肝素杂志。作者手稿;PMC 2016年2月1日提供。
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酒精直接刺激肝星状细胞的表观遗传学修饰
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斯蒂芬·希尔
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雷切尔·霍沃思
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吴绍纲
2南加州ALPD和肝硬化研究中心和南加州大学凯克医学院病理学系;和美国加利福尼亚州洛杉矶市大洛杉矶医疗系统退伍军人事务部
宋美奎恩
2南加州ALPD和肝硬化研究中心和南加州大学凯克医学院病理学系;和美国加利福尼亚州洛杉矶市大洛杉矶医疗系统退伍军人事务部
杰里米·弗伦奇
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史蒂夫·怀特
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冢本秀一(Hidekazu Tsukamoto)
2南加州ALPD和肝硬化研究中心和南加州大学凯克医学院病理学系;和美国加利福尼亚州洛杉矶市大洛杉矶医疗系统退伍军人事务部
Derek A.Mann(德里克·A·曼)
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杰勒娜·曼
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1医学院细胞医学研究所,4第个英国NE2 4HH泰恩河畔纽卡斯尔Framlington Place纽卡斯尔大学William Leech大楼楼层
2南加州ALPD和肝硬化研究中心和南加州大学凯克医学院病理学系;和美国加利福尼亚州洛杉矶市大洛杉矶医疗系统退伍军人事务部
*通讯作者:Jelena Mann,英国NE2 4HH泰恩河畔纽卡斯尔Framlington Place,纽卡斯尔大学William Leech大楼4楼,医学院细胞医学研究所。电话+44 191 222 5902。传真:+44 191 222 0723。ku.ca.lcn@nnaM.aneleJ - 补充资料
补充的。
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摘要
背景和目标
酒精是肝病的主要病因,也是其他肝病病因的重要共同发病因素。进展性肝病的一个共同特征是纤维化,这是由纤维形成细胞外基质(ECM)的净沉积引起的。肝星状细胞(HSC)被广泛认为是纤维化ECM的主要细胞来源。我们确定HSC是否对酒精的直接刺激有反应。
方法
将正在进行转分化的HSC与乙醇孵育,并测量成纤维基因和表观遗传调控因子的表达。使用ChIP-Seq和生物信息学分析研究了记录变化的机制。使用从小鼠酒精模型、ALD患者肝脏和精确切割的肝脏切片中分离的HSC证实乙醇诱导的变化。
结果
HSC对乙醇暴露的反应是增加促纤维化和ECM基因表达,包括弹性蛋白。乙醇诱导多个表观遗传调控因子的表达改变,表明在HSC转分化过程中可能调节染色质结构。MLL1是一种组蛋白3赖氨酸4(H3K4)甲基转移酶,由乙醇诱导并招募到弹性蛋白基因启动子中,在那里它与活性染色质标记H3K4me3的富集相关。染色质免疫沉淀测序(ChIPseq)显示,乙醇对HSC表观基因组有广泛影响,并鉴定出41个基因位点,其中MML1及其H3K4me3标记均因乙醇而富集。
结论
乙醇通过刺激染色质结构的全局变化直接影响HSC转分化,从而导致ECM蛋白的表达增加。酒精在HSC转分化过程中重塑表观基因组的能力为其作为肝病共病因子提供了机制。
关键词:ALD、HSC、弹性蛋白、MLL1、H3K4me3、表观遗传学
介绍
慢性饮酒既是肝病的直接原因,也是其他主要原因(如病毒性肝炎)导致肝病进展的主要合并症因素[1,2]. 解释酒精肝毒性的机制开始被理解,并有助于解释酒精对肝脏疾病的影响。酒精及其代谢物,特别是活性氧(ROS)、羟乙基自由基和一氧化氮是肝细胞损伤的主要原因[三]. 此外,这些代谢物可通过TNFα等细胞因子诱导肝脏炎症,是酒精诱导肝细胞损伤和死亡的重要间接原因。此外,ROS介导的脂质过氧化被认为会对肝细胞蛋白质造成损伤,从而导致抗原反应,从而使炎症和肝脏损伤永久化[4].
