自然。作者手稿；PMC 2016年3月17日提供。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院713161
运动皮层突触记忆痕迹的标记和光学擦除
,1,6 ,1,5 ,1 ,1 ,三，4 ,2,4 ,2,4 ,三，4和1,5
Akiko Hayashi-Takagi先生
1东京大学医学院疾病生物学和综合医学中心结构生理学实验室，东京文京区，东京113-0033
6日本科学技术署PRESTO，4-1-8 Honcho，Kawaguchi，Saitama 332-0012，Japan
Sho Yagishita公司
1东京大学医学院疾病生物学和综合医学中心结构生理学实验室，东京文京区，东京113-0033
5CREST，日本科学技术署，4-1-8 Honcho，Kawaguchi，Saitama 332-0012，日本
中村真美
1东京大学医学院疾病生物学和综合医学中心结构生理学实验室，东京文京区，东京113-0033
福寿寿司（Fukutoshi Shirai）
1东京大学医学院疾病生物学和综合医学中心结构生理学实验室，东京文京区，东京113-0033
易武
三美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗来纳大学药理学系，27599
4美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学Lineberger综合癌症中心，27599
阿曼达·L·洛斯鲍（Amanda L.Loshbaugh）
2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学生物化学和生物物理系，27599
4美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学Lineberger综合癌症中心，27599
布莱恩·库尔曼
2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学生物化学和生物物理系，27599
4美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学Lineberger综合癌症中心，27599
克劳斯·M·哈恩
三美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学药理学系，27599
4美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学Lineberger综合癌症中心，27599
哈罗·卡赛
1东京大学医学院疾病生物学和综合医学中心结构生理学实验室，东京文京区，东京113-0033
5CREST，日本科学技术厅，4-1-8 Honcho，Kawaguchi，Saitama 332-0012，日本
1东京大学医学院疾病生物学和综合医学中心结构生理学实验室，东京文京区，东京113-0033
2美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学生物化学和生物物理系，27599
三美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学药理学系，27599
4美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学Lineberger综合癌症中心，27599
5CREST，日本科学技术署，4-1-8 Honcho，Kawaguchi，Saitama 332-0012，日本
6日本科学技术署PRESTO，4-1-8 Honcho，Kawaguchi，Saitama 332-0012，Japan
总结
树突状棘是突触可塑性的主要位点，被认为是记忆的可能结构相关物。尽管如此，对大脑皮层中特定的脊髓亚群进行系统操作是不可能的，因此，脊髓与记忆之间的联系是相关的。我们开发了一种新型突触光探针AS-PaRac1（激活的突触靶向光激活Rac1），它可以特异性标记最近增强的脊髓，并诱导含有AS-PaRac1的脊髓选择性收缩。体内AS-PaRac1的成像显示，运动学习在一小部分神经元中诱导了实质性的突触重塑。获得性运动学习被增强的脊椎的光学收缩所干扰，而它不受同一皮层区域不同运动任务诱发的脊椎相同操作的影响。综上所述，我们的结果表明，新获得的运动技能取决于特定任务密集突触群的形成。
光遗传学是控制神经元动作电位的有力工具1,2，并用于演示单元程序集在表示内存痕迹中的关键作用三然而，由于目前可用的探针的空间分辨率的限制，单个树突棘的操作，兴奋性突触的主要位点4–6一直不可行，阻碍了对学习过程中突触重组的全面理解。因此，对于脊椎特定的光控制，我们利用了脊椎的结构特性：脊椎体积和功能之间的紧密关联4–7因为小GTPase Rac1的长时间激活会导致脊柱收缩8–11，我们使用了一种光活化形式的Rac1（PaRac1）12诱导脊椎收缩，使我们能够用光控制突触传递。此外，长期以来，有人认为记忆轨迹是分配给特定神经元和神经回路的棘的13,14这里，我们将PaRac1靶向激活的突触（激活的突触体靶向PaRac2，AS-PaRac1），以建立一种称为“突触光遗传学”的新方法，以便可视化和操纵记忆痕迹。
AS-PaRac1标记增强的棘
我们首先重新设计了最初的PaRac1构造12为突触操作优化其特性。如等温滴定量热法（ITC）、神经元形态和免疫共沉淀所示，在原始结构中引入L514K和L531E突变显著降低了黑暗中不需要的Rac1背景活性(). 接下来，将PaRac1与PSD-95缺失突变体融合（PSDΔ1.2）15，已知其集中在突触后位置，但不能与主要PDZ结合蛋白结合，从而将PSD-95过度表达的不良影响降至最低。一个富集指数，即突触定位与树突轴定位的定量比值（参见方法），支持PSD-PaRac1在突触中的有效积累，尤其是在脊椎尖端(，结构体B），与内源性PSD-95高度共定位，但没有轴突标记(). 最后，对于神经元输入的特异性，我们利用了弧信使核糖核酸16以NMDA受体依赖的方式对突触激活作出反应，选择性靶向并在激活的树突状节段中翻译17–19有趣的是，PSD-PaRac1-DTE稀疏标记的棘(，构造C，箭头）。使用热点指数（见方法）进行量化，该指数表明PaRac1变异体的分布如何不均匀，表明PSDΔ1.2和DTE对这种特征分布都是必要的(，构造C和E）。因此，PSDΔ1.2和DTE的组合被称为“as（激活突触靶向）盒”，与as盒侧翼的PaRac1序列被命名为as-PaRac1(，构造C）。
海马薄片培养中AS-PaRac1对树突棘的电位依赖性积累一，探针离散分布的基本域映射（箭头）。b条，在存在或不存在福斯科林（FSK）和茴香霉素的情况下，谷氨酸去壳（箭头）增强单棘的典型图像。c、 天、脊柱头部容积的时间进程(c（c）)和AS-PaRac1积累(d日). 受刺激或邻近脊椎的平均变化为60分钟后的无盖状态。e（电子），lactacystin对AS-PaRac1（箭头）离散累积的影响。比例尺，2μm。统计方法/结果的详细信息在。
