Toll样受体9通过诱导白细胞介素-1促进脂肪性肝炎β在小鼠中

组织学检查

进行H&E、Oil-Red O、TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）介导的dUTP（2′-脱氧尿苷5′-三磷酸）-生物素颈部末端标记（TUNEL）和天狼星红染色。^11,21在10个高倍（400×）场/玻片上计数TUNEL阳性细胞。在10个低功率（40×）场/载玻片上测量天狼星红阳性区域，并使用NIH成像软件进行量化。NAFLD活动评分如前所述。²²对F4/80、结蛋白和CD31进行免疫组化。¹¹

定量实时聚合酶链反应分析

使用ABI PRISM 7000序列检测器（应用生物系统）对从肝脏和细胞中提取的RNA进行逆转录和随后的定量实时聚合酶链反应（PCR）。¹¹PCR引物序列列于补充表3将基因归一化为18S RNA作为内部控制。

脂质的分离和测量

使用甘油三酯试剂盒（Pointe Scientific，Canton，MI）、胆固醇E（Wako，Richmond，VA）、游离脂肪酸和半微量试验（Roche，Mannheim，Germany）测量甘油三酸酯、总胆固醇和游离脂肪酸含量。

胰岛素抵抗的评估

胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）计算为[免疫反应性胰岛素(μU/mL）×空腹血糖（mg/dL）÷405]。²³

细胞分离和处理

如前所述，从小鼠中分离出肝细胞、HSC和Kupffer细胞。^11,21细胞附着后，肝细胞被血清饥饿16小时。Kupffer细胞和HSC的培养基改为1%血清16小时，然后用10 ng/mL IL-1治疗β, 5μg/mL CpG-寡核苷酸（ODN；ODN1826:5′-tcccatgacgttctgatt-3′），和5μg/mL非–CpG-ODN（5′-tccatagctcgagctt-3′）。如前所述，将肝细胞分为4个细胞群（肝细胞、枯否细胞、内皮细胞和HSC）。¹⁹

细胞死亡评估

使用Hoechst33342（加利福尼亚州圣地亚哥Invitrogen）和碘化丙啶染色法测定细胞凋亡和坏死。²¹

腺病毒

用于测量NF-κB活化，一种表达NF驱动的荧光素酶报告基因的重组腺病毒-κ使用B激活。^11,24抑制NF-κB激活，一种表达NF抑制剂的重组腺病毒-κB（I）类κB） 使用超加压剂。^11,21,24

IL-1β的测量

使用酶联免疫吸附分析试剂盒（明尼阿波利斯研发系统公司，明尼苏达州）测量IL-1β在血清和上清液中。

Western Blot分析

上清液或蛋白质提取物（20μ五十） 电泳，然后印迹。印迹与金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP1；R&D Systems）或IL-1R相关激酶M（IRAK-M；Cell Signaling Technology Inc，Danvers，MA）抗体孵育。^11,24

Kupffer细胞衍生IL-1β在TLR9中被抑制^−/−老鼠

确定TLR9中导致脂肪性肝炎减毒的关键分子^−/−我们检测了包括肿瘤坏死因子在内的炎症细胞因子在小鼠肝脏中的mRNA表达α（TNFα)、IL-6、IL-1α和IL-1β在缺乏MyD88（TLR9信号转导的适配器分子）的小鼠中，CDAA饮食喂养后，炎症细胞因子的mRNA水平被完全抑制(图2A类). 在这些炎症细胞因子中，IL-1βTLR9中mRNA水平显著降低^−/−老鼠(图2A类). TLR9级^−/−小鼠的血清IL-1水平也有类似的降低βMyD88水平^−/−老鼠(图2B类)提示TLR9依赖性MyD88介导的IL-1β是NASH进展的重要因素。

