纤连蛋白剪接变异体的形式和功能的新见解

摘要

介绍

高等真核生物的复杂性是通过有限数量的基因实现的，这些基因通过多种机制产生蛋白质多样性。其中，最突出的是前体mRNA的选择性剪接。据估计，超过60%的基因经历了选择性剪接[1]. 在大多数情况下，它以组织特异性和发育调节的方式发生，也受不同刺激物的调节。然而，在大多数情况下体内通过选择性剪接产生的蛋白质异构体的功能仍然没有很好的定义。

纤维连接蛋白（FN）是研究选择性剪接调控基因功能的良好模型。FN是一种多功能糖蛋白，存在于血浆和组织的细胞外基质（ECM）中。它由多种细胞类型表达，在细胞粘附和迁移行为中起关键作用。事实上，胚胎发生、止血、伤口愈合和组织完整性维持等基本过程都依赖于细胞和ECM之间的相互作用[2]. FN的关键重要性体内小鼠FN无效突变的致死效应最终证明了这一点：缺乏FN的小鼠死于胚胎发育的严重缺陷[三] (表1). 在人类中，FN的临床意义由最近的数据证明，某些类型的肾小球疾病是由FN基因突变引起的[4].

尽管FN是第一批被报道进行选择性剪接的基因之一[5——7]是研究得最好的选择性剪接模型之一[8——31]，的体内在建立FN基因靶向突变的小鼠模型之前，人们对选择性剪接亚型的相关性知之甚少。FN在前面提到的一些过程中的作用的结论性证据是利用基因靶向方法获得的，这仍然是理解体内特定基因产物的功能。在这里，我们将讨论我们对FN亚型功能理解的最新进展，这主要来源于使用具有FN基因靶向突变的小鼠模型。

纤维结合蛋白结构

FN仅存在于脊椎动物中，其在进化中的出现与具有内皮细胞系血管的生物体的出现有关[32,33]. 功能性FN分子由两个类似或相同的220-250 kDa亚单位组成，它们由靠近羧基末端的两个二硫键结合在一起，形成二聚体(图1A). 每个单体由三种不同类型的同源重复结构域组成，称为I型、II型和III型[2]. 15个III型模块构成FN多肽的最大部分，并聚集在蛋白质的中心部分(图1A). 单个FN III型重复序列具有高度的结构同源性，尽管在氨基酸序列中仅显示20-40%的同源性。它们由约90个氨基酸组成，组织在7条反平行β链中，这些链之间有裸露的环，没有二硫键[34] (图1B和C). 结构域可能发生结构修饰，暴露由机械力诱导的隐蔽位点，通过蛋白质水解产生FN分子的“拉伸”[35,36]或通过合并一个（或两个）交替拼接的III型域（额外域A和B，分别命名为EDA、EIIIA或EDI和EDB、EIIIB或EDII）[37].

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图1

纤维结合蛋白一级结构

该方案显示了纤维连接蛋白二聚体及其相互作用的表示（面板A）代表了不同类型的同源性（12个I型，2个II型和15个III型）。III型同源的编号不包括EDA和EDB结构域。类型I、II和III域分别由40、60和90 aa组成。显示了组成（RGD）和选择性剪接（LDV）、协同（PHSRN）和EDA（EDGIHEL）细胞结合位点及其整合素受体伙伴。EDA和EDB剪接在所有物种中都是相似的（无论是完全包含还是排除），而IIICS区域的剪接具有物种特异性（人类有五种变体，啮齿动物有三种变体，鸡有两种变体）。III型同源性组织在七条反平行β链中（空间和平面表示如面板B和C）。

大体上，FN存在两种变体：血浆FN（pFN），一种由肝细胞直接分泌到循环中的二聚体和可溶性形式，缺乏交替剪接的EDA和EDB序列，以及细胞FN（cFN），发现于组织的ECM中，作为一种多聚体形式组装成纤维，其中包含不同比例的EDA和EDB结构域。FN原纤维在疏松结缔组织、肉芽组织、胚胎基底膜和培养中的许多细胞类型的表面上都很突出[2,38].