接下来，我们试图解开这个新突触探针的标签。荷包牡丹碱可增加神经元兴奋，显著增加含有AS-PaRac1的棘的数量，热点指数的降低表明，荷包牡蛎碱治疗后AS-PaRac1的分布变得相对均匀。相反，河豚毒素（TTX）对动作电位的阻断减少了探针的积累，导致探针的脊柱富集指数降低(). 因为这些发现表明突触激活调节AS-PaRac1的定位，我们假设AS-Rac1在最近增强的脊髓中积累。事实上，当AS-PaRac1与SEP-GluA1联合转染时，AMPA受体亚单位GluR1的突触掺入标记物（参考文献20,21)，每个脊柱内这两个探针的荧光信号显著相关(，箭头）。此外，在单棘LTP方案中，由谷氨酸去壳和腺苷酸环化酶激活剂福斯科林（FSK）诱导的蛋白质合成依赖性增强22–24诱导AS-PaRac1在受刺激脊髓中的积累，而蛋白质合成依赖性可塑性（仅谷氨酸去钙）没有。一直以来，蛋白质合成抑制剂茴香霉素可消除FSK诱导的AS-PaRac1积累(). 在邻近脊椎中未观察到AS-PaRac1荧光增强，这表明AS-PaRac1的积累仅限于受刺激的脊椎(). DTE序列是活性依赖性AS-PaRac1积累所必需的()支持本地翻译的AS-PaRac1，不同于身体翻译的AS-BaRacl，优先招募到增大的脊椎。PaRac1没有表现出不均匀分布，除非构造包含PSD-95域(，构造D）。因为PSD-95被蛋白酶体快速降解25，我们检测了蛋白酶体抑制剂lactacystin的作用，发现它完全破坏了探针的独特分布(). 综上所述，我们得出结论，AS-PaRac1是一种专门标记扩大和新生成脊椎的探针（参见详细的细胞机制），被称为“结构增强脊柱”，而as-PaRac1标记的增强在下文中被描述为“增强脊柱”。
AS-PaRac1脊椎标签体内
要描述此探针的特性体内，我们利用旋转训练作为运动学习的模型。因为运动学习在弧基因剔除小鼠26，我们假设AS-PaRac1由弧发起人27在学习诱导的增强过程中会增强特异性标记。Arc:：AS-PaRac1被传递到初级运动皮层（M1）的皮层II/III层，在那里，运动学习会诱导神经元回路的强大重组28–31根据之前后肢区域功能映射的立体定位坐标，进行双光子成像的颅窗手术32训练前后定量比较脊髓体积和AS-PaRac1荧光(). 与之前的调查结果一致33,34即使在无训练期间，也有相当数量的脊椎“自发”经历了结构增强（脊椎的形成或扩大；参见)，但与未经训练的小鼠相比，经过训练的小鼠表现出显著的结构增强(). 值得注意的是，训练后（0天）AS-PaRac1的突触荧光与训练后脊柱大小的变化密切相关(). AS-PaRac1的积累不太可能导致增强，也不太可能标记为增强的棘，例如“标记突触”35,36，因为学习前（-1天）AS-PaRac1的初始量与学习后脊柱大小的变化无关(). 对树突轴中AS-PaRac1点的分析表明，AS-PaRac1信号主要位于树突棘，轴突触的标记可以忽略不计(). 当我们将AS-PaRac1的阈值设置为1 a.u.时(，绿色阴影区，0天），AS-PaRac1检测到脊柱形成和扩大，灵敏度分别为83±7.9%和69±3.0%（平均值±标准误差）()，而其他脊柱类型的标记率为2.3±0.12%。由于Arc:：AS-PaRac1仅在AS-PaRac1阳性神经元中诱导，因此还计算了AS-PaRac1阳性神经元的标记特性，结果表明，对形成和扩大的敏感性分别为94±2.7%和95±4.8%，而其他脊椎类型的假标记率为12.9±4.2%（306个脊椎，3只小鼠6个AS-PaRac1阳性神经元）。因此，AS-PaRac1是增强棘的可靠标记体内试验。
AS-PaRac1标记的时空动力学体内在rotarod任务期间一，电弧启动器示意图27-驱动AS-PaRac1。b条，实验设计。c（c）脊柱形成（箭头）和脊柱扩大（箭头）的图像。绿圈，AS-PaRac1；洋红色圆圈，最初获得AP-PaRac1但后来失去它的棘，但结构变化持续存在。d日，脊椎结构变化的分数。e–g、脊柱大小量化和AS-PaRac1(e（电子）). AS-PaRac1与Δ五之后（0天，（f）)和之前（-1天，克)学习。小时，含有AS-PaRac1的棘的百分比（AS-PaRac1≥1[a.u.]，绿色阴影区域（f）).我，AS-PaRac1映射。j个、AS-PaRac1保留（绿色）或结构增强（洋红色）。k个脊柱大小的轨迹和结构增强脊柱的AS-PaRac1强度。比例尺，2μm用于c（c）; 200μm用于b条和我..
接下来，我们使用这个探针对任务诱发电位进行了广域映射(我们发现，在成像区，任务诱发电位在2.3±0.13%的脊髓和16.4±2.8%的神经元中被激发。我们追踪了几乎整个神经元图像()并证实当脊椎被AS-PaRac1标记时，其亲本躯体也表达AS-PaRac1（6个AS-PaLac1阳性躯体）。一直以来，我们在AS-PaRac1-阴性体细胞（46个阴性体细胞）中未发现AS-PaRac1-阳性棘。因此，每一个AS-PaRac1阳性神经元的AS-PaRac1点计数可以近似计算，这表明在AS-PaRac1阳性神经元中，14.7±2.01%的脊髓含有AS-PaLac1，这意味着在运动学习时，在第II/III层的小神经元群（16.4%）中诱发了脊髓的实质性重塑（14.7%）(用于详细计算）。同样，在少数V层神经元中也观察到了实质性的重塑().
表征AS-PaRac1在光激活（PA）实验中的突触保持力体内，追踪获得AS-PaRac1的单个脊椎，并从AS-PaRac1出现的那一天起将其单独标记为图标(). 我们注意到突触AS-PaRac1的持久性和结构增强在脊柱之间有显著差异：有些在训练后1天以上仍能保持(，枝晶#1），而其他则消失了(枝晶#2和#3）。重要的是，在“学习”期间触发的结构增强和AS-PaRac1标记比在无训练期间触发的更有可能被保留(、“之前”和“之后-1”）。一致地，结构增强的脊椎的纵向成像显示，大多数AS-PaRac1保留24小时的脊椎保持结构增强至少48小时(，绿色痕迹），而缺乏AS-PaRac1保留的结构增强的棘恢复到预增强状态(，黑色痕迹）。AS-PaRac1的保留可能是通过学习激活的神经元回路的回响来维持的，因为AS-PaRac1只在Arc-expressing神经元中表达，在Arc-expressing神经元内持续的激活有助于维持新皮质的可塑性变化26,37。
AS-PaRac1选择性脊柱收缩
与之前的研究结果一致，Rac1激活延长会导致脊椎收缩8–11我们发现低频PA导致脊柱收缩(). 有趣的是，与组成型启动子CAG相比，当AS-PaRac1构建物由Arc启动子驱动时，脊椎收缩显著更强。持续的神经元活动增加了Arc的表达26诱导内源性Rac1的慢性激活，可能有助于Arc:：AS-PaRac1引起强劲的脊柱收缩。PA诱导的脊柱收缩是Rac1依赖性的，因为从AS-PaRac1中删除Rac1，但保持AS-PaRac1中其他域的完整性（Arc:：PSDΔ1.2-LOV-DTE），完全破坏了收缩效应(). 在大的皮层区域实现脊柱收缩体内，将双侧光纤放置在颅窗上(;). 低频脉冲PA特别在含有AS-PaRac1的脊柱中触发收缩(). PA的作用在距硬脑膜至少100μm范围内具有可比性，这表明至少第一层的脊椎受到PA的影响(). PA诱导的脊椎收缩伴随着功能性电位降低，兴奋性突触后钙瞬变证明了这一点：脊椎收缩的程度与振幅的降低相关，但与频率的降低无关(). 脊椎收缩和随后的功能变化是脊椎特异性的，但不是分支或细胞范围的，因为脊椎收缩在相邻的AS-PaRac1阴性脊椎中没有触发，而钙瞬变在相邻的脊椎或体细胞中都没有受到影响(;和).
