预处理皮质损伤降低自发性高血压大鼠局灶性缺血时近场去极化的发生率：与先前麻醉的相互作用和高血糖的影响

预处理病变

基于病变的预处理模型的基本原理是通过观察发现，一部分动物在接受手术以产生预处理大脑中动脉（MCA）闭塞时表现出附带的皮质损伤，通常与同侧CBF降低有关。²³相对较大的此类病变及其对灌注的影响的示例如所示图1（上部面板）。在目前的研究中，故意CL取代了这些相对罕见、不可预测的事件。

在单独的窗口中打开

图1

预处理手术或冷冻损伤后的皮层损伤及其对脑血流（CBF）的影响。苏木精-伊红染色切片显示大脑中动脉（MCA）缺血预处理（IPC）或故意低温损伤（CL）24小时后皮质损伤区域（*）。较大病灶（>5mm^三)导致皮层下白质水肿，有时向相反方向扩散（长箭头）。同一节段的CBF放射自显影显示局部充血，但手术损伤或较大CL后更普遍的CBF减少（比较同侧和对侧相应位置的信号强度，箭头）。

用1%至2%的氟烷或异氟烷在70%N中麻醉动物并进行通气₂，30%O₂用直肠探头监测体温，并通过反馈控制的加热垫和红外线灯将体温维持在37°C，直到完全从麻醉中恢复。暴露颅骨，并在颞叶MCA区域皮质上缩小直径为3mm的窗口，直到大脑表面血管均匀可见，在此期间，通过恒温盐水滴注维持温度（TC-324B，华纳仪器公司，美国康涅狄格州哈姆登）。将一个在液氮中冷却的直径为2 mm的不锈钢探头应用于变薄的颅骨10秒钟。假动物接受相同的手术，不使用探针。切口用外科缝线缝合，并用聚维酮/碘擦拭，动物皮下注射丁丙诺啡（0.05 mg/kg）。停止麻醉，动物脱离呼吸器，恢复意识和热平衡，然后返回笼子。总麻醉时间平均为20分钟。

预处理损伤的位置通常位于MCA闭塞部位的腹侧3mm和尾侧1mm处，对应于大约7 mm外侧、1 mm尾侧至角的立体定位坐标(图1，中间面板）。初步研究检查了在包括额叶皮层在内的其他部位进行放置的效果，如之前涉及高渗病变的研究所使用的效果。²⁴在这些部位观察到的效果不太稳定，由于SHR中梗死面积较大，病灶和梗死边界有时重叠，使定量测量变得复杂。当置于所选位置时，预处理损伤区域始终保持在最终梗死边缘内。在初步研究中，冷冻时间不同，以产生一系列病变大小。小的病变仅限于皮质，对远离病变部位的CBF没有影响(图1，中间面板）。大病灶（>5mm^三)与皮质下白质水肿相关，在严重病例中向对侧扩散，导致同侧基线灌注普遍减少(图1，下部面板）。由于在用于CBF放射自显影或梗死评估的冰冻切片中很容易检测到白质受累，因此在预处理研究的分析中可以排除出现这种水肿的大脑。

修复后畜牧业

喂食动物会产生预处理损伤，但所有实验组的大鼠在MCA闭塞前隔夜禁食。在幼稚的动物中，这一过程成功地避免了公认的异氟醚的高血糖效应。然而，在初步研究中发现，Sham组和CL组在异氟烷麻醉的第二个间歇期，甚至在禁食时，血糖水平都会升高(图2，上部面板）。这种效应最显著的部分与丁丙诺啡镇痛有关，并继发于之前描述的异食癖行为，导致床上用品消耗和胃肠道疼痛。²⁸将动物关在线下笼中过夜，将葡萄糖水平恢复到不含丁丙诺啡时的水平，可以减弱这种影响。然而，先前手术的动物可能会出现中度高血糖，与镇痛效果无关。长期以来，人们认识到，在局部缺血期间，严重的高血糖可以阻止PIDs的发生，²最近的研究表明，高血糖既提高了皮层扩散抑制的刺激阈值，又降低了去极化频率。²⁹根据Sham和CL动物的PID发病率均低于该阈值的观察结果，血糖水平高于10 mmol/L的大鼠被排除在当前研究之外(图2，下部面板）。