FN基因结构与选择性剪接

FN是在单个基因转录后产生的，该基因由基因组中跨越90 Kbp以上的47个外显子组成。FN的III型结构域由两个外显子编码，EDA和EDB除外^第个III型结构域，每个结构域由一个外显子编码。由于单个前体mRNA内的选择性剪接，可以产生多个FN mRNA，从而产生多个蛋白质亚型(图1A). EDA和EDB外显子可以包含或排除在FN mRNA中[5,7,17,27]而III型连接段（IIICS）元件（也称为可变区或V区）经历了更复杂的拼接模式：根据物种的不同，它可以完全包括（V120）或排除（V0）或部分包括(图1). 更为复杂的是，在斑马鱼（进化中较远的物种）中，存在两个FN基因（称为FN1a和FN1b）[39,40]. FN1a没有选择性剪接（因此包括EDA、EDB和V区组成），而EDB和V区在FN1b中选择性剪接[39]. 有趣的是，V区选择性剪接的复杂性和FN亚型的总数似乎与进化规模有关。事实上，斑马鱼的FN1a基因中只发现了一个V区变异，FN1b基因中发现了两个V区变体（共有五个FN亚型，来自两个独立的基因）[39]，而青蛙中存在两种V型变体[41]和鸡（产生多达六种FN同种型）[25]，大鼠和小鼠中有三种（含十二种FN亚型）[7]，人类中有五种（产生多达二十种FN亚型）[42].

在胚胎发育期间，选择性剪接区域的内含物增加[2]出生后随着年龄的增长而大幅下降[2,11,26,43]. 然而，在某些情况下，如组织修复、组织纤维化和血管生成，“胚胎”剪接模式在成年生活中暂时重建。一个很好的例子是皮肤伤口愈合，伤口底部细胞中EDA和EDB结构域的内含物增加[16]. 同样，再生肝中两个外显子上调，但动力学不同[44——46]. 在胶原出现之前，在肺纤维化中也观察到EDA-cFN的重新出现。这些组织修复情况也以肌成纤维细胞的分化和激活为特征。这些过程需要TGFβ促进EDA外显子并入成熟的前体mRNA[47,48]通过一种未知的机制。

EDA和EDB的选择性剪接由剪接调控因子家族的成员通过独特的机制进行调节，剪接调节因子表示SR蛋白质（用于富含丝氨酸和精氨酸的蛋白质）(图2). 在EDA的情况下，调控序列位于外显子本身；在EDB的情况下，不同的调控序列位于外显子和下游内含子内。

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图2

EDA和EDB选择性剪接的机制

面板A：EDA外显子剪接受剪接因子SF2/ASF的正向调节，该剪接因子识别FN前体mRNA干环结构的环区中显示的外显子剪切增强子（ESE）。hnRNP A1支持跳过EDA外隐子。B组：剪接因子SRp40通过与EDB外显子本身内的一个富含嘌呤的序列（ESE）结合，或通过识别位于相邻下游内含子中的内含子剪接增强子（ISE），促进EDB外显子的内含。弱剪接位点的存在有利于EDA和EDB外显子的跳跃。

EDA外显子是最早报道的调控序列位于外显子本身的例子之一[49]. 它包含一个由SR蛋白（特别是SF2/ASF）识别的富含嘌呤的区域，增强外显子识别并随后包含到成熟mRNA中(图2A) [9,10,12,22]. 作为调节和复杂性的额外步骤，SR蛋白的活性受到SR蛋白激酶的调节，以响应细胞外刺激[50,51]和PKB/Akt[52]. 外显子识别的效率受转录该基因的RNA聚合酶II的启动子类型和速度的影响[12,13,53,54].

FN前信使核糖核酸的特征在于EDA外显子区域中的特定二级结构，这确保了外显子剪接增强子（ESE）区域在干环结构的环区域中的适当显示[23]. mRNA的这种特殊二级结构由附近的序列（ESS，外显子剪接沉默子）稳定。相反，EDB外显子的识别依赖于下游内含子中TGCATG重复序列的存在（ISE，内含子剪接增强子）[18,19]. SRp40对这些元素的识别增强了EDB纳入mRNA(图2B) [55]. 然而，在再生肝脏中，EDB调节的第二种机制已被确定，其功能与EDA相似：EDB的增加是由SRp40对EDB外显子中存在的特定富含嘌呤序列的识别介导的[46].

