不同肿瘤基质结构的人非小细胞肺癌异种移植物对西地拉尼治疗的急性血管反应

集锦

摘要

1.简介

尽管癌症治疗最近取得了进展，但非小细胞肺癌（NSCLC）的5年生存率仍然很低。血管生成通过提供营养和氧气对肿瘤的生长、侵袭和转移至关重要[1],[2]，并且与NSCLC的不良预后相关[3],[4]通过酪氨酸激酶（TK）受体（包括血管内皮生长因子（VEGF）受体（VEGFR）、血小板衍生生长因子受体（PDGFR）和成纤维细胞生长因子受体[5]因此，抑制这些受体已成为一种引人注目的癌症治疗方法。事实上，抗血管生成疗法，特别是抗VEGF/VEGFR疗法，已显示出单独或联合化疗治疗NSCLC的前景[6],[7],[8]然而，尽管在临床上有一些益处，但个体对抗血管生成药物的反应是可变的，许多患者未能受益。不幸的是，目前还没有任何经验证的预测性生物标记物用于抗血管生成治疗的患者选择。

由于抗血管生成治疗诱导的肿瘤血管变化发生在肿瘤缩小之前，因此测量肿瘤血管的功能变化可以确定抗血管生成疗法的早期反应。动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）是一种可以检测肿瘤灌注变化的非侵入性成像方式，在临床前和临床研究中都被用于评估抗血管治疗反应[9],[10],[11],[12],[13].

根据基质结构，有人提出人类肿瘤可分为两种表型：肿瘤血管表型，其中血管分布在肿瘤细胞中，基质血管表型，血管嵌入基质中[14]重要的是，这两种表型似乎定义了肿瘤对使用抗VEGFR2抗体DC101慢性抑制VEGF吞噬的反应[14]与抗VEGFR抗体相比，VEGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）具有更广泛的药理学特征，可以抑制额外的激酶，从而对肿瘤血管产生额外的影响。然而，尚不清楚这些血管表型是否与VEGFR TKI的急性药效血管反应相关，或者血管功能的早期变化是否与肿瘤大小的后期变化相关。为了解决这些问题，我们使用Calu-3和Calu-6人类非小细胞肺癌异种移植模型分别代表基质血管和肿瘤血管表型，并用西地拉尼（一种具有抗c-Kit、PDGFR和FGFR额外活性的高效pan-VEGFR TKI）治疗荷瘤小鼠[15]Cediranib在多种临床前人类癌症模型中显示出抗血管生成和抗肿瘤活性[15]在临床试验中[16],[17],[18]在这里，我们使用DCE-MRI和免疫组织化学方法评估了塞德拉尼给药后肿瘤灌注和缺氧的变化，并将血管功能变化与塞德拉尼可抑制肿瘤生长进行了比较。

2.材料和方法

3.结果

3.1. 非小细胞肺癌异种移植物和患者样本显示出不同的肿瘤血管和间质血管表型

对Calu-3和Calu-6异种移植物进行内皮细胞标记CD31染色。与上次报告一致[14]Calu-3肿瘤表现为间质血管表型，血管仅嵌入肿瘤细胞周围广泛的促结缔组织增生基质中(图1A） ●●●●。相反，Calu-6肿瘤仅显示肿瘤血管表型，其中血管分布在肿瘤组织内(图1B） ●●●●。

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图1

非小细胞肺癌异种移植物和人类肿瘤样本中的不同血管表型。（A） Calu-3肿瘤的CD31免疫组织化学染色。（B） Calu-6肿瘤的CD31免疫组织化学染色。（C） CD31免疫组化染色在人类非小细胞肺癌肿瘤中显示混合血管表型。（D） 人非小细胞肺癌的Masson三色染色显示混合血管表型。（E） 人类非小细胞肺癌血管表型比例。（F） 非小细胞肺癌和裸鼠体内生长的其他癌症异种移植中的血管表型比例。根据CD31和Masson三色染色对表型进行评分。通过血管内红细胞的存在来鉴定功能性血管。箭头和箭头分别表示血管和基质。比例尺=100μm。

为了研究人类非小细胞肺癌血管表型的相关性，对肿瘤样本进行CD31染色(图1C） 和马森三色(图1D） ●●●●。评估的肿瘤切片的平均（±SEM）面积为1.26±0.08cm²通过血管内红细胞的存在来鉴定功能性血管。在人类非小细胞肺癌肿瘤样本中(n个=38），19例表现为间质血管表型，18例表现为混合血管表型，只有一个样本显示为肿瘤血管表型(图1E） ●●●●。具有混合血管表型的肿瘤是异质性的，血管嵌入基质的区域与血管被肿瘤细胞包围的区域相邻(图1C和D）。腺癌和鳞癌的血管表型分布相似(图1E） ●●●●。相比之下，只有2/12的NSCLC异种移植模型（HCC827，Calu-3）和1/31的其他异种移植模式（MKN-1）显示基质血管表型，总体而言，绝大多数异种移植（40/43）显示肿瘤血管表型，没有显示混合血管表型(图1F） ●●●●。