光活化后含AS-PaRac1脊椎的选择性收缩（PA）a、，PA图解。b、，后肢皮层区域的图像。c、，脊椎大小与PA一致。深绿色圆圈是消除脊椎的方法。d日，皮层深度对PA诱导的脊柱收缩的影响。e–j，用GCaMP6s、AS-PaRac1-Turquoise和mRFP共转染神经元。突触中GCaMP/mRFP比值（ΔR）的变化(克)和索玛(小时)被追踪。我,j个ΔV和Δ振幅之间的关系(我)，或Δ频率(j个)在PA上。圆圈1、2和S对应于脊椎#1、#2和内体克和小时.比例尺，5μm用于b条; 50μm用于e（电子），2μm用于（f）。
光学擦除所学技能
为了证明脊椎收缩对学习的影响，向小鼠双侧注射包裹I至V层的腺相关病毒（AAV）5(). 将小鼠分为两组：第一组只转染mRFP作为对照，第二组转染as-PaRac1和mRFP。训练后，两组均表现出明显更好的运动表现，但只有AS-PaRac1组的运动表现受到PA的干扰（方案#1，)PA诱导的学习中断程度（PA效应）与训练诱发的改善程度（学习成就）呈负相关(). 相比之下，对照组既没有后天学习的中断，也没有训练效果与PA之间的相关性。由于PA不影响在，PA不太可能干扰一般电机性能().
用AS-PaRac1标记的脊柱的PA对获得性学习的擦除一，实验设计（参见).b、 c、d，小鼠被分配到#1方案(b条), #2 (c（c）)，或#3(d日). 每只小鼠平均进行三次试验，作为任务表现（灰线）。e（电子）PA抹去已学技能的关键时期。（f）–小时，PA效果与学习成绩的关系。我，实验设计。j个、每项技能的表现轨迹。k个，PA对后天旋翼性能的影响与波束任务的影响无关。。
PA甚至在学习后1天就中断了后天的学习（方案#2；)当大多数激发学习的脊髓含有AS-PaRac1时(). 相反，PA治疗在学习后2天（方案#3），当含有AS-PaRac1的棘的数量和AS-PaRac1标记的强度都显著降低时(;)，它没有破坏后天的学习(). 由于每日自发增强，方案#2和#3中含有AS-PaRac1的脊椎数量相当(). 尽管如此，只有方案#2干扰了获得的技能，这表明AS-PaRac1（+1天）显示的学习诱发脊柱增强，而非自发增强（+2天），可以解释皮层记忆痕迹。
为了证明突触集合的任务特异性作用，将表达AS-PaRac1的AAV注射到双侧M1的小鼠接受双重任务方案。小鼠连续学习两种不同的后肢任务：分别在第一天和第二天学习旋转木马和光束任务(). 我们在第4天进行了PA，因为大多数旋转诱发的AS-PaRac1点刺在这个时间点消失(). 我们证实这两项任务诱发了相当数量的脊柱增强(). 虽然假PA处理（插入纤维，但未进行照明）不会影响光束任务中的学习性能，但PA会干扰光束任务中获得的性能，而不会影响旋转机器人的性能(). 我们发现PA在旋转和束任务中的作用没有相关性，这意味着每项任务招募的突触群没有重叠().
特定任务的突触集成
为了可视化在双任务学习过程中形成的突触群，小鼠被稀疏地标记为AS-PaRac1，并且它们也接受了之前描述的双任务协议(，双重任务）。AS-PaRac1 punta根据出现时间进行分类()，被图标化为旋转任务增强（第2天特定，蓝色）、光束任务增强（第一天特定，黄色）和两个时段的连续增强（第二天和第四天，绿色）。有趣的是，超过一半的波束激发增强是新的()其先前在旋转棒任务中没有增强（黄色，). 结合行为数据()，我们已经证明，这两个学习任务诱导了不同突触群的增强。
针对不同学习任务的突触群可视化a、，实验设计。Arc:：AS-PaRac1和CAG:：mRFP（填料）由子宫内电穿孔。b条，学习树突图像。AS-PaRac1 punta根据其外观和持续时间进行彩色编码。相同的色码用于c–编号。c（c）,（f）,我，AS-PaRac1的宽视图映射。d日,克,j个，每种脊椎类型的分数。e（电子）,小时,k个、脊柱大小的轨迹(五).我,米，每种情况下的不同脊柱增强。n个，新增强的脊椎的比例。比例尺，2μm用于b条; 50μm用于c（c）,（f）和我..