对IIICS区选择性剪接的调控机制关注较少。一种选择性剪接调控因子，称为白杏抑制因子哺乳动物同源物（SWAP），以有利于IIICS区域完全跳跃的方式影响IIICS剪接，生成IIICS-0形式；相反，SF2/ASF剪接因子刺激包含完整的IIICS区域[56]. 然而，参与IIICS区域调控的序列尚待确定。

FN与细胞受体的相互作用

FN通过蛋白质的特定位点与称为整合素的细胞受体相互作用。整合素是由α和β亚单位组成的细胞表面异二聚体跨膜受体，将ECM与细胞内肌动蛋白细胞骨架联系起来，并调节特定的信号转导级联。虽然大量整合素可以结合FN[57]，经典的纤连蛋白受体是α5β1整合素。这种整合素识别位于可移动和暴露的环区的众所周知的RGD细胞结合位点[34]在10中^第个III型重复序列，以及位于相邻9中的协同序列（PHSRN）^第个III型模块[58——60]（请参见图1A). RGD序列是原型整合素识别序列，在其他ECM蛋白中发现，如tenascin、纤维蛋白原、血小板反应蛋白、玻璃体凝集素和血管性血友病因子（vWF）[61]. 最近通过实验证实了RGD序列的功能重要性，实验表明FN基因RGD到RGE突变的敲除小鼠在胚胎第10天死亡（E10）(表1)类似α5整合素缺失动物的表型[62]. 然而，这些动物的FN可以组装成纤维体内和在体外，这表明RGD对于该功能是不必要的。

除了其细胞结合特性外，FN还结合其他糖蛋白，包括其他ECM分子，以及补体和凝血系统的成分[2,38]. 值得注意的是，在组织损伤后不久，FN与纤维蛋白和纤维蛋白原结合很强，与活化血小板一起构成临时止血凝块的大部分。FN-fibrin网经过共价交联以稳定凝块并允许修复性细胞迁移。此外，在细胞外基质中，FN可以交联胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和自身，为细胞提供稳定的基质平台。

其他细胞结合位点存在于FN的选择性剪接区域，赋予通过选择性剪接调节细胞结合能力和亲和力的能力。体外实验确定EDGIHEL序列存在于EDA域(图3)由α4β1和α9β1整合素识别[63——66]. 第二个细胞结合区位于IIICS段，包含LDV和REDV序列，由白细胞α4β1和α4β7整合素识别[67]. 相反，EDB结构域的细胞受体在很大程度上仍然未知。

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图3

显示脊椎动物EDA和EDB结构域关系的无根系统发育图

该树是通过比较EDA和EDB结构域的氨基酸序列与ClustalW2软件构建的(http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.html)通过邻接方法[137]. 生成的dnd文件是使用TreeViewPPC包绘制的。缩写如图3图例和​和44.

EDA和EDB外显子在脊椎动物中显示出非常高的同源性。事实上，在从人类到青蛙的22种脊椎动物物种中，它们的氨基酸序列同源性分别为53.3%和71.4%，EDA和EDB的相似性分别为87.8%和94.5%（参见补充图1和补充图2)与只有其他单外显子III型结构域观察到的较低保守性相比，9^第个III型重复（41.1%相同，75.5%相似）。如果考虑斑马鱼的两个FN基因，EDA和EDB的氨基酸序列同源性分别降至30%和38.5%（以及63.3%和79.1%的相似性）。脊椎动物中EDA和EDB的进化距离如图所示图3.

EDA和EDB序列在进化过程中的高度保守性及其严格调控的剪接模式，与它们在物种内的低同源性（人类EDA和EDB氨基酸序列之间只有28%的同源性）相比，强烈表明这些结构域具有保守但独特的作用。

EDA域的功能

EDA域具有多种功能，包括细胞粘附[68,69]，伤口愈合[16,70]，矩阵组件[71]，二聚体形成[72]，蛋白质分泌[73]，细胞因子依赖性基质金属蛋白酶表达[74]，细胞分化[45,75]、组织损伤和炎症[76,77]细胞周期进展与有丝分裂信号转导[69]. 然而，大多数研究都是使用在体外细胞培养系统。因此，开发转基因动物模型是专门解决这些问题的必要条件体内正确的EDA剪接的重要性得到了以下观察结果的有力支持：缺乏或组成性表达EDA外显子的小鼠寿命显著缩短[78] (表1).