在单独的窗口中打开

图2

术前手术后高血糖及其对近场去极化（PID）发生率的影响。上图：在幼年大鼠中，在异氟烷麻醉前隔夜禁食可以充分维持血糖。然而，前一天经历过麻醉和手术的动物的血糖水平往往较高（Sham和低温损伤（CL）组的汇总数据）。当这些动物服用丁丙诺啡时，观察到明显的高血糖。在首次手术后，为了防止寝具消耗，将大鼠关在线下笼子中，这一现象有所减弱，但相对于原始范围（阴影条），葡萄糖水平仍然升高，正如在没有丁丙诺啡的情况下所观察到的那样。下面板：Sham组和CL组的PID值均随着血糖水平的升高而降低。选择10mmol/L的阈值纳入研究，以最大限度地减少高血糖对PID发病率的混杂影响。

永久性局部缺血

局灶性脑缺血是由右大脑中动脉和同侧颈总动脉（CCA）的串联闭塞引起的，基本上如前所述。^20,30对动物进行麻醉和通风，并按照上述要求控制温度。放置尾动脉插管（PE-50）以监测血压并定期采样以测量血气、pH值和葡萄糖水平(补充表S1和S2,补充数据). 暴露右侧CCA并在两次结扎之间烧灼。通过解剖颞肌和咬肌，并在颞鳞状骨上钻一个2毫米的毛刺孔，右侧MCA暴露在鼻腔裂水平。MCA被一个微操作器控制的铁丝钩缠住，提升约1 mm，然后烧灼以产生永久性局灶性脑缺血。

切口用缝合线缝合，并用聚维酮/碘擦洗。对于梗死体积和放射自显影CBF的存活研究，动物常规接受皮下丁丙诺啡（0.05 mg/kg）。停止麻醉，动物脱离呼吸机，恢复意识和热平衡，然后返回笼子。

组织学分析

MCA闭塞后24小时，在氟烷或异氟烷麻醉下将动物斩首。快速解剖大脑，在−40°C的己烷中冷冻，并在−70°C的温度下保存。冠状切面（20μm） 在-20°C的低温恒温器中切割，并在MCA区域范围内以1 mm的间隔收集。将载玻片在95%乙醇中短暂固定，并用苏木精和伊红染色，然后收集校准图像（NIH图像）。将各节段的苍白梗死面积相加，以确定梗死体积（单位：立方毫米）。水肿体积通过缺血半球和对侧半球之间皮质体积的差异计算，并从总梗死体积中减去，得出校正的梗死体积。

放射自显影脑血流测量

使用4-碘-[N-甲基]指示剂分馏技术评估脑血流量-¹⁴C] 如前所述，安替比林（Perkin-Elmer Life Sciences，Boston，MA，USA）作为可扩散示踪剂。²⁰在手术过程中放置股动脉和静脉插管以产生MCA闭塞，或在未受缺血影响的动物中进行示踪剂输注前约3小时的单独手术。在短暂束缚下对清醒动物进行血流测量。同位素作为静脉团注（15μ使用可编程泵（SP230iw，美国佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）以1 mL/min的恒定速率将动脉血抽取到含有肝素化盐水的注射器中。同位素注射约6秒后，将动物斩首，同时停止泵。大脑被迅速移除，并在−40°C的正己烷中冷冻，并储存在−70°C的温度下。将采集的血液与盐水冲洗液一起转移到预先称重的试管中，并重新称重以确定总体积，假设密度为1.05 g/mLμ五十） 用0.2 mL H脱色₂O（运行）₂与7 mL闪烁液（Ultima Gold，Packard Instrument Company，Meriden，CT，USA）混合，通过闪烁计数测定放射性。冠状脑切片（20μm） 在−20°C下连续切割，并在MCA范围内以0.5 mm的间隔收集。将其融化后贴在载玻片上，与柯达Biomax MR胶片接触7天¹⁴C标准（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA），之后使用NIH Image捕获并存储校准图像。在中风研究中，CBF低于30 mL/100 g/min的皮层区域，以前被确定为与该模型中的梗死可靠相关的阈值，²⁰整合所有截面以得出缺血区域的体积。通过测定病变部位同侧背侧皮层的头侧和尾侧区域以及相应的对侧位置的CBF来评估病变对基线灌注的影响，并确定每只动物的平均比率。

灌注成像

如前所述，灌注不足分布以及CBF对PID的反应的实时成像是通过散斑对比灌注成像，使用商用仪器包（Full-field Laser perfusion imaging system，Moor Instruments Inc.，Wilmington，DE，USA）完成的。⁵用异氟醚麻醉大鼠，进行通气，并按上述方法准备封堵。此外，颅骨的背侧表面暴露并双侧变薄，直到表面血管系统均匀可见。在这个过程中，异氟醚水平暂时增加到约3%，将血压降低到90至100毫米汞柱，并将出血降至最低。输送一股加热的盐水，以保持37°C的表面温度。在152×113像素的区域内采集图像，采样率为25 Hz，曝光时间为4 ms，时间常数为1.0秒。在三个同侧和两个对侧位置连续记录感兴趣区域，避开主要血管。以30秒的间隔保存全场图像。在基线记录1小时后，动脉闭塞，动物重新定位，并额外监测4小时。一些大鼠维持在异氟醚麻醉下，而其他大鼠则过渡到α-闭塞和重新定位后的氯醛糖（5分钟内静脉注射50 mg/kg，然后从1小时开始每小时注射30 mg/kg），作为2-羟丙基-β-环糊精复合物（Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国）。