最后，我们检查了相同的脊髓是否被相同的任务增强。将小鼠分为2组(). 第一组在前2天接受旋转任务，随后通过PA收缩学习诱发电位，然后重新训练相同的旋转任务（再训练条件）。第二组小鼠接受旋转任务和随后的PA，并在接下来的2天内（在家中笼子条件下）不进行训练。我们发现，在重新训练后，大多数光学收缩的脊椎恢复到以前增强的大小，而在家庭笼子组中，再电位的程度明显较低，这表明再训练诱导了相同脊髓亚群的再电位(). 此外，还对分配给双任务方案的小鼠进行了比较，突出了过去2天内各组之间的增强模式差异(). 与双任务组相反，再训练组在第1次旋转木马训练期间增强的脊椎更有可能在第2次旋转木兔训练后再增强（绿色，)而未执行再训练任务的小鼠（家庭笼子组）的再电位显著降低(;). 此外，与双任务组（黄色、，). 这些发现表明，不同突触群的重组对每个学习任务都是特定的。
讨论
当前的学习和记忆模型表明，脊椎的结构可塑性是大脑中信息存储的潜在机制。尽管如此，脊椎结构的清晰可视化体内需要对神经元进行稀疏标记，并且对棘的结构变化进行分析相当费力。相反，AS-PaRac1信号显示为荧光点，即使在高转染条件下，也可以更容易地检测增强的棘。此外，在行为检查期间，可以使用PA直接评估增强脊椎的作用。在这项研究中，我们发现双侧M1皮层的光激活破坏了获得的运动技能。根据以下计算，我们估计PA影响的学习诱发神经元约为4700个：（a）×（b）×（c）×（d）×（e），其中（a）代表新皮质神经元密度，9.2×104/毫米三（参考38); （b） 光激活面积，纤芯直径=500μm，0.4 mm2/双边；（c） 感染AAV的皮质层厚度（II–V）为0.8mm；（d） AAV感染效率，80%(); （e） 学习时AS-PaRac1阳性神经元的百分比，20%(). 另一方面，由于光传输的限制，大多数收缩的脊椎位于第一层（距硬脑膜达100μm）。根据以下计算，在双侧M1皮层中，光纤照射的学习诱发棘的最小数目约为41万个：（d）×（f）×（g）×（h），其中（f）代表小鼠新皮层中兴奋性突触的密度，6.4×108/毫米三（参考38); （g） 学习诱发电位，该区域约2%的脊髓(); （h） 接受PA的脑容量：0.4 mm2PA面积×0.1 mm深度=0.04 mm三). 在第一层，介导自上而下影响的皮质反馈投射集中，强烈刺激锥体神经元亚群39通过M1皮层的突触重组，神经元集合中的学习诱发变化可直接预测未来的任务表现40由于非线性信息整合主要发生在行为动物的树突簇中41，并且簇中的几个棘的激活足以启动NMDA尖峰以产生动作电位42因此，在我们的研究中，强化棘的收缩（4700个神经元树突簇中的410000个棘）将合理地破坏特定神经元群体中学习诱发的实质性重塑。小神经元群中密集连接的形成可能与学习后运动皮层中功能性神经元簇的形成一致43因此，突触光遗传学可能是揭示突触可塑性机制及其与随后行为表现之间关系的有力工具。
方法
道德考虑
本研究中动物的使用和护理遵循东京大学医学院动物实验委员会的指导原则。
等温滴定量热法（ITC）
如前所述，进行了ITC，以检查PaRac1在亮态和暗态下与PAK1的CRIB结构域的亲和力12。
PaRac1下拉分析
通过脂质体感染（Lipofectamine）将PaRac1变体转染到HEK293细胞™2000; Invitrogen，Carlsbad，CA），将细胞分为亮组和暗组。发光组的细胞用白色荧光灯照射（10 cm培养皿为1.5 W，19±1.0 mW/cm2)在细胞裂解前10分钟，随后在连续光照下进行免疫沉淀，直到蛋白质沉淀剂的最后洗涤步骤。黑暗组的细胞在黄色荧光灯下操作，荧光灯将波长低于500 nm的光排除在外，以避免光激活。细胞在裂解缓冲液中进行裂解（150 mM NaCl、50 mM Tris·HCl[pH7.5]、1%Triton-X[v/v]、10 mM NaF、10%甘油[v/v]、1 mM EDTA和蛋白抑制剂混合物[完成；印第安纳波利斯罗氏诊断公司]）。在冰和水的混合物上间歇地对裂解液进行超声处理，并通过离心法清除细胞碎片。可溶性部分与抗GFP抗体（D253-3；MBL，日本名古屋）孵育，然后与蛋白G Sepharose（GE Healthcare，Little Chalfont，UK）共沉淀。用抗PAK1抗体（#2602；Cell Signaling，Beverly，MA）对沉淀物进行免疫印迹。使用ImageJ软件（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）测量每个波段的信号强度（减去背景信号后的净信号，背景信号来自波段附近的区域）。
免疫荧光
如前所述进行细胞染色10简单地说，21天时分离的大鼠皮层神经元体外（DIV）在室温下用4%多聚甲醛（PFA）固定30min。行为分析后，对小鼠实施安乐死，用4%PFA对其大脑进行灌注，并进行冠状切片，以获得150μm厚的切片。然后用Perm/Blocking缓冲液（2.5%正常山羊血清[v/v]，在磷酸盐缓冲液[PBS]中加入0.3%Triton X-100[v/v]）在室温下使固定样品渗透1小时。样品在4°C下与以下主要抗体孵育24小时：抗磷神经丝（SMI-31；德国达姆施塔特Merck KGaA），轴突标记物；抗PSD-95（6G6；英国剑桥Abcam）；抗Emx1（sc-28220；加州圣克鲁斯），用于锥体神经元染色。用PBS冲洗（3次，每次5分钟）后，用相应的二级抗体对切片进行染色，然后贴装。用共焦显微镜检查细胞标记（LSM510 META NLO；德国Oberkochen卡尔蔡司）。
海马切片培养和转染
用振动仪（VT1200S；德国威兹拉莱卡）从P7的SD大鼠上解剖海马薄片（350-μm厚），振动仪安装在0.4-μm的Millicell上™培养插入物（EMD Millipore，Billerica，MA）。在DIV 11中，通过PDS1000/He Biolistic Gene Gun（Bio-Rad，Hercules，CA）和1.6μm金微载体对切片进行生物转染。转染后2-4天，将培养物转移到记录室，并持续灌注含氧人工脑脊液（ACSF，95%O2和5%CO2)含有125 mM NaCl、2.5 mM KCl、2 mM CaCl2，1 mM氯化镁2，1.25 mM NaH2人事军官4，26 mM氯化钠三29–30°C下，20 mM葡萄糖和200μM Trolox（西格玛阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）。在一些实验中，我们向培养基和记录介质中添加河豚毒素（日本大阪和谷，1μM）、甲碘化荷包牡丹碱（Sigma-Aldrich，12μM）和乳酸菌素（EMD-Millipore，10μM）。
子宫内电穿孔
该程序是根据已发布的协议执行的，只做了少量修改11简单地说，怀孕的C57BL/6小鼠在胚胎第13天（E13）或第14.5天（E14.5）用异氟醚麻醉，AS-PaRac1-Venus和填充物（各2μg）单侧注射到心室。电极脉冲（电极：E13为φ3 mm，E14.5为φ5 mm，33 V，50 ms脉冲长度，950 ms脉冲间隔，4个脉冲）单边充电，靶向M1皮层。