在患有银屑病、类风湿关节炎、糖尿病和癌症等疾病的患者的血浆和受影响组织中发现EDA-cFN水平升高，尽管EDA-cF在这些疾病状态中的功能作用尚不清楚。没有FN胚胎发育是不可能的[三]，但携带EDB或EDA单一缺失的小鼠出生正常[78——80]. 相反，FN基因中EDA和EDB外显子的同时缺失导致胚胎死亡（尽管外显率不完全），E10.5显示严重的心血管缺陷(表1)（见下文和[81]).

EDA-cFN结构域在肺纤维化中起重要作用

纤维结合蛋白是血液中含量适中的蛋白质（人类和小鼠分别约为300–400µg/ml和580µg/ml）。组织损伤后，pFN从损伤血管中渗出，与血小板和纤维蛋白一起形成止血塞。这种富含FN的凝块作为临时基质，在伤口闭合过程中支持细胞迁移。然而，缺乏pFN的小鼠皮肤伤口可以正常愈合[82]表明损伤部位局部产生的cFN足以指导正常的愈合过程。事实上，EDA结构域在皮肤愈合中的重要性体内在缺乏EDA结构域（EDA）的小鼠中显示^−/−)显示创伤部位出现异常愈合、溃疡和炎症[78].

EDA结构域在成纤维细胞体外分化为肌成纤维细胞中具有重要的功能作用[45,75]. 在病理情况下，如果肌成纤维细胞的分化和最终清除不受调控，可能会导致组织纤维化。肺纤维化的一种威胁形式是特发性肺纤维化（IPF）。IPF在很大程度上是无法治疗的，患者最终死于肺部持续的ECM沉积，导致进行性呼吸衰竭[83,84]. 在IPF中，EDA cFN在活动性纤维化区域先于胶原沉积[85]与成纤维细胞活化标记物（α-平滑肌肌动蛋白[α-SMA]）表达增加相关。

EDA-cFN与肌成纤维细胞分化的关系体内最近已证明使用描述良好的气管内博莱霉素肺纤维化模型。在EDA中^−/−气管内注射博莱霉素的小鼠，肺纤维化得到了完全预防，表明EDA-cFN对肺纤维化的发展是必要的[86]. EDA患者未发生肺纤维化^−/−小鼠与潜在TGF-β活化减弱和肺成纤维细胞对活性TGF-(图4和表1). 值得注意的是，EDA^−/−肺成纤维细胞可以经历TGF-β诱导的肌成纤维细胞分化，但只有在含有EDA cFN的基质上才能分化(图4) [86]. 这些发现为组织纤维化的机制提供了重要的新线索。EDA-cFN对潜在TGF-β活化和肌成纤维细胞分化很重要的观察支持了先前公认的TGF-α和ECM在肺纤维化中的关键作用。此外，它还暗示EDA-cFN参与肺纤维化的发病机制。值得注意的是，当相同的EDA工程小鼠用于过敏原诱导的慢性哮喘模型时，我们再次观察到EDA cFN对肌成纤维细胞分化和随后的气道纤维化至关重要[87].

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图4

EDA-cFN在肺纤维化中的作用

成纤维细胞分化为肌成纤维细胞仅在存在EDA cFN时发生，EDA cF可由成纤维细胞（EDA）产生和分泌^{重量/重量}成纤维细胞，面板A)或自EDA以来已存在于ECM中^−/−成纤维细胞只有在EDA cFN上才能分化为肌成纤维细胞(面板A和B). 细胞分泌或已经存在于ECM中的EDA cFN激活潜在的TGFβ(面板A和B)成纤维细胞分化继续，导致肺纤维化。如果没有EDA cFN（由EDA制作^−/−电池或由EDA制备的ECM^−/−成纤维细胞，面板C)潜在TGFβ激活的缺乏限制了向肌成纤维细胞的分化，从而防止了肺纤维化。

EDA或EDB结构域在α-SMA表达中的作用似乎对其他实验模型中的非成纤维细胞不太重要，例如血管生成(表1). 事实上，对血管周围周细胞中α−SMA的分析表明，EDA-null、EDB-null和对照小鼠之间没有差异，这表明在该模型中，α−SM的表达既不需要EDA也不需要EDB[88]. 此外，视网膜、胰腺肿瘤和移植性黑色素瘤中的新生血管不受EDA或EDB剪接变体缺失的影响[88]. 然而，EDA和EDB外显子靶向缺失的小鼠在背主动脉周围显示α−SMA阳性细胞数量减少，这可能是由于这些细胞的招募或分化延迟所致[81]（见下文）。基于上述研究，很明显，在实验性和可能的人类肺纤维化过程中，EDA结构域对于肺肌成纤维细胞的分化是重要的，并且EDA cFN的缺失可以防止肺纤维化。