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图2

TLR9诱导IL-1βKupffer细胞的生产。(A类和B类)肝脏和血清取自22周龄的CSAA（CS）或CDAA（CD）饮食喂养的WT、TLR9^−/−和MyD88^−/−老鼠。(A类)采用实时定量PCR（qPCR）检测肝脏炎症细胞因子mRNA水平。(B类)血清IL-1β用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定其含量。(C类)给喂食CDAA饮食的WT小鼠（21周龄）注射对照组（Veh；n=6）或氯膦酸脂质体（Clo；n=5），以耗尽Kupffer细胞。脂质体注射后1周取肝脏和血清。肝脏IL-1 mRNA和血清蛋白水平β分别用qPCR和ELISA检测。(天)白介素-1βqPCR检测肝细胞、Kupffer细胞、HSC和窦状内皮细胞的mRNA表达。(E类)重量，TLR9^−/−和MyD88^−/−Kupffer细胞用5μg/mL CpG-ODN或非CpG-ODN，然后是IL-1β用qPCR检测mRNA水平。转换活性IL-1β来自proIL-1β，Kupffer细胞与5μg/mL CpG-ODN（n=4，每组），然后分泌IL-1β用酶联免疫吸附法测定其含量。数据表示平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .01; 不另作说明，不重要。

因为枯否细胞是IL-1的主要来源β在一些肝损伤模型中，^25,26我们确定了枯否细胞在IL-1中的作用β生产。静脉注射氯膦酸脂质体只能耗尽Kupffer细胞，但不能耗尽HSC或窦内皮细胞(补充图3). 白介素-1βCDAA饮食21周后，注射氯膦酸脂质体1周后，血药浓度显著降低(图2C类). 此外，在服用CDAA饮食22周后，我们从WT小鼠中分离出肝细胞、枯否细胞、HSC和窦内皮细胞。高水平的IL-1β仅在Kupffer细胞组分中观察到mRNA表达(图2天). 这些数据表明Kupffer细胞是IL-1的主要来源β在CDAA饮食中。

接下来，我们测试了含有CpG的ODN（一种合成TLR9配体）是否诱导IL-1βKupffer细胞的生产。CpG-ODN上调IL-1βWT-Kupffer细胞中的mRNA，但TLR9中没有^−/−或MyD88^−/−库普弗细胞(图2E类). 用三磷酸腺苷（ATP）激活caspase-1，²⁷WT-Kupffer细胞分泌IL-1活性形式β(图2E类). 相反，CpG-ODN没有诱导IL-1β从WT小鼠分离的HSC或肝细胞中的mRNA，以及IL-1的活性形式β未在HSC和肝细胞培养上清液中检测到（数据未显示）。这些结果表明IL-1β主要由库普弗细胞通过CDAA饮食诱导的NASH中的TLR9产生。

IL-1β促进脂质积累和肝细胞损伤

确定IL-1的作用β在NASH上，我们检测了IL-1β影响肝细胞的脂质代谢。白介素-1βWT和TLR9中的脂滴和甘油三酯含量增加^−/−-培养的肝细胞，但不是IL-1R^−/−肝细胞(图3A类和B类). 二酰甘油酰基转移酶2（DGAT2）是一种将二甘油脂转化为甘油三酯的酶，在WT和TLR9中的mRNA表达上调^−/−肝细胞，但不在IL-1R中^−/−肝细胞，IL-1后β处理(图3C类). 这些结果表明IL-1β诱导肝细胞脂质积聚。

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图3

白介素-1β促进肝细胞的脂质代谢和细胞死亡。(A–C)重量，TLR9^−/−和IL-1R^−/−用10 ng/mL IL-1处理肝细胞β。车辆，车辆。(A类)脂质积聚（油红O染色）和(B类)在WT、TLR9中测量甘油三酯含量（归一化为蛋白质浓度）^−/−和IL-1R^−/−IL-1处理的肝细胞β24小时。(C类)用IL-1处理肝细胞β持续8小时。用实时定量PCR（qPCR）检测肝细胞中DGAT的mRNA表达。(D–F型)从喂食CSAA（CS）或CDAA（CD）饮食的22周龄小鼠中分离肝细胞。(天)用IL-1处理肝细胞β24小时。分别用Hoechst33342和碘化丙啶测定细胞凋亡和坏死。(E类)测定上清液中的ALT和LDH水平。(F、 左)mRNA水平Bcl2公司和Bax公司通过qPCR检测。(F、 右)NF公司-κB活性对IL-1的反应β由NF检查-κB–报告人分析。数据表示平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .01; 不另作说明，不重要。原始放大倍数，×400(A类)，×200（C）。