3.2. 急性西地拉尼治疗后Calu-3异种移植物对钆的摄取减少

DCE-MRI测量灌注和渗透性。因此，为了评估西地拉尼对肿瘤血管功能的影响，携带Calu-3或Calu-6异种移植物的动物接受两次西地拉尼布或载体治疗，间隔22小时。在第一次给药前2 h和第二次给药后2 h进行DCE-MRI。为DCE-MRI选择的时间点基于塞德拉尼的半衰期为22小时这一事实[25]，在小鼠单次口服给药后2小时达到最大效果[26]计算每只动物肿瘤的平均IAUC。Calu-3肿瘤的平均基线IAUC显著高于Calu-6肿瘤(P（P）< 0.01) (图2A） 这表明Calu-3肿瘤的灌注情况优于Calu-6肿瘤。服用西地拉尼后，Calu-3肿瘤的平均IAUC降低了55.85±4.06%（西地拉尼前与西地拉宁后：P（P）<0.001），而Calu-3肿瘤中的IAUC未受到载体治疗的显著影响(P（P）= 0.727) (图2B） ●●●●。相比之下，载药或西地拉尼治疗对Calu-6肿瘤的IAUC中位数没有显著改变（载药前与载药后：P（P）= 0.857; 赛迪拉尼布前与赛迪拉尼后：P（P）= 0.803) (图2C） ●●●●。Calu-3肿瘤在基线检查时表现出均匀和高灌注，但在西地拉尼治疗后钆摄取量急剧减少(图2D） ●●●●。基线检查时Calu-6肿瘤的边缘灌注良好，中心区域灌注不良，在西地拉尼治疗后没有改变(图2D） ●●●●。综上所述，这些数据表明Calu-3肿瘤血管对西地拉尼治疗更敏感。

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图2

非小细胞肺癌异种移植物对西地拉尼治疗的急性血管反应。对患有Calu-3或Calu-6肿瘤的小鼠在0小时和22小时分别给予西地拉尼（6 mg/kg）或溶媒治疗。在第一次治疗前2 h和第二次治疗后2 h进行DCE-MRI成像。（A） 基底部肿瘤灌注的DCE-MRI分析。与Calu-6肿瘤相比，Calu-3肿瘤对钆的吸收明显更高**P（P）<0.01（B）Calu-3异种移植物治疗前后的平均IAUC值。与基线相比，西地拉尼治疗Calu-3肿瘤的钆摄取量显著降低***P（P）<0.001（C）Calu-6异种移植物治疗前后的平均IAUC值。与基线相比，在Calu-6肿瘤中，塞迪拉尼对钆的摄取没有影响。（D） cediranib治疗前后Calu-3和Calu-6肿瘤单张切片的典型MRI图像。（E） 载体或西地拉尼治疗的Calu-3和Calu-6肿瘤的肿瘤H&E组织学染色。去细胞区域在西地拉尼治疗的Calu-3肿瘤中广泛存在，但在载体治疗的Calu-3肿瘤中罕见。经溶媒和西地拉尼治疗的Calu-6肿瘤之间的坏死分数没有差异。比例尺=100μm。

为了将IAUC的变化与组织病理学联系起来，通过H&E染色评估坏死的程度(图2E） ●●●●。车辆治疗的Calu-3肿瘤中没有明显的坏死，但西地拉尼治疗导致肿瘤中广泛的脱细胞区域，这与Calu-3 DCE-MRI图像中的低信号区域一致。相反，在载体和西地拉尼治疗的Calu-6肿瘤中均可见坏死核心，对应于Calu-6 DCE-MRI图像中的低信号中央区域。车辆治疗的Calu-6肿瘤和西地拉尼治疗的Calu-6肿瘤的坏死率没有明显差异。

3.3. 西地拉尼对Calu-3肿瘤诱导急性缺氧

为了研究肿瘤灌注变化是否导致氧合变化，通过免疫组织化学染色内源性缺氧标记物CA9评估肿瘤缺氧[27]在Calu-3和Calu-6肿瘤中，在第二次剂量塞地拉尼或载体治疗2小时后收获。CA9阳性染色在车辆治疗的Calu-3肿瘤中很少见(图3A和B），表明Calu-3肿瘤氧合良好，而经西地拉尼治疗的Calu-3瘤显示出明显高于经载体治疗的对照组的缺氧分数(P（P）< 0.001;图3A和B），表明西地拉尼治疗导致急性缺氧，与灌注减少一致。相比之下，Calu-6肿瘤的CA9染色在肿瘤的围分泌区明显(图3A） 西地拉尼和车用治疗动物的低氧分数相似（14.8±2.6%vs 12.1±0.9%；P（P）= 0.382;图3C） 表明西地拉尼对Calu-6肿瘤氧合无明显影响。