FN和FN亚型在血栓形成中的作用

血浆FN作为血小板表面受体的配体参与凝血和血栓形成，并与纤维蛋白交联。血小板在其α−颗粒中储存cFN（由巨核细胞前体合成）和pFN（从血浆内吞）的混合物[82,89]只有在凝血酶激活后，pFN才会释放并沉积在血小板表面。pFN在血栓形成和止血中发挥作用，这一观察得到了许多报告的支持[参见[90]]. 然而，结论性的体内其作用的证据来自三个重要观察结果：首先，缺乏纤维蛋白原和vWF（参与血小板聚集和血栓形成的关键分子）的小鼠在氯化铁动脉损伤后仍会形成血栓，从而表明FN可能是支持血小板聚集的配体[91]. 第二，条件pFN敲除小鼠形成血栓，在同一动脉损伤模型中持续释放血小板（或血小板组），减少其生长并延迟血管闭塞时间[92] (表1). 最后，FN完全杂合小鼠（pFN水平降低）在氯化铁动脉损伤后血栓形成和生长也显著减少，这是在将pFN重新注入血液后修复的缺陷[93] (表1). 总之，这些结果表明pFN增加了实验性血管损伤时形成的粘附血小板聚集物的稳定性。由于pFN在人类体内的浓度有相当大的范围，其水平的增加与冠状动脉疾病有关[94,95]这些报告在较大人群中建立了pFN浓度与动脉疾病之间的实验联系[96].

正如所料，由于pFN不包括EDA或EDB结构域，因此在EDA中未观察到血管血栓形成的差异^−/−和EDB^−/−小鼠品系[93]. 然而，有点令人惊讶的是，EDA在EDA中的FN分子中的结构性包含^+/+小鼠具有促血栓形成活性，增加了纤维连接蛋白-血小板相互作用的复杂性[97]. 尽管这些动物的pFN水平仅为正常值的20%，但在氯化铁损伤的动脉中发生闭塞性血栓的速度更快，并且在向血流中注入胶原蛋白和肾上腺素后更容易发生肺栓塞(表1).体外，EDA血小板^+/+小鼠比野生型血小板更能覆盖胶原蛋白涂层表面[97].

尚不清楚为什么循环EDA-cFN可能是促血栓形成的，尽管不同的证据表明，当包含选择性剪接结构域时，FN分子发生了重大构象变化，这可能导致FN功能增强。正常情况下，pFN在血液中以封闭、非活性的形式循环，RGD细胞结合环不可用于细胞结合(图5A). 然而，结构研究表明，插入一个额外的结构域可能导致构象变化，从而影响RGD位点的暴露[98]或其他表位[37]从而增强血液传播效应细胞上循环FN与表面整合素之间的潜在相互作用[99——102] (图5B). 由于EDA cFN比缺乏EDA的FN更能促进细胞粘附和扩散[100]循环EDA-cFN可能作为血小板和纤维蛋白（原）聚集的病灶，导致血栓形成和血管闭塞加剧。

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图5

通过包含额外域EDA和EDB实现FN可能构象变化的方案

在pFN的“封闭”或“紧密”构象中，RGD环和附近的协同位点不可用于整合素的相互作用（面板A）EDA cFN中包含EDA域(面板B)触发构象变化，增强RGD环和协同位点的暴露，以及整合素受体的结合（如图所示）。该模型假设，EDB域的包含也可以加强RGD环和协同位点的揭示(面板C). pFN中的星号表示EDB（左星号）和EDA（右星号）域的预期位置（如果插入）(面板A).

EDA结构域的包含可能触发FN分子的整体构象变化，从而通过α_IIb类β_三或其他RGD结合整合素。观察到特定EDA结合整合素（α₉β₁和α₄β₁整合素）不存在于血小板上。参与血栓形成的主要血小板整合素受体是α_IIb类β_三，尽管α_V（V）β_三和α₅β₁也可以结合RGD序列。整体构象变化（也可能由于血小板活化过程中施加的力而发生）导致整合素增强RGD结合，并可能确实负责EDA-cFN的促血栓特性[35,36,103]. 如果是真的，那么在组成性表达EDB-cFN的小鼠中也会有类似的发现（图7C）。这一假设尚未得到验证。然而，EDA和EDB缺乏导致RGD结合和FN功能受损的概念可能解释了EDA的胚胎致死性^−/−/EDB公司^−/−双突变小鼠[81].

