微光探针，这些探针被包裹在直径为1.4mm的护套中14.
体内双光子成像
我们使用了改进的商用双光子显微镜（Prairie Technologies），该显微镜配备了可调谐钛宝石激光器（变色龙，相干）。我们将激光发射调谐至920 nm，并调整样品的平均照明功率（约5–25 mW），以确保每个鼠标在成像过程中信号强度的一致性。对于显微镜检查，我们使用20×0.8 NA物镜（蔡司，Plan-Apochromat）向微透镜提供照明。在某些情况下，我们使用Olympus LUMPlan Fl/IR 0.8 NA 40×浸水物镜通过玻璃套管直接成像，并确认两种方法在所有三个空间轴上的光学分辨率相同。从手术后15–18天开始，我们每隔三天在异氟醚麻醉下给小鼠成像（O2)总共8–16次，每次持续60–90分钟。我们以长达80天的不规则间隔对一些小鼠进行成像。
MK801处理
在受以下方案约束的小鼠中在第四次成像后，我们服用MK801（Tocris Bioscence；0.25 mg·g−1体重；溶解在盐水中），每天两次腹腔注射（间隔8-10小时）10.
丰富的环境
给予丰富环境的动物的笼子更大[42（l）×21.5（w）×21.5cm（h）三]里面有一个轮子，各种颜色、质地和形状的物体，塑料隧道，还有不同口味的食物。我们每隔3-4天更换一次物体，以及它们在笼子内的位置，以鼓励探索并保持新颖性。我们提供了食物和水随意.
组织学
在结束时体内实验中，我们用氯胺酮（100mg/kg）和甲苯噻嗪（20mg/kg）对小鼠进行深度麻醉。然后，我们将磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）灌入心脏，然后将4%的多聚甲醛灌入PBS。我们在4°C下将大脑固定过夜，并在振动切片机（VT1000S，徕卡）上制备浮动切片（50mm）。之前在体外GFP荧光成像，我们用PBS缓冲液多次清洗荧光切片，并通过在PBS中的150mM甘氨酸中孵育15分钟来猝灭它们。在PBS内进行三次清洗后，我们用Fluoromout-G（Southern Biotech）安装切片。我们使用双光子荧光成像或受激发射损耗（STED）显微镜（Leica TCS STED CW，配备Leica HCX PL APO 100×1.40 NA油浸物镜）对切片进行了检查。
对于免疫染色切片，在淬火和渗透之前用PBS缓冲液冲洗数次（在PBS中的01%氚-X中培养15分钟）。切片在封闭溶液（1%Triton X-100、2%BSA、2%山羊血清PBS）中培养4小时。初级抗体（大鼠抗CD68，FA11-ab5344，Abcam，1:100稀释；小鼠抗GFAP，MAB3402，Millipore，1:500稀释；）在封闭溶液中稀释，切片在该溶液中培养过夜。第二天用PBS清洗切片，并在封闭溶液中用稀释的二级抗体（Cy5-共轭山羊抗鼠IgG，A10524和Cy5-共轭山羊抗大鼠IgC，A10525；两种分子探针；均为1:1000稀释）孵育3小时。所有染色程序均在室温下进行。在PBS中进行三次清洗后，用Fluoromout-G（Southern Biotech）安装切片。组织学标本在共焦荧光显微镜（Leica SP2 AOBS）上进行检查。
图像处理会话
我们将异氟醚麻醉小鼠安装在立体定向框架上。为了进行微镜检查，我们将微镜探头完全插入导管，使探头位于导管的玻璃窗上。为了在接受成像的脑组织的所有成像过程中实现精确可靠的三维对齐，我们使用了基于激光的对齐方法。我们放置了一束激光束，这样当鼠标的头部正确对齐时，激光束就会从显微内窥镜的后表面反射出来，并击中指定的目标。这确保了在每次成像过程中，微窥镜的长轴与光学平台垂直，角度在~1度以内。否则，我们在套管中插入一滴水，并使用水浸物镜成像。如前所述14，我们通过实验证实了这两种方法的分辨率极限基本相同。
图像采集
在第一次成像过程中，我们选择了脑组织的几个区域，在延时实验期间进行纵向监测。每个区域包含一到七个明显表达GFP的树突状片段。在每个成像会话中，我们使用0.0725×0.0725 x 0.628μm的体素大小获取每个选定区域的6-8个图像堆栈三.