使用存储的图像，在MCA区域内侧边缘以兴趣区为中心的外侧2.5 mm、前角尾侧3至4 mm的区域，得出定量的区域CBF估计值(图3，面板A）。调整Rostro-caudal位置以避开主要血管。该区域已在之前的研究中确定，以达到梗死阈值附近的流量值，并使用该研究中建立的经验校准计算CBF。⁵在记录的轨迹中，近场去极化被确定为局限于同侧皮层的短暂充血事件，每一次都被证实为序列存储图像中的传播灌注反应(图3面板B和C）。

在单独的窗口中打开

图3

半影脑血流（CBF）和近场去极化（PID）相关充血瞬变的灌注成像。(A类)闭塞期间CBF缺陷的分布。图中显示了一只幼稚动物（左）和一只先前错误操作的动物（右）的典型斑点对比灌注图像，这两种动物在局灶性缺血期间均保持在异氟醚麻醉下。圆圈识别大脑中动脉（MCA）区域边缘的感兴趣区域，用于定量比较，该区域在梗死灌注阈值附近的幼年动物中具有流量值。比例尺显示了使用先前研究中导出的放射自显影CBF进行的校准。⁵(B类)PID相关充血。以1分钟间隔获得的差异图像显示了缺血区域边缘PID相关血流瞬变的嘴-尾迁移。(C)PID记录。典型的轨迹说明了MCA闭塞期间发生的一系列与PID相关的充血事件。

病变大小和基线影响

由于CBF的变化在明确的组织学划分之前就预测了梗死的分布，因此可以评估其对先前病变大小的依赖性。预处理效果，如闭塞后3小时灌注不足体积所示，与检查范围内的病变大小无关(图5，上部面板）。在2至5毫米的大鼠身上表现出强大的保护作用^三持续低于基线CBF影响阈值的病变(图5，中间面板）。在异氟醚麻醉下监测时，影响基线CBF的大病灶也可消除PID(图5，下部面板）。由于所有表现出灌注不对称性和总体PID抑制的动物都表现出白质水肿，因此这些都被排除在预处理研究之外。因此，观察到的保护作用与基线灌注的变化无关。

在单独的窗口中打开

图5

病变大小对预处理疗效、基线灌注和近场去极化（PID）发生率的影响。上面板：为提供缺血区域数据的动物测定预处理损伤的体积图4观察到小到2 mm的病变有保护作用^三并且不随病变大小而变化。请注意，出现白质水肿的动物被排除在本分析之外（参见图1). 中间面板：不同的冷冻条件产生不同大小的冷损伤，24小时后比较同侧和对侧皮层的脑血流（CBF）。对于大于5mm的病变，同侧CBF的减少变得显著^三这种不对称性总是与皮质下白质水肿有关。下面板：大病灶导致白质水肿，这会降低基线灌注，也消除了随后闭塞期间PIDs的发生。在异氟醚麻醉下监测时，具有保护性小损伤的动物的PID发病率与假手术组相当。CL，低温损伤。

病变诱导预处理模型的原理

先前的研究显示SHR短暂局灶性缺血后保护作用呈双峰分布，²⁰这反映了麻醉暴露和偶然的皮层损伤的交互作用。²³尽管很少强调，但在大多数预处理损伤后，经常会出现一定程度的组织损伤。³¹据报道，大脑皮层受到有意的高渗损伤，²⁴并解释KCl应用引起的皮层扩散抑制的保护作用。³²然而，传播去极化可能对海马预适应至关重要，³³氯化钠引起的局部损伤没有相关的去极化，似乎足以在随后的局灶性缺血后提供皮质保护。²⁴低温损伤是产生离散性皮层损伤的既定方法，已广泛应用于脑病理生理学研究。³⁴通过大鼠颅骨变薄可以产生受控损伤，从而最大限度地减少手术的侵入性和所需的麻醉时间。

对基线脑血流和代谢的影响以及病灶大小的影响

缺血预处理观察结果²⁰3小时灌注不足的分布提供了早期保护效果的指标(图4)从而可以在用于CBF放射自显影的相同切片中测量先前产生的病灶的大小和分布。重要的是，对于低于影响基线CBF阈值的小病灶，可以显示预处理效应(图5). 这表明，当前研究中所述的皮层保护并不次于基线活动和代谢需求的持续减少。