这些观察结果表明EDA-cFN具有促血栓形成活性，并提示血浆EDA-cF水平升高可能是血栓形成的危险因素。事实上，糖尿病患者的血浆EDA-cFN水平升高[104]，血管损伤[105]和类风湿性血管炎[106]所有易导致血管血栓形成的条件。此外，最近的一项研究表明，急性卒中患者在血浆cFN水平升高的情况下，接受组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）溶栓治疗可能会增加脑出血的风险[107]表明循环cFN也可能预测血管疾病患者的不良预后。

肝细胞分泌pFN

pFN由肝细胞合成[108]. 当EDA和EDB外显子从正常肝脏的前mRNA剪接出来时，一部分mRNA包含IIICS区域。有趣的是，可溶性FN以异源二聚体的形式分泌，其中一个亚单位必须包含IIICS片段，而另一个可能不包含，如IIICS-0/IIICS+和IIICS+/IIICS＋组合[109]. 虽然合成了IIICS-0亚单位，但IIICS-O同源二聚体似乎沿着分泌途径降解[109]. 特别值得注意的是，IIICS-0同型二聚体与循环EDA-cFN二聚体非常相似，具有增强的促血栓特性[110]. 在活泼地和在体外、EDA⁺/EDA公司⁺EDA产生的二聚体^+/+肝细胞不能有效地分泌到血浆或培养基中，并且似乎被选择性降解，这可能是由于未折叠或错误折叠的构象所致[111]. 因此，EDA中的血浆FN浓度^+/+小鼠仅为对照动物的20-25%[78,111].

人们很容易认为pFN的促血栓形成形式在进化过程中发生了负选择。因此，肝细胞可能已经发展出至少两种机制来避免EDA的分泌⁺或IIICS-0/IIICS-0 FN亚型进入血液。第一个是剪接机制从FN mRNA中完全排除EDA外显子[6]第二个是这些促血栓形成亚型在细胞内的明显降解[109,111]. EDA的促血栓特性⁺和IIICS-0 FN可能有助于解释pFN和cFN的剪接模式。确定EDB是否⁺FN同种型也具有促血栓形成的特性。

缺乏EDA外显子调控剪接的小鼠在行为和运动协调方面存在缺陷

缺乏EDA外显子调控剪接的小鼠大脑中没有明显的形态学改变[78,112]. 然而，令人惊讶的是，每个突变株显示出不同的CNS相关缺陷，表明每个FN亚型的作用不同(表1). EDA公司^+/+在开阔地试验中，小鼠的水平探索活动减少，但垂直探索活动没有减少。相反，在同一测试中，EDA^−/−小鼠的垂直探索活动减少，但水平探索活动没有减少[112]. 此外，只有EDA^−/−在加速旋转试验中，小鼠表现出明显的损伤，该试验要求增强运动协调能力，并给出小脑功能受损的概念。因此，EDA外显子的调控剪接似乎对小鼠和其他物种的正常大脑功能和行为至关重要。虽然原因尚不清楚，但EDA cFN的组成性存在或缺失可能会影响中枢神经系统神经元、轴突和树突迁移过程中的微调。这与之前报道的FN在中枢神经系统轴突再生和迁移中的作用一致[113,114]. 相反，在EDB中未观察到行为改变^−/−小鼠[79]这表明这种亚型在大脑发育和功能中的作用可能不那么重要。

虽然有必要进行进一步的解剖学、行为学和电生理学研究，以更好地了解上述运动障碍的神经基础，但这些行为改变可能对生活在自然选择工作条件下的小鼠不利。虽然纯粹是推测性的，但这可能部分解释了EDA和EDB外显子在物种间的高度保守性（参见补充图1和2)以及这些剪接变异体的保守表达模式[2,20,99].