AAV病毒生产
AAV病毒生产采用AAV无帮助系统（安捷伦科技，加州圣克拉拉）。pRep-Cap（AAV5；Applied Viromics，Fremont，CA）和pHelper质粒与聚乙烯亚胺“Max”（Polysciences，Warrington，PA）共同转染到AAV-293细胞中。培养72小时后，收集细胞并进行五次冻融循环。将所得上清液覆盖在含有100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl和0.01%BSA（v/v）的40%蔗糖溶液上，并在4°C下以100000 g离心16 h。将颗粒（粗病毒颗粒）在37°C下用1000U苯甲酸酶核酸酶（威斯康星州麦迪逊市Novagen）处理1小时。通过5μm注射器过滤器过滤以去除碎屑后，将过滤材料在257300 g、15°C下进行CsCl梯度离心（1.25 g/ml和1.50 g/ml）48 h。恢复富含病毒的部分，并用ASCF（1 mM MgCl）替换溶剂2，10 mM HEPES，氯化钙2-免费）。用定量实时PCR分析测定病毒滴度（SYBR Green；Takara Bio Inc.，Shiga，Japan）。
病毒注射与开颅手术
用异氟醚麻醉成年雄性C57BL/6小鼠，并腹腔注射甘露醇（4μg/g体重）和地塞米松（7μg/g重量）以防止脑肿胀。从手术前1天开始，连续4天皮下注射酮洛芬（40μg/g体重）和青霉素/链霉素（4 U/g体重），以防止炎症。根据立体定向坐标，头骨暴露在M1皮层上。然后，1μl AAV（0.5至4.0×1013基因组拷贝数/ml）用玻璃吸管（针尖直径30μm，斜角45°）以150 nl/min的速度用注射泵（Legato130；日本东京室町Kikai）注入M1皮层。通过使用来自颅骨的立体定位坐标（AP=-0.8；ML=+1.0；DV=+0.5），在动物中标准化注射部位的位置。注射结束后，我们等待5分钟，然后收回吸管。使用不锈钢环钻（φ2.7 mm；Fine Science Tools，Foster City，CA）制作圆形开放颅骨窗。为了避免大脑损伤，以10000 rpm的速度进行间歇钻孔，并持续温和灌注含氧ACSF，我们尽量避免在颅骨上施加过大的钻孔压力。如果我们没有检测到出血，则用圆形盖玻片（φ2.7 mm，厚度<0.1 mm，松下玻璃，Kishiwada，日本）覆盖钻孔，并用牙科水泥（Fuji Lute BC；GC，日本东京）密封，然后安装头盔体内成像。
双光子成像、谷氨酸去钙和PA
使用配备FV1000激光扫描显微镜系统（FV1000，Olympus）和浸水物镜（LUMPlanFL N，60×，1.0 N.A.；XLPLN25XWMP2，25×，1.05 N.A.）的立式显微镜（BX61WI；日本东京奥林巴斯）进行双光子成像。在1000 nm处使用两个锁模飞秒脉冲钛宝石激光器（MaiTai DeepSee和HP；Spectra Physics，Mountain View，CA）进行双色成像（Venus和mRFP），在720 nm处使用谷氨酸去壳。对于mTurquoise/GCaMP6/mRFP的三色成像，基于mRFP相同的荧光信号，合并在780 nm（mTurqueoise和mRFP）和970 nm（GCaMP6和mRFF）处独立捕获的两幅图像。对于体外成像时，拍摄了10–40个xy图像（5倍数码变焦，512×512像素），z轴步长为0.5μm。对于体内成像，用异氟烷麻醉小鼠，并从硬脑膜开始拍摄图像（2倍数码变焦，1024×1024像素），进入脑组织，总长度可达650μm，步长为1.0μm。对于谷氨酸开盖，将8 mM MNI-谷氨酸盐（Tocris Bioscience，Bristol，UK）溶解在Mg中2+-使用玻璃吸管将含有1μM河豚毒素的游离ACSF局部涂抹到树突上，在有或无10μM福斯科林（Wako）和5μM茴香霉素（Sigma）的情况下。在720nm波长下以0.6ms的脉冲宽度在脊柱头部重复（5Hz，80×）光解MNI-谷氨酸盐，在物镜下的无盖激光强度为6mW。
数据量化
XY图像通过每个像素处荧光值的总和进行叠加。为了估计脊椎大小，手动追踪树突上的单个脊椎，并在脊椎头部测量填充物（mRFP、DsRed Ex2或mTurquoise）的荧光强度。对于每个通道，从每个脊椎的荧光强度（a.u.）中减去背景强度。在延时成像过程中，记录条件的每日变化导致荧光强度发生轻微变化，这可以通过填充物在距脊椎10μm范围内沿亲本树突轴的荧光强度变化进行校正。“脊柱富集指数”是根据之前的报告估算的20为了评估枝晶中PaRac1变体的不均匀分布，使用以下等式计算“热点指数”：
where’脊柱富集指数我‘和’脊柱富集指数i+1（输入+1）“分别表示给定脊柱及其最近相邻脊柱的富集指数，以及”n个'表示所测树枝状分支（20μm长）中的棘数。热点指数是从标记最密集的树突状节段获得的，并通过重复测量连续最近的脊椎来估计。使用ImageJ软件进行荧光定量。
体内自由移动动物中的PA
通过AAV注射或子宫内基因转移采用开颅颅窗手术，颅孔用双侧玻璃窗覆盖。在玻璃窗上植入一个外圆柱体（一个长15 mm、内径为0.9 mm的非斜面18G针）用于PA。在PA之前，将光纤插入外圆柱体，光纤尖端直接放置在玻璃盖玻片上。光纤和外圆柱体与Blu-Tack紧密锁定在一起，在PA后很容易移除。使用COME-2系列（日本大阪Lucir）进行光刺激，该系列包括457-nm激光二极管、光学转环和双边光纤（COME2-αDF1；芯径500μm，0.5 N.A.）。在每根光纤的尖端，将激光二极管调整为20 mW的输出。光脉冲在1 Hz下传输150 ms，持续1 h，过程由定制的LabView程序控制（德克萨斯州奥斯汀的National Instruments）。
行为分析
小鼠被安置在标准实验室条件下（12小时光/暗循环，食物和水可用随意)并随机分为实验组。所有行为分析均在光照阶段进行。用于运动学习()，我们使用了Rotarod训练系统（Rota-Rod跑步机ENV-576；Med Associates，St.Albans，VT）。在训练之前，小鼠习惯于在固定杆上停留2分钟。在训练期间，以低速（8 rpm）应用固定速度方案，因此小鼠很少从杆上掉落。在小鼠能够可靠地停留在杆上后，速度逐步增加到40 rpm。我们向后肢吹气作为厌恶性刺激，以教会小鼠在杆上正面朝前()这有助于他们保持更高的速度。摔倒后，立即将小鼠放回杆上，并自动记录摔倒的潜伏期。进行了为期2天的三次训练（1次训练2小时，总共训练6小时）。为了评估学习情况，使用加速方案（4至40 rpm）进行了三次旋转试验，试验间隔为5分钟，无需吹气。