早期检查CL对CBF和代谢的影响，发现葡萄糖利用率下降，但CBF没有下降，²⁵而在我们手中，CBF显然是一个敏感参数(图5). 随后对高渗病变进行的独立评估发现，高渗病变会影响葡萄糖利用率²⁶和CBF²⁴在侮辱之后至少3天。在这种损伤后，灌注和代谢似乎保持耦合，并且病变大小或位置的未识别变化可能是先前CL研究中报告的分离的原因。例如，皮层电极穿透在6小时内恢复后，急性CBF降低。³⁵微透析探针放置的类似效果更持久，但在24小时内表现出相当大的恢复，³⁶随后使用KCl微透析对CSD预处理进行了描述，结果显示探针放置位置周围存在小的组织学损伤，但对3天时的基线CBF没有影响。³⁷因此，恢复时间进程可能对病变大小敏感。代谢或灌注对额叶病变部位有影响²⁴或尾侧^25,26与本文所用的结果相比，在所有情况下，病变部位都可能影响此类效应的绝对大小阈值。

大病变动物中PID的完全消除令人震惊(图5). 这些是在一些初步实验中有意制作的，以检查病变大小的影响，其中所有灌注成像都是在异氟醚麻醉下进行的。在随后的预处理研究中α-氯醛糖，所以在有利于增加PID发病率的条件下，是否会观察到如此深远的影响尚不清楚。与大病灶相关的白质水肿是否对PID衰减有直接作用尚不清楚。

围梗塞期去极化、血糖和麻醉/镇痛管理

麻醉对PID的影响已经被认识了一段时间。挥发性麻醉药（如氟烷和异氟醚）相对于在α-氯醛糖，^5,38后者可被视为此类研究的首选麻醉剂。³⁹然而，与反复使用挥发性麻醉药具体相关的对PID的影响之前尚未描述。

高血糖是异氟醚麻醉的公认并发症，通常可以通过隔夜禁食来缓解。然而，当之前禁食的动物再次接受第二次手术时，血糖水平往往会升高，术后使用丁丙诺啡镇痛后，血糖明显升高(图2). 后者显然与预期通宵禁食期间的床上用品消耗压力（pica）有关，这是之前给大鼠服用该药物后描述的行为。²⁸显然，在今后这类研究中考虑替代性止痛药是至关重要的。然而，即使没有术后镇痛，也可以观察到适度的血糖升高(图2)因此，它的潜在影响必须在任何涉及重复手术的研究背景下进行检查。众所周知，高血糖对减少缺血期间扩散性抑郁或PID发病率的影响，^2,29尽管PID对血糖适度升高的敏感性似乎没有得到广泛认可。在高血糖缺血的特定情况下，这种效应可能由组织pH值的相关降低介导，已知这会增加去极化阈值。⁴⁰

先前对清醒动物进行的CBF放射自显影研究表明，局部缺血预处理的动物在闭塞后1.5小时至3小时内半影灌注延迟恢复。²⁰在CL预处理后观察到同样的现象（图4). 之前的报告还显示，在激光多普勒成像期间，闭塞后在氟烷麻醉下维持的预处理大鼠的半影CBF恢复。²⁰然而，该评估并未包括一个假手术组，目前的结果表明，即使是一个简单的假手术也足以改善动物在成像过程中在相同的挥发性麻醉剂下的灌注(图6). 初步实验表明，单独插管和麻醉暴露可以复制假手术的影响（未显示），这表明PID降低构成了一种麻醉预适应现象。重要的是，当动物保持在α-闭塞术后氯醛糖麻醉(图6). 因此，目前的结果进一步表明，这种预处理并不代表对中风病理生理学的直接影响，而中风病理生理可能会在麻醉条件下传播。相反，先前接触异氟醚会影响随后接触同一制剂的影响。

在第二次接触异氟醚期间，这种差异反应的机制尚不清楚。实际上，当大鼠在随后的闭塞手术后能够迅速从麻醉中恢复时，病变产生所需的相对较短的异氟醚麻醉间隔似乎影响最小(图4). 当维持麻醉进行灌注成像时，其对PID数和灌注的影响变得突出(图6). 因此，在实验条件下，如在许多短暂缺血模型中，这种麻醉预处理效应可能会对梗塞体积产生最大的影响，而实验条件涉及阻塞期间的长时间麻醉。在当前研究的背景下，颅骨准备所需的相对较长的深度异氟醚麻醉间隔可能会进一步增加相互作用的可能性。