EDA-cFN在动脉粥样硬化中的作用

大量证据表明FN及其亚型与动脉粥样硬化的发生有关。动脉粥样硬化涉及一系列需要与细胞外基质强烈相互作用的事件，如血液单核细胞向动脉内膜募集、成熟为组织巨噬细胞、脂质积聚导致泡沫细胞形成以及平滑肌细胞从动脉壁迁移[115]. 值得注意的是，如果没有稳定的单核细胞与组织的相互作用，脂质不会积聚，泡沫细胞也不会形成，这表明特定ECM依赖性信号的重要性[116]. 正常动脉壁中存在大量FN，且严格缺乏EDA和EDB结构域。然而，在动脉粥样硬化病变和实验诱导的主动脉增厚中，与平滑肌细胞相邻的总cFN和EDA cFN显著增加[117,118]. EDA-cFN在这种情况下的一个可能作用可能是激活toll样受体（TLR）4[77]从而触发核因子（NF）-κB的核移位，核因子是炎症和动脉粥样硬化的核心分子[119]然而，在EDA的精细研究之前，EDA-cFN在动脉粥样硬化的发展和进展中的确切作用尚不清楚^−/−小鼠与动脉粥样硬化蛋白ApoE杂交^−/−老鼠[80] (表1).

在这些研究中，ApoE^−/−/EDA公司^−/−与ApoE相比，小鼠主动脉树中的动脉粥样硬化病变较小^−/−控制动物。在一个在体外泡沫细胞分析，来自ApoE的巨噬细胞^−/−/EDA公司^−/−与对照巨噬细胞相比，小鼠积累的修饰胆固醇更少，这表明EDA-cFN在血脂代谢和泡沫细胞形成中发挥作用。然而，最近的一份报告质疑FN剪接的调节，而不是产生的剪接变体，因为它在动脉粥样硬化中更重要[120]. 在这一系列实验中，老化的EDA^−/−或EDA^+/+采用纯C57Bl/6基因背景的小鼠喂养致动脉粥样硬化饮食(表1). 正如人们所期望的那样，EDA^−/−与巨噬细胞胆固醇摄取减少相关的小鼠动脉粥样硬化病变更小、更少。然而，令人惊讶的是，EDA^+/+老鼠也显示病变大小和频率以及巨噬细胞胆固醇摄取量均显著降低[120]. EDA之间的类似发现^−/−和EDA^+/+小鼠支持一种与EDA选择性剪接的基因消除相关的共同机制可能影响斑块形成的某些过程。尽管这些观察的分子机制尚未确定，但它们强调了选择性剪接调控在疾病发病机制中的关键作用。

EDB域的功能角色

尽管EDB外显子的鉴定已经过去了20多年[17]，含有该结构域的FN亚型的生物学功能尚不清楚。一次试图阐明EDB外显子在基因靶向早期的作用的尝试不幸地导致FN基因完全无突变（由于侧翼内含子中存在新霉素盒），表现出与FN基因靶向突变后先前观察到的表型相似的表型[121]. 随后，第二株EDB^−/−鼠标已生成[79]; 这些小鼠发育正常，可以生育。有趣的是，在这个菌株中没有观察到明显的表型体内甚至在分析了一些EDB先前被认为参与的不同模型后，如行为、血管生成、血栓形成、器官发生、肿瘤发生和骨折愈合[79,88,93]. 然而，轻度在体外在EDB中观察到基质组装和增殖的影响^−/−胚胎成纤维细胞[79] (表1). 这些细胞生长较慢，并产生比对照MEF沉积的细胞短而薄的纤维。EDB在FN矩阵组装中的假定作用与之前的报告一致，该报告显示EDB cFN更有效地并入ECM[71]. 以类似的方式，EDA^+/+MEF比EDA制备的MEF生长速度更快^−/−或WT胚胎（A.F.Muro，未发表的观察结果），支持之前在体外支持EDA结构域在细胞增殖中发挥作用的数据[69]. 然而，没有体内已在任一EDB中确定相关性^−/−、EDA^−/−或EDA^+/+动物[78,79]提示其他对细胞增殖的影响可能弥补EDA和EDB cFN的微小调节作用。

尽管EDB中没有明显的表型^−/−小鼠的氨基酸序列在物种间的保守性极高（22种不同脊椎动物中约95%，参见图4)高度提示该片段的重要功能可能在其他病理生理条件下或对外部应激的反应中变得明显。事实上，在tenascin-C基因敲除小鼠中也发生了类似的情况。在这些动物中，缺乏tenascin-C不会导致发育、寿命或生育能力异常[122,123]. 然而，使用特定模型观察到明确的表型，如角膜损伤、行为测试[122——125]，以及对大脑神经化学和神经肌肉接头进行更急性的检查[126——128]仅举几个例子。因此，有必要进一步研究EDB-cFN在病理生理或应激模型中的作用，以更好地确定该剪接亚型的潜在作用。