接下来，我们研究了IL-1的作用β导致肝细胞死亡。在喂食CSAA饮食的小鼠的肝细胞中，IL-1β没有诱导细胞死亡(图3天，对). 然而，IL-1β从喂食CDAA饮食的小鼠中分离出的脂质累积肝细胞凋亡和坏死增加(图3天，左侧和正确的). 对IL-1的反应β喂食CDAA的小鼠肝细胞上清液中ALT和乳酸脱氢酶（LDH）水平升高，而喂食CSAA的小鼠则没有升高(图3E类). 白介素-1β增加抗凋亡基因的表达Bcl2公司，但不是促凋亡基因Bax公司，在喂食CSAA饮食的小鼠肝细胞中。重要的是，Bax公司，但不是Bcl2公司IL-1后，喂食CDAA饮食的小鼠肝细胞中的表达上调β处理(图3F类，左侧). NF公司-κB激活对肝细胞具有重要的抗凋亡作用。²¹白介素-1β增加的NF-κ喂食CSAA饮食的小鼠肝细胞中的B活化。值得注意的是，NF-κIL-1后，喂食CDAA饮食的小鼠肝细胞中的B激活减弱β处理(图3F类，对). 确定NF的直接作用-κIL-1诱导的B细胞死亡β、NF-κB激活被I抑制κ肝细胞中的B超表达。抑制NF-κB激活，IL-1β肝细胞凋亡及ALT和LDH水平增加(补充图4A–C)，表明NF-κB失活对于确定脂质积聚肝细胞中细胞死亡的敏感性至关重要。

我们还测试了TLR9信号对肝细胞的直接影响。然而，CpG-ODN对正常肝细胞或脂质积聚肝细胞的脂质积聚和细胞死亡几乎没有影响(补充图5A–J). 这些结果表明IL-1β在NASH期间介导肝细胞中的脂质积聚和细胞死亡。

IL-1β促进HSC活化

接下来，我们检查了IL-1是否β在HSC中介导纤维生成反应，HSC是肝脏中肌成纤维细胞的主要前体。白介素-1βWT和TLR9中TIMP1的mRNA和蛋白水平显著升高^−/−HSC而非IL-1R^−/−高速列车(图4A类). 白介素-1β增加胶原蛋白α1（I），胶原蛋白α1（IV）、PAI-1 mRNA和抑制TGF假受体Bambi mRNA表达β,¹¹作为TGF的负调节器β肝纤维化的信号转导(图4B–D类). 尽管先前的研究报告称CpG-ODN在HSC中诱导纤维生成反应，^15,17我们的研究表明CpG-ODN对纤维化基因表达和NF几乎没有影响-κB激活(补充图6). 确定IL-1的功能作用βHSC由Kupffer细胞分泌，用来自经CpG-ODN或非CpG-ODN处理的库普弗细胞的条件培养基培养。来自经CpG-ODN处理但未经非CpG-ODN处理的细胞的条件培养基增加了WT和TLR9中TIMP1和PAI-1的水平^−/−HSC。值得注意的是，IL-1R^−/−HSC对CpG-ODN处理的条件培养液没有增加TIMP1和PAI-1水平(图4E类). 这些结果表明TLR9介导的IL-1βKupffer细胞释放的HSC对HSC激活至关重要。

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图4

库普弗细胞衍生IL-1β促进HSC激活。(A–D)与WT、TLR9隔离的HSC^−/−和IL-1R^−/−用10 ng/mL IL-1刺激小鼠β持续8小时以测量TIMP1的mRNA表达(A类)，PAI-1(B类)、胶原蛋白(C类)和斑比(天)通过定量实时PCR（qPCR），并用Western blot检测24小时上清液中TIMP1的表达(A类). (E类)通过用5μg/mL CpG-ODN或非CpG-ODN 24小时。然后，WT，TLR9^−/−和IL-1R^−/−用Kup-CM处理HSC 8小时，通过qPCR测定纤维生成标记物的mRNA表达(E、 左)并持续24小时以测定上清液中TIMP1蛋白的表达(E、 右). 数据表示平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .01; 不另作说明，不重要。

白细胞介素-1R^−/−小鼠表现出减少的脂肪变性、肝细胞损伤和纤维化

为了确认IL-1R信号在NASH中的关键作用，IL-1R^−/−用CDAA饮食喂养小鼠22周。白细胞介素-1R^−/−小鼠表现出较少的脂肪变性、凋亡和肝纤维化(图5A–C). IL-1R中的NAFLD活性评分^−/−小鼠显著低于WT小鼠（总分，WT vs IL-1R^−/−小鼠=6.5对4.6；P（P）< .05); 特别是，IL-1R中脂肪变性和肝细胞膨胀而非炎性细胞浸润的评分较小^−/−老鼠(图5天). 肝甘油三酯含量降低表明脂肪变性减少(图5E类). IL-1R中ALT水平较低^−/−老鼠(图5E类). 胶原mRNA水平降低证实肝纤维化减轻α1（I），胶原蛋白α1（IV）、TIMP1和PAI-1(图5F类). 这些发现表明，IL-1R信号通路参与脂肪变性、肝细胞损伤和纤维化。