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图3

肿瘤缺氧的免疫组织化学检测。DCE-MRI后处死两种剂量的西地拉尼或载体治疗的荷瘤小鼠。肿瘤切片，CA9免疫组化鉴定缺氧。（A） 载体或西地拉尼治疗的Calu-3和Calu-6肿瘤中的CA9染色。车辆治疗的Calu-3肿瘤显示罕见的CA9染色，而西地拉尼治疗的Calu-3肿瘤显示广泛的CA9阳性区域。Calu-6肿瘤在溶媒和西地拉尼治疗的动物中显示出相似的CA9周分泌染色水平。比例尺=100μm。（B） 载体或西地拉尼治疗的Calu-3肿瘤中的缺氧部分***P（P）< 0.001. （C） 载体或西地拉尼治疗的Calu-6肿瘤中的缺氧部分。

3.4. 肿瘤灌注减少与肿瘤生长抑制相关

为了评估肿瘤灌注早期减少是否与肿瘤生长抑制相关，对患有Calu-3和Calu-6肿瘤的小鼠进行为期5天的西地拉尼治疗，并测量和绘制肿瘤体积。早在西地拉尼治疗开始后2天，Calu-3肿瘤就明显消退，并在整个治疗过程中持续存在。治疗后第4天，西地拉尼对Calu-3肿瘤的生长抑制具有统计学意义，并持续到第5天实验结束。(P（P）< 0.01) (图4A） ●●●●。然而，未观察到Calu-6肿瘤收缩。尽管西地拉尼治疗5天后有抑制Calu-6肿瘤生长的趋势(图4B） ，未达到统计显著性(P（P） = 0.07).

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图4

西地拉尼对Calu-3和Calu-6异种移植模型中肿瘤生长的影响。Calu-3或Calu-6荷瘤小鼠通过灌胃每天一次，用西地拉尼或载体治疗5天。测量肿瘤体积并绘制生长曲线。（A） Calu-3肿瘤生长曲线。与车辆治疗的对照组相比，Cediranib治疗的Calu-3肿瘤显示出明显较小的肿瘤大小和肿瘤退化**P（P）< 0.01. （B） Calu-6肿瘤生长曲线。Cediranib治疗的Calu-6肿瘤显示出生长抑制的趋势，但这没有达到统计学意义。ns：不显著。

4.讨论

有人认为，按基质结构分类的肿瘤的血管表型可以确定肿瘤对慢性VEGF靶向单一治疗的反应[14]然而，这种表型变异对VEGFR TKI治疗急性肿瘤血管反应的影响尚未见报道。扩展先前的研究[14]，我们分别在代表肿瘤血管和间质血管表型的两种非小细胞肺癌异种移植模型中研究了塞德拉尼的急性血管反应，并将急性血管反应与肿瘤生长抑制进行了比较。我们发现，服用西地拉尼后，Calu-3肿瘤（基质血管表型）的灌注迅速减少，导致急性缺氧（24小时内）。相比之下，西地拉尼对Calu-6肿瘤（肿瘤血管表型）的灌注和缺氧均无显著影响。此外，尽管Calu-6异种移植物中存在肿瘤生长抑制的趋势，但经过5天的西地拉尼治疗后，Calu-3异种移生物中的肿瘤消退，但Calu-6不发生。综上所述，我们的结果表明肿瘤基质结构可能与VEGFR TKI的急性肿瘤血管反应有关。

先前的基因表达分析表明，肿瘤的两种血管表型表现出不同的基因表达谱[14]与肿瘤血管表型相比，具有基质血管的肿瘤表达与基质细胞募集相关的某些基因水平更高，最显著的是PDGF和FGF[14]此外，肿瘤血管表型的血管系统趋向于无周细胞，而基质血管表型的管道系统被周细胞覆盖[14]周细胞覆盖的血管对VEGF抑制不太敏感，但同时抑制周细胞表达的PDGFR可改善抗VEGF/VEGFR治疗[28]因此，西地拉尼通过抑制pan-VEGFR、PDGFR和FGFR治疗对间质血管表型肿瘤的疗效可能比使用高选择性VEGFR2-signaling抑制剂（如DC101）的疗效更大。