EDA和EDB联合（双）敲除小鼠

EDA cFN和EDB cFN在组织和血管重塑中高度表达。它们存在于胚胎血管周围，但在成人或小鼠的正常动脉和静脉中不存在[16,129]. 这些结构域在病理组织再生和血管生成过程中重新出现，例如在肝脏再生、伤口愈合和肿瘤发展过程中。

旨在确定体内EDA和EDB功能，最近产生了同时缺失这两个结构域的小鼠菌株[81]. 携带EDA的小鼠^−/−/EDB公司^−/−在混合c129和C57Bl/6遗传背景中，双突变是胚胎致死性的，约80%的外显率(表1). 未观察到FN的产生或细胞-表面结合缺陷，表明EDA和EDB的缺乏共同导致了生存能力的缺陷。大多数受影响的胚胎都有各种心血管缺陷，这让人想起FN-null胚胎中观察到的表型，但程度较轻[三]. 对EDA和EDB cFN表达的详细分析表明，在E9.5和E10.5时，野生型窝鼠的背主动脉周围存在它们，与α−SMA表达相关，表明EDA和EDB cFN可能在胚胎发育期间主动脉血管的发育中起作用。EDA公司^−/−/EDB公司^−/−双突变体在E9.5具有异常圆形形态的α-SMA阳性细胞数量减少，但在E10.5时α-SMA表达细胞的数量相对相等，这表明可能存在招募或分化缺陷[81].

EDA中的小血管不是形成独特的血管管^−/−/EDB公司^−/−未正确形成双突变体小鼠。内皮细胞膜而非管的形成可能是由于在缺乏EDA和EDB的情况下内皮细胞顶基底外侧极性缺陷所致[81]. 内皮细胞和气道上皮细胞分别报告了FN和EDA cFN亚型的极化分泌[73,130]. 所以，双突变小鼠的血管缺陷可能与内皮细胞极性缺陷导致异常内皮管形成有关。

由于EDA或EDB外显子的缺失不会导致血管生成或胚胎或新生血管区域血管周围α−SMA阳性细胞水平的明显缺陷[78——80,88,120]，可以合理假设EDA和EDB域的作用可能不同，尽管它们可能具有一些冗余功能。此外，只有一个结构域的存在就足以实现血管的正常发育，而这两个结构域协同删除后就不存在了。

虽然敲除FN的EDA和EDB结构域的表型分支尚未完全理解，但我们能够理解该模型的一些含义。首先，很明显FN，特别是EDA和EDB域，对心脏和血管的发育至关重要。事实上，至少有一个额外结构域的存在是心脏和血管正常发育所必需的。此外，EDA和/或EDB cFN似乎对血管相关α−SMA细胞的招募或分化是必要的。动物的遗传背景也可能影响FN在发育中的作用；在纯C57Bl/6小鼠上创建的FN-null小鼠心脏发育缺陷较轻，而129/Sv背景上的相同突变导致心肌和心内膜形态发生严重缺陷[131,132]. 进一步详细说明体内和在体外对该菌株的分析将提供对EDA和EDB结构域在上述过程中作用的分子机制的见解。

结束语

ECM显然是一种动态结构，在稳态和疾病状态期间为细胞提供指导性信号。FN是ECM的主要成分，已被广泛研究，试图确定人类中20多种可能亚型的功能。通过严格的研究，越来越清楚的是，交替拼接的EDA和EDB结构域具有允许功能变化的独特特性。FN基因靶向突变的转基因小鼠在大多数情况下表现出明确的表型；然而，在压力或疾病的条件下，这些表型可能会有很大的不同。脊椎动物进化过程中两个外显子的高度保守性以及不同生物体中剪接的保守模式强烈支持进化保守功能的观点。此外，它还表明FN基因的调控剪接在小鼠，也许在人类中具有适应性优势。

选择性剪接FN亚型功能的更精确定义有待进一步详细说明体内和在体外现有模型的研究和FN基因具有异型体特异性突变的新工程小鼠菌株的产生。这些分析将帮助我们更好地阐明FN交替剪接亚型激活的分子相互作用和信号通路，交替剪接机制在调节细胞和生物体表型中的作用，以及目前未知的FN功能和多态性与人类病理状态相关的机制的身份。

补充材料

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