在平衡木训练中，使用了手工制作的平衡木器械(). 用秒表计时。当鼠标放在横梁上时计时器开始计时，当第一个前爪放在球笼中时计时器结束。后肢吹气也用于促进学习。在2天内进行了三次训练（一次训练2小时，共训练6小时）。为了评估获得的性能，进行了三次试验，试验间隔为5分钟，试验期间没有吹气。任务性能计算为旋转天线和波束任务三次试验的平均值。与训练前的表现相比，提高<20%的小鼠被排除在分析之外。通过视频跟踪系统（Limelight3；Actimetrics，Wilmette，IL）测量小鼠的奔跑速度。在实验过程中，研究人员没有对组分配盲目，因为所有行为结果都是明确确定的：例如RotaRod的性能和运动通过红外或视频跟踪自动评分，光束测试交叉时间的手动评分是明确的。
统计
一系列实验分为两组进行，主要是三个独立的队列，样本量是根据第一组中显示的效应大小选择的，目的是根据伦理准则最小化使用的动物数量。所有三个队列数据的组合数据显示为平均值±标准偏差。统计方法/结果的详细信息在简而言之，Mann-Whitney U检验用于确定两组之间的显著差异。通过单因素方差分析（ANOVA，正态分布和等方差）、非参数单因素ANOVA（Kruskal-Wallis检验，用于不等方差）或单因素重复测量ANOVA以及事后Bonferroni检验（比较受试者组内不同时间点的任务表现）进行多重比较。使用Spearman秩相关检验两个变量之间的相关性强度。对于所有统计测试*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001被认为是显著的。
扩展数据表
| 样品 | 静力学 |
|---|
| 描述 | 尺寸（n） | 方法 | 比较 | P（P）值 | 相关系数 |
|---|
| 海马切片培养+基因枪 | 结构（A）=13个树突/13片/3只大鼠 | | 富集 | 热点 | | |
| 构造（B）=20个树突/20片/6只大鼠 | 单因素方差分析（事后邓内检验） | （A） vs（B） | 0.03896 | 0.48912 | | |
| 构造（C）=23个树突/23片/6只大鼠 | （A） vs（C） | 0.00001 | 0 |
| 构造（D）=8个树突/8片/3只大鼠 | （A） vs（D） | 0.69713 | 0.81024 |
| 构造（E）=8个树突/8片/3只大鼠 | （A） vs（E） | 0.00130 | 0.00929 |
| | mRFP公司 | 维纳斯 | | |
| 单独去盖（A）=15个树突15片/6只大鼠 | Kruskal Wallis检验（事后Scheffe检验） | （A） vs（B） | 0.62258 | 0.01139 | | |
| 去盖+FSK（B）=35个树突/35片/8只大鼠 | （A） 与（C） | 0.00430 | 0.10843 |
| 去盖+茴香（C）=20个树突15片/6只大鼠 | （B） vs（C） | 0 | 0 |
| | 富集 | 热点 | | |
| 载体=13个树突/13片/3只大鼠 | Mann-Whitney试验（双面） | Veh与Lac | 0.00134 | 0.00030 | | |
| Lactacystin=8个树突/8片/3只大鼠 |
| 体内M1皮层+宫内EP（E14.5） | | 放大 | 新建 | 收缩 | 已消除 | |
| 训练=2793只脊椎/7只小鼠 | Mann-Whitney试验（双面） | （训练）vs（不训练） | 0.03887 | 0.02014 | 0.12134 | 0.12134 | |
| 不训练=718只脊椎/3只小鼠 |
| 训练=2090只脊椎/3只小鼠 | 斯皮尔曼秩相关系数 | ΔV（0天）和AS（0天 | 0 | | 0.61278 | |
| ΔV（0天）和AS（-1天） | 0.51746 | | −0.03549 | |
| | 放大 | 新建 | | |
| 2090个脊椎中有68个脊椎（扩大或新脊椎） | Mann-Whitney试验（双面） | [AS（+1天）≥1]vs[AS（+1天）<1] | 0.00263 | 0.00016 | | |
| 体内M1皮层+宫内EP | 94根脊椎/6只小鼠 | Mann-Whitney试验（双面） | [AS（+）]与[AS（−）] | 0 | | |
| 斯皮尔曼秩相关系数 | ΔV和深度 | 0.28151 | | −0.17225 | |
| 海马切片培养+基因枪 | | AS（+） | AS（−） | | AS（+） | AS（−） | |
| 24根脊椎/12片/6只小鼠 | 斯皮尔曼秩相关系数 | ΔV和ΔAmp | 0.01793 | 0.57016 | | 0.58235 | 0.23810 | |
| ΔV和Δ频率 | 0.58679 | 0.95537 | −0.14706 | 0.02381 |
| | 振幅 | 频率 | | |
| 16只体/12片/6只小鼠 | Wilcoxon符号秩检验 | （PA前）vs（PA后） | 0.24886 | 0.09620 | | |
| 体内M1皮层+双侧AAV5感染 | | mRFP（保护#1） | AS（保护#1） | AS（防护#2） | AS（防护#3） | |
单独的mRFP（方案#1）=10只小鼠
mRFP+AS-PaRac1（协议#1）=15只小鼠
mRFP+AS-PaRac1（方案#2）=12只小鼠
mRFP+AS-PaRac1（方案#3）=5只小鼠 | 单向重复测量方差分析（事后Bonferroni检验） | （训练前）vs（0天） | 0.00090 | 0 | 0 | 0.00034 | |
| （0天）vs（+1天） | 不适用 | 不适用 | 0.83880 | 不适用 |
| （0天）vs（+2天） | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 1 |
| （0天）vs（PA后） | 0.59421 | 0.00056 | 0.00003 | 1 |
| （+1天）vs（PA后） | 不适用 | 不适用 | 0 | 不适用 |
| （+2天）vs（PA后） | 不适用 | 不适用 | 不适用 | 1 |
| （训练前）与（PA后） | 0.00005 | 0.00070 | 0.01852 | 0.00012 |
| 单向阶乘方差分析（事后Scheffe检验） | （保护#1）与（保护#2） | 0.22430 | | |
| （保护#2）与（保护#3） | 0.00047 |
| （保护#1）与（保护#3） | 0.00989 |
| | mRFP（保护#1） | AS（保护#1） | AS（保护#2） | AS（防护#3） | mRFP（保护#1） | AS（保护#1） | AS（防护#2） | AS（防护#3） |
| 斯皮尔曼秩相关系数 | PA效果与学习成就 | 0.74518 | 0.04664 | 0.00156 | 0.95715 | 0.1051 | −0.5206 | −0.8056 | 0.0286 |
| | 非PA（RotaRod） | 非PA（光束） | PA（RotaRod） | PA（光束） | |
非PA组=13只小鼠