图像预处理
为了提高每个图像堆栈中精细细节的视觉显著性，图像堆栈的初始预处理涉及基于期望最大化例程（Autoquant的Autodeblur）的盲反褶积。然后，我们使用ImageJ的TurboReg插件例程对齐在组织中相同深度采集的所有单个图像。最后，我们对排列的堆栈的像素强度进行了平均，得到了一个堆栈，用于后续分析。
树突棘评分
我们使用一个定制的MATLAB界面对脊椎进行评分，该界面支持使用计算机鼠标手动标记脊椎，测量树突长度和脊椎位置，以及对齐图像堆栈的延时集。对于监测到的每个组织区域，我们加载了所有随时间变化的图像堆栈，这样堆栈的时间顺序得以保留，但实验者在脊椎评分时对其图像采集日期一无所知。我们排除了质量不足以对脊椎评分的图像进行评分。
我们的得分与之前的工作类似32但做了一些修改。只有当突起从树突轴横向延伸>0.4μm时，我们才将其标记为树突棘(). 我们在分析中没有包括<0.4μm的突出物(). 当脊椎首次出现在延时图像数据中时，我们为其指定了一个唯一的身份。如果有问题的脊椎与其相邻的两三个脊椎之间的距离稳定，我们可以在连续的时间点上保持脊椎的身份。在模棱两可的情况下（这几乎不是标准情况），我们要求稳定性小于2μm。
存活分数，S公司(t吨)，时间t吨被定义为在第一个成像日出现的同时也出现了一段时间的脊椎的分数t吨稍后。为了达到保守估计(例如下限）非永久性脊椎的比例，在计算中S公司(t吨)我们处理了18%的复发性脊柱错位(和)以以下方式。检查间隔采集的图像对时t吨除此之外，我们故意不区分第二张图像中是包含原始脊椎还是替换脊椎在同一位置。因此，该方法低估了根据以下分析推断的脊柱翻转S公司(t吨)这意味着我们关于CA1脊椎无常的结论不仅在数学上是保守的，而且对于任何评分错误都是稳健的，在这些错误中，我们可能错误地错过了一个事实上一直持续到后续成像阶段的脊椎。
周转率被定义为两个连续时间点之间获得和损失的脊椎总数，通过这些时间点出现的脊椎总数量进行归一化。脊柱丢失或增加分别定义为在两个连续时间点之间丢失或增加的脊柱数量，通过这些时间点存在的脊柱总数进行归一化。
为了粗略估计脊椎体积，对于稳定的脊椎，我们在脊椎头部出现在其最大直径的轴向截面中手动绘制的感兴趣区域（ROI）内测定了每个脊椎的荧光。我们通过将ROI移动到附近树状轴内获得的荧光值对该值进行了标准化（如参考文献。7).
统计分析
为了测试脊柱密度、周转率和存活分数随时间的变化或不同组之间的差异，我们使用了非参数双边统计检验（Wilcoxon signed-rank和Kruskall-Wallis ANOVA检验）为了避免对正态性的假设和多重比较的Dunn-Šidák校正，选择样本大小以匹配已发表的工作7–9.
为了将实验测量的脊椎存活率与动力学模型的理论预测进行比较，我们通过使用简化的chi-squared统计量和log-likelihood函数（补充文本，§VI）评估了每种模型的椎骨质量。存活分数的平均值和协方差取决于模型参数，并影响了鱼片的质量（补充材料，附录四）。我们还要求描述解析两个脊椎所需最小分离的参数为0.5–1μm mm（此最小分离的其他值不可信）（补充文本，§VI）。
模拟数据集
我们根据先前的测量结果建立了显微镜的光学模型14并调整脊椎翻转、脊椎几何形状和树枝晶几何形状的动力学，以生成数据分析员判断与实际数据相似的模拟图像序列（补充文本，§II和). 在一些数据集中，我们将模拟的脊柱动力学与从我们的体内测量值。