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图5

白细胞介素-1R^−/−小鼠脂肪变性和纤维化减弱。WT和IL-1R^−/−给小鼠喂食CSAA饮食（CS；n=4）或CDAA饮食（CD；n=8）22周。封闭式酒吧、WT小鼠；露天酒吧，IL-1R^−/−老鼠。(A类)健康与环境(箭头炎症细胞；箭头，膨胀的肝细胞），油红O，TUNEL(箭头; 凋亡细胞），并进行天狼星红染色。原始放大倍率，H&E和TUNEL为×200，油红O和天狼星红为×100(B类)TUNEL阳性细胞数量和(C类)天狼星红阳性区域在IL-1R中受到抑制^−/−老鼠。(天)IL-1R抑制NAFLD活性评分、脂肪变性和纤维化^−/−老鼠。未检测到N.D。(E类)IL-1R中肝甘油三酯和血清ALT水平降低^−/−老鼠。(F类)通过实时定量PCR检测肝纤维化标记物的mRNA水平。数据表示平均值±SD*P（P）< .05; 不另作说明，不重要。

MyD88是脂肪性肝炎和纤维化发展的关键成分

由于TLR9和IL-1R信号通路共享适配器分子MyD88，我们研究了MyD88在NASH中的作用。MyD88显著抑制了脂肪变性、炎症、凋亡和纤维化^−/−喂食CDAA饮食的小鼠(图6A–C). MyD88患者的NAFLD活动评分明显较低^−/−小鼠（总分，WT vs MyD88^−/−=6.5对2.0；P（P）<.01），且各项得分均显著低于WT小鼠(图6天). MyD88的肝甘油三酯和血清ALT水平显著降低^−/−老鼠(图6E类). 此外，MyD88^−/−小鼠胶原mRNA水平降低α1（I），胶原蛋白α1（IV）、TIMP-1和PAI-1(图6F类). 这些结果表明MyD88是促进NASH和纤维化的关键信号分子。

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图6

MyD88基因缺失可改善脂肪性肝炎。WT和MyD88^−/−给小鼠喂食CSAA（CS，n=4）或CDAA（WT-CD，n=8；MyD88^−/−-CD，n=7）饮食22周。封闭式酒吧、WT小鼠；露天酒吧，MyD88型^−/−老鼠。(A类)健康与环境(箭头，炎症细胞；箭头，膨胀的肝细胞），油红O，TUNEL(箭头; 凋亡细胞），天狼星红染色显示MyD88的脂肪变性、炎症细胞、凋亡和纤维化减少^−/−老鼠。原始放大倍数，H&E和TUNEL染色×200，Oil-Red O和Sirius红色染色×100。(B类)TUNEL阳性细胞(C类)天狼星红-阳性区域，以及(天)MyD88中NAFLD活动评分受到抑制^−/−老鼠。未检测到N.D。(E类)MyD88抑制了肝甘油三酯和血清ALT水平^−/−老鼠。(F类)通过实时定量PCR测定肝纤维化标记物的mRNA水平。数据表示平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .01; 不另作说明，不重要。

作者感谢Shizuo Akira博士（日本大阪大学）慷慨捐赠TLR9^−/−和MyD88^−/−小鼠和Katsumi Miyai博士（加州大学圣地亚哥分校病理学系）、Wuqiang Fan博士、Saswata Talukdar博士、Rie Seki和Karin Diggle博士（加州州立大学圣地亚摩分校医学系）获得了卓越的技术援助。

基金

本研究得到了美国肝病研究协会/美国肝病基金会颁发的肝脏学者奖以及美国国家医学院（NIAAA）资助的南加州阿尔茨海默病和肝硬化研究中心（P50 AA11999）试点项目（均为E.S.）的支持，美国国家卫生研究院（NIH）拨款5R01GM041804和5R01DK072237（D.a.B.），和武田科学基金会（K.M.）。