PA组=13只小鼠 | 单向重复测量方差分析（事后Bonferroni检验） | （训练前）vs（0天） | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| （0天）vs（+2天） | 1 | 不适用 | 1 | 不适用 |
| （0天）vs（PA后） | 1 | 1 | 1 | 0.04755 |
| （+2天）vs（PA后） | 0.66982 | 不适用 | 1 | 不适用 |
| （训练前）与（PA后） | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 斯皮尔曼秩相关系数 | PA对每项任务的影响 | 0.06148 | | −0.53168 | |
| 体内M1皮层+宫内EP（E14.5） | | 第2/4天 | 第4天特定 | | |
双任务组=1713只脊椎/5只小鼠
再训练组=765根脊椎/5只小鼠
家庭笼子组=861只脊椎/5只小鼠 | 单向阶乘方差分析（事后Scheffe检验） | （双重）vs（重新训练） | 0.09206 | 0.21206 | | |
| （重新训练）vs（家庭笼） | 0.00708 | 0.57905 |
| （双）vs（家庭笼） | 0.35558 | 0.03786 |
| | 双重任务 | 重新训练 | Homecag公司 | | |
双重任务组：
第2天的特定脊椎=48，第2/4天的两个脊椎=13，第4天的特定脊柱=26 | 单向阶乘方差分析（事后Scheffe检验） | （第2天）与（第2/4天） | 0.00331 | 0.04339 | 0.00147 | | |
再培训组：
第2天的特定脊椎=10，第2/4天的两个脊椎=15，第4天的特定脊柱=9 | （第2天）与（第4天） | 0.00077 | 0.04579 | 0.01531 |
主笼组：
第2天的特定脊椎=10，第2/4天的两个脊椎=6，第4天的特定脊柱=9 | （第2/4天）与（第4天） | 0.92817 | 0.95804 | 0.65233 |
| 双任务组=5只小鼠
再训练组=5只小鼠
家笼组=5只小鼠 | 缺口试验（事后Bonferonni校正） | （双重）vs（重新训练） | 0 | | |
| （重新训练）vs（家庭笼） | 1 |
| （双）vs（家庭笼） | 0 |
扩展数据
扩展数据图1
针对突触应用优化PaRac1a、，等温滴定量热法（ITC）实验表明，将L514K和L531E突变引入原始PaRac1结构12在黑暗中减少与PAK1的CRIB结构域的结合。LOV2（C450A）的光不敏感形式和模拟未折叠“光状态”的I539E突变体分别用作阴性和阳性对照。b条在转染原始PaRac1的海马神经元培养物中，我们观察到体细胞有胡须状外观，并有大量异位树突，而转染PaRacl（L514K/L531E）的神经元与正常神经元无明显区别。c（c），使用下拉分析评估PaRac1与内源性PAK1的亲和力。将转染PaRac1-Venus的HEK293细胞分为亮细胞和暗细胞两组。亮细胞组的细胞在细胞溶解前用白色荧光灯照射，在随后的免疫沉淀过程中持续光照，直到蛋白沉淀剂的最后清洗步骤。相反，用黄色荧光灯照射暗组中的细胞，该荧光灯排除了500nm以下的光波长。与PAK1共免疫沉淀显示，PaRac1（L514K/L531E）在黑暗中几乎与PAK1结合（试验数量如条形图所示**P（P）<0.01（使用Mann-Whitney U检验）。d日，将PaRac1靶向突触后密度。PSDΔ1.2-PaRac1[DTE（−）]在体外21天转染到分离的皮层神经元（DIV）。转染后两天，用4%PFA固定细胞，然后进行渗透处理，用于随后的免疫染色程序。分别使用抗磷神经丝和抗PSD-95抗体对轴突和内源性PSD-95进行可视化，显示PSDΔ1.2-PaRac1与内源性PSD-95共定位。请注意，PSDΔ1.2-PaRac1没有与轴突标记物共存。
扩展数据图2
AS-PaRac1的分布受神经元活动调节，并依赖树突状靶向元件（DTE）a、，实验设计。b条，培养海马神经元的代表性图像。c（c）在指定的时间点将荷包牡丹碱（BIC）或河豚毒素（TTX）添加到培养基中。图像以高倍放大率拍摄，并平铺以可视化整个细胞。绿色圆圈代表AS-PaRac1点。d日，AS-PaRac1分布的量化(n个=6/个*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，使用Kruskal-Wallis检验，然后使用事后Dennett检验）。e（电子），AS-PaRac1和SEP-GluA1在脊椎中的伴随积累。用mTq（mTurquoise，filler）、SEP-GluA1和AS-PaRac1-mRFP共同转染神经元，并将构建物表达36 h。SEP-Glu A1荧光（箭头）显示36 h内增强的脊髓。Spearman秩相关揭示了SEP-GluA1和AS-PaRac1的脊柱富集指数之间的显著相关性（每个圆圈代表一个脊柱，235个脊柱，29个树突）。f、，FSK（箭头）存在下，谷氨酸解封引起的单个脊柱增强的结构和代表性图像示意图。用AS-PaRac1或PSD-PaRac1[DTE（−）]对大鼠海马切片培养物进行生物转染，然后在DIV 13（相当于出生后第20天）进行去壳实验。克，脊柱头部容积的时间进程(五)和金星在不封顶时的堆积。脊柱大小的平均变化和金星在受刺激或邻近脊柱中的积聚在去盖后60分钟被描绘出来。为了量化，我们使用了来自相同设计的独立实验的汇集数据。AS-PaRac1的数据集与FSK治疗组相同c–e类.比例尺，1μm*P（P）<0.05，使用Mann-Whitney U检验(n个=PSD-PaRac1或AS-PaRac1分别为6或11个树枝晶）。
扩展数据图3
增强脊髓中AS-PaRac1特定浓度的推测细胞机制一，用缺乏DTE的PSD-PaRac1构建物对脊椎进行统一标记弧3英尺UTR(，构建体B）。PSD-PaRac1在配备了大量翻译机器的体细胞中翻译。因此，探针的体细胞蛋白表达很高（数据未显示），这将超过降解的数量，并且产生的蛋白质通过树突运输。溢出的探针在PSD分子的结构转换过程中整合到突触后密度（PSD）中。因此，探针的表达与脊柱大小成正比。