急性血管反应是血管破裂剂（VDA）的特征[29]我们的数据表明，西地拉尼可能在Calu-3异种移植物的基质血管系统上起到了VDA的作用，至少部分是这样。然而，VEGFR2阻断抗体DC101在Calu-3异种移植模型中没有显示出显著作用[14]这表明，在该模型中，可能需要抑制其他VEGF受体、PDGFR和FGFR信号来严重破坏血管功能。

相反，使用DCE-MRI在Calu-6肿瘤中未检测到急性西地拉尼治疗的显著效果。此前有报道称，西地拉尼布诱导的血管修剪仅在Calu-6-肿瘤的外围明显[26]由于血管修剪优先发生在未成熟或无功能的血管中[30]，西地拉尼治疗对已建立的功能性肿瘤血管系统的总体影响可能局限于Calu-6异种移植物，因此无法通过DCE-MRI检测到[31]，西地拉尼治疗减少K（K）^反式作为肿瘤灌注和血管通透性的生物标志物，在Calu-6异种移植物治疗3或5天后，表明更长期的西地拉尼治疗可以产生显著的抗血管作用。尽管如此，与我们的研究一致，在塞德拉尼治疗的5天内未观察到肿瘤生长抑制。这与其他发现一致，即仅在接受DC101治疗2周后，Calu-6异种移植物中出现显著的肿瘤生长抑制[14]这些结果表明，Calu-6异种移植瘤对西地拉尼治疗的反应是人类肿瘤异种移植中VEGF信号抑制的特征，因此需要更长时间的治疗[32]与血管通透性变化相关，增加了血管正常化[33]和抑制新生血管的发育[34].

尽管NSCLC和其他癌症的异种移植物模型表现出不同的血管表型，但如我们的研究所示，人类NSCLC肿瘤在组织学上是异质的：高比例的肿瘤具有混合血管表型，肿瘤血管和基质血管表型都存在于同一肿瘤中。此外，在我们的分析中，与10/12个非小细胞肺癌异种移植模型相比，只有1/38的人类非小细胞肝癌肿瘤样本具有主要的肿瘤血管表型。这表明异种移植物模型中的肿瘤血管系统并不能很好地代表临床情况。因此，在临床上，通过肿瘤基质结构来定义患者亚组可能很困难，尤其是在只有小规模活检的情况下。

有趣的是，与仅在肿瘤边缘灌注良好的Calu-6异种移植物相比，Calu-3肿瘤在整个肿瘤中的灌注更好、更均匀，这表明DCE-MRI可能提供一种潜在的非侵入性生物标记物来区分基质和肿瘤血管表型。据报道，肿瘤血管功能的急性变化比组织学或基因图谱的变化更能预测肿瘤生长反应[35]此外，定量DCE-MRI已用于乳腺癌异种移植，作为贝伐单抗治疗反应的早期预测[36]和新辅助化疗[37],[38]与这些发现相比，我们的研究表明，西地拉尼治疗后肿瘤灌注减少与肿瘤生长抑制增强相关，表明肿瘤灌注的急性减少可能是非小细胞肺癌血管靶向治疗反应的早期预测标志。事实上，一些证据表明，肿瘤灌注减少与肺癌对VEGF抑制剂治疗的更好反应相关。贝伐单抗治疗后，肿瘤灌注减少20%以上的非小细胞肺癌患者无进展生存期更长[39]对接受抗血管生成化疗的非小细胞肺癌患者的另一项临床研究也表明，与无反应者相比，有反应者的肿瘤血管体积显著减少[40]此外，抗血管生成治疗期间肿瘤血容量减少与肺癌患者的临床受益相关[41].

值得注意的是，灌注减少可导致急性缺氧，如Calu-3肿瘤所示。当抗VEGF/VEGFR治疗与放疗或化疗相结合时，缺氧增加可能会降低细胞毒性治疗的疗效。然而，一些研究表明，即使在抗血管生成治疗导致肿瘤缺氧的情况下，联合化疗仍然可以增强抗肿瘤效果[42],[43]其潜在机制可能与缺氧无关。未来的研究需要探索西地拉尼联合化疗或放疗治疗肺癌的效果。

在这项研究中，在两个非小细胞肺癌异种移植模型中评估了西地拉尼的急性血管反应。未来的研究需要评估肺癌和其他肿瘤类型的广泛异种移植模型。此外，确定非小细胞肺癌患者对VEGFR TKI的急性血管反应与长期预后之间的相关性也很有意义。

总之，我们认为肿瘤基质结构可能影响肿瘤血管对VEGFR TKI治疗的反应，肿瘤灌注的急性变化可能预示着NSCLC中肿瘤对VEGFR-TKI的反应。

利益冲突

未申报。

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