b条，用AS-PaRac1选择性标记增强棘(，构造C）。以下六种机制赋予AS-PaRac1增强特异性标记。（1） 少量体细胞翻译：AS-PaRac1的适度基因表达，通过这种表达，AS-PaRac1蛋白的翻译在体细胞中受到限制（参见)因此，该探针从胞体到树突的非特异性溢出是最小的。（2） 树突状靶向元件（DTE）：AS-PaRac1的基本结构域是N末端PSD-95（PSDΔ1.2）和弧mRNA（DTE）。DTE在mRNA的树突状靶向中起着关键作用44,45。最著名的DTE之一出现在弧信使核糖核酸16，以活性依赖的方式靶向刺激的树突状片段18mRNA从体细胞外的转运也导致了（1）中描述的体细胞内探针的有限翻译。在缺乏激活的情况下，树突中有限的翻译机制和降解成分使局部翻译探针保持在较低水平，这导致在PSD蛋白的组成性转换期间AS-PaRac1整合到PSD的速率较低。（3） 局部蛋白质合成：脊椎持续的结构可塑性取决于蛋白质的活性依赖性树突状合成46，以及弧mRNA受活性水平控制19（4）在结构增强的棘中有效捕获PSD蛋白：增强的棘快速需要新的PSD蛋白拷贝，更有效地捕获扩散的PSD蛋白质47,48（5）增加PSD中AS-PaRac1的稳定性：PSD整合的AS-PaRac1的稳定可能会增加，典型的PSD支架蛋白也是如此47泛素化可能是稳定性增加的内在机制，因为AS-PaRac1的泛素化位点位于PSD-95的N-末端结构域，其结构域在突触后支架中聚集形成头对头多聚化49因此，一旦AS-PaRac1整合到PSD中，泛素化位点可能被隐藏，AS-PaRac1变得相对稳定。（6） 未结合的AS-PaRac1对蛋白酶体降解的敏感性：与PSD-整合的AS-Pa Rac1相反，未结合的AS-PaRac 1对降解敏感，因为泛素化位点没有被隐藏。这种情况得到了乳胱氨酸蛋白酶抑制剂（右面板）的支持，它抑制蛋白酶体，从而完全破坏AS-PaRac1的不均匀分布。类似的机制与新形成的脊椎有关，因为脊椎的形成与脊椎的扩大有关50。
扩展数据图4
量化和突触映射的原始数据如所示a、，根据脊椎的分类，分别描述学习后脊椎大小的量化（基于DsRed荧光）和AS-PaRac1荧光。右侧描述了“新脊椎”、“扩大脊椎”等的定义。每个箭头指示脊椎的轨迹；起点和终点分别表示rotarod任务前后的绝对值。b条XY图像是从硬脑膜深度300μm处以1.0μm的步长拍摄的，并通过每个像素处荧光值的总和进行叠加。将10个重叠区域的Z堆叠图像对齐以生成组合图像。显示AS-PaRac1和AS-PaRac1/DsRed合并图像。描述了学习前出现的AS-PaRac1（−1天，黄色）、学习后不久（学习期，0天，绿色）、1天（学习期后-1天，+1天，蓝色）或学习后2天（学习后-2天，+2天，紫色），以显示每个周期中触发的AS-Pa Rac1的时空分布。c（c），每个时期AS-PaRac1-阳性棘的数量和分数的时间过程。d日，计算学习诱发脊柱/神经元比率（%）。计算示例基于中显示的原始数据b条和c（c）表中显示了第II/III层神经元之间的比较(子宫内E14.5处的EP）和第V层(子宫内E13处的EP）。
扩展数据图5
树突轴上AS-PaRac1穿孔的评估一，AS-PaRac1点可能在树突轴上代表的两种可能的突触类型。采集XY图像，以包含感兴趣树枝晶的整个Z范围，步长为0.5μm，并通过每个像素处荧光值的总和对图像进行叠加。如果AS-PaRac1点状突起出现在经历结构增强的树突棘上，填料和AS-PaRac1的荧光都会增加。相反，如果AS-PaRac1位于轴突触中，填充物的荧光不会增加。b条，AS-PaRac1出现前后的枝晶示例。轴和树突棘上的AS-PaRac1点分别用（i）和（ii）表示。显示了用于计算每个点中荧光的ROI。c（c），出现AS-PaRac1点时填料和AS-PaRac1的荧光定量。每个箭头指示每个ROI的轨迹；起点和终点分别表示AS-PaRac1出现之前和之后的绝对值。（i）处的ROI在填料和AS-PaRac1中均显示出伴随的荧光增加，与典型树突棘中的AS-PaRac1相似（ii）。所有检测到的树突轴上的AS-PaRac1点状突起均显示出正相关性，这表明在脊柱结构改变期间，大多数AS-PaRac1点阵突起出现在树突棘上。
扩展数据图6
低频PA诱导树突棘的Rac1依赖性收缩一PA.PA协议在包含相关分支的区域执行。b条，将左侧示意图中所示的DNA结构生物转染海马切片培养物（DIV 11）中的神经元。PA上具有代表性的树枝状图像显示在右侧。在SARE-Arc启动子驱动的转染AS-PaRac1的脊髓中观察到强烈收缩（箭头）。尽管它们与AS-PaRac1阳性棘相邻，但AS-PaRac1阴性棘不受PA影响。c（c），脊柱头部容积的时间进程(五)静脉阳性（上面板）和阴性脊椎（下面板）。白色、红色和蓝色圆圈分别表示CAG：：AS-PaRac1、SARE:：AS-Pa Rac1和SARE:∶PSDΔ1.2-LOV-DTE(n个=12个单元/个）。d日PA后60分钟，静脉阳性和阴性脊柱中脊柱头部大小的平均相对变化。比例尺，2μm*P（P）<0.05和***P（P）<0.001根据克鲁斯卡尔·沃利斯检验和事后舍夫检验。
扩展数据图7
蓝色激光照射引起双侧运动皮质大面积脊柱萎缩一，双侧颅骨窗、光纤和PA协议示意图。b条，PA后M1皮层脊柱收缩的典型图像体内.AS-PaRac1-阳性棘（绿色箭头）缩小，而AS-PaRac1-阴性棘（白色箭头）没有缩小。脊椎大小的量化如右图所示。c（c），在小鼠中计算每个场的AS-PaRac1点的平均数量，如。d日,e（电子）对小鼠的脊柱结构和AS-PaRac1进行成像，这些小鼠接受了再训练和家庭笼协议，如大多数AS-PaRac1阳性棘显示出PA诱导的收缩和随后的恢复*P（P）<0.05，根据Mann-Whitney U检验。（f）行为测试后mRFP荧光的出现证实了AAV5载体注射到双侧M1皮层的成功。Emx1免疫染色显示病毒感染第II/III层和第V层锥体神经元的高效性，并标记锥体神经元。将M1皮层无双侧mRFP信号的小鼠排除在数据分析之外。
扩展数据图8
PA对小鼠运动活动无影响一，实验时间表。方案#1中AS-PaRac1注射小鼠的跑步速度()使用视频跟踪系统进行测量。为了尽量减少昼夜节律对运动的影响，在PA前后的同一时间对小鼠进行测试。b条描述了运动的典型轨迹和运行速度的时间序列。c（c）统计分析表明，PA对运行速度的影响微不足道。
扩展数据图9
中旋转天线和波束任务的详细说明一，实验流程图。b条旋翼机训练/测试、运动测试和PA的详细时间表。c（c）为了缩短训练时间，对小鼠后肢进行喷气作为厌恶性刺激，以保持小鼠在杆上的前视位置，从而提高了运动成绩，尤其是在较高速度下。d日，光束测试示意图。在测试之前，进行了为期6小时、持续2天的培训。
致谢
我们感谢H.Bito和H.Okuno慷慨捐赠弧发起人；F.村上春树弧3′UTR；M.Yuzaki、K.Inokuchi和K.Fox进行了宝贵的讨论。本研究得到了教育、文化、体育、科学和技术部资助项目（日本MEXT，编号2000009至香港，编号26221011至香港和A.H-T.，编号23689055和编号24116003至A.H-T.）、香港疾病研究综合神经技术脑图绘制项目（脑/MINDS，AMED）的支持。，向A.H-T.提供PRESTO计划（JST），向K.M.H.提供国家卫生研究院GM102924拨款，向香港、K.M.H和B.K.提供人类前沿科学计划的研究拨款。
脚注
补充信息链接到该论文的在线版本www.nature.com/nature（自然）。
利益冲突声明。作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。
作者贡献
A.H-T.、S.Y.、M.N.和F.S.进行了实验。Y.W.、A.L.L.、K.M.H.和B.K.为PaRac1的开发提供了技术支持。A.H-T.和香港设计了这项研究并撰写了手稿。工具书类
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