肝细胞损伤和炎症刺激常驻的窦周HSC转分化为α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)阳性的肌成纤维细胞。这些所谓的“活化”HSC(aHSC)是纤维化ECM蛋白的主要肝细胞来源,并促进慢性肝病中纤维化ECM的净沉积[5]. 促进肝病进展为严重纤维化的分子过程尚不明确,但aHSC持续产生ECM蛋白是一个主要的促成因素。此外,aHSC分泌蛋白质,促进纤维化ECM的交联、成熟和不溶性,如弹性蛋白。弹性蛋白是赖氨酰氧化酶或组织转谷氨酰胺酶催化交联的靶点[6]并且其在纤维化ECM中的积累限制了其降解的可能性以及对纤维化组织可逆性程度的影响。因此,刺激ECM成熟蛋白(如弹性蛋白)表达的因素可能决定肝病的纤维化进展。
我们实验室和其他研究人员最近的研究揭示了表观遗传信号事件在HSC转分化和纤维化发生中的重要性。表观遗传标记的实验操作,如DNA甲基化、组蛋白乙酰化/甲基化以及注释或解释这些表观遗传标志的蛋白质活性,可以对HSC表型产生深远影响[7]. 酒精可以刺激肝组织表观遗传变化的概念已经确立。乙醇会损害蛋氨酸的正常代谢,进而影响DNA和组蛋白甲基化中以S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)形式存在的甲基的可用性[8]. Kendrick及其同事表明,乙醇或乙酸降低组蛋白去乙酰化酶活性,上调乙酰辅酶A合成酶的表达,导致组蛋白乙酰化和炎症基因转录活性增加[9]. 关于酒精影响HSC表观基因组和ECM蛋白表达的可能性,人们知之甚少。
在这里,我们研究了酒精对HSC转分化过程中表观遗传调控因子表达的影响,并报道了组蛋白修饰酶(如H3K4甲基转移酶MLL1)在暴露于乙醇的HSC中上调,导致包括弹性蛋白在内的纤维化前基因表达的改变。我们对乙醇刺激HSC中的H3K4me3特征和MLL1进行了组合染色质免疫沉淀测序(ChIPseq)分析,结果显示染色质结构发生了广泛变化,证实了酒精对HSC转分化的深远全基因组影响。我们认为,我们的发现为酒精在慢性肝病中作为共同发病因素和纤维化刺激物的机制提供了新的见解。
材料和方法
伦理学
作者持有当地伦理委员会和英国内政部颁发/批准的动物实验许可证。
人体受试者
纽卡斯尔和北泰恩赛德地方研究伦理委员会批准使用人体组织(批准号H10/H0906/41)。所有样本均在患者书面同意的情况下收集和使用。
细胞分离和培养
所有大鼠均购自英国Charles River。大鼠肝星状细胞(rHSC)是从350g Sprague-Dawley大鼠的正常肝脏中分离出来的,通过胶原酶和蛋白酶的顺序灌注,然后在11.5%Optiprep(Sigma-Aldrich,Gillingham,Dorset,UK)中不连续密度离心。将细胞培养在塑料上的Dulbecco改良Eagle's培养基中,补充100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和16%胎牛血清,并将其保存在37°C、5%CO2的培养箱中。在培养的第1天、第2天和第10天用86mM乙醇(相当于人类大量饮酒的剂量)处理HSC 24小时和48小时[10]. 为了创造乙醇饱和的环境并防止培养基蒸发,在处理前24小时,将水中0.5%的乙醇添加到培养箱中。醋酸盐处理-用1mM乙酸钠处理HSC的第2天培养物,这是一种在代谢86mM浓度乙醇的人身上发现的醋酸盐浓度[9].
动物模型
男性第1a1-GFP列喂食小鼠(12周龄)随意2周,食用高胆固醇(1%或0.5%)和饱和脂肪(27%Cal或22%Cal作为猪油)的液体“西方饮食”(WD)。然后,饮食改为含乙醇的西方饮食8周。乙醇摄入量逐渐增加,从第1天的1%(w/v)增加到第12天的4.5%(w/v),直到8周喂养结束。从喂食乙醇的第二周开始,每周通过胃管大量饮酒,重复7次。暴饮剂量从3.5g/kg逐渐增加到4.5g/kg。对于对照小鼠,年龄和性别匹配第1a1-GFP列小鼠被喂食常规食物。
HSC与模型隔离
通过蛋白酶-胶原酶灌注和梯度超速离心收集非实质性肝细胞部分。GFP荧光由氩激光在488 nm处激发,并通过530 nm滤光片进行测量,维生素a紫外荧光由氪激光在350 nm处激发并通过350 nm滤光镜进行测量。UV-/GFP+细胞(aHSC)收集在含有DNAse培养基的试管中。
交联染色质免疫沉淀(XChIP)分析
染色质免疫沉淀(ChIP)检测MLL1和H3K4me3结合,方法是使用50μg交联染色质,将细胞固定在1%甲醛中,然后在Diagenode Bioruptor中对裂解的细胞进行超声处理5分钟。预先清除的染色质与5μg抗MLL1或H3K4me3抗体孵育,沉淀、洗涤和洗脱复合物。反向交联并纯化基因组DNA。每个PCR反应重复进行两次,并且从独立的ChIP实验中重复分析至少三次。根据实验的平均值计算每个样本的信号强度值。洗脱液的平均值归一化为对照抗体样品的平均值,并表示为背景(即对照抗体)上的倍增。使用下列引物进行定量PCR扩增表2和表3.
ChIP-seq和生物信息分析
如上所述进行ChIP分析。然后根据Illumina的TruSeq DNA(LS)协议,使用500ng基因组DNA构建文库。选择的DNA片段插入大小为550bp。为了提高文库的最终浓度,进行了十次PCR反应。ChIP-seq结果通过标准ChIP分析和使用引物进行的定量PCR进行验证表3使用基于ChIP-Seq(MACS)软件的模型分析对ChIPseq数据进行分析,利用bowtie2比对Ensembl(Rnor5.0)中注释的大鼠基因组,并与每个免疫沉淀的对照进行比较。峰值被称为具有重要意义第页-1e-07的值。使用IGV浏览器可视化生成的峰值列表(http://www.broadinstitute.org/igv/home).
免疫组织化学、SDS-PAGE和免疫印迹、定量PCR(RTqPCR分析)和微球菌核酸酶消化补充材料和方法
结果
乙醇促进HSC转分化并刺激组蛋白修饰酶在转分化HSC中的表达
原代大鼠HSC的培养诱导激活与ECM基因转录活性和表达的时间依赖性增加有关,包括I型和III型胶原、原弹性蛋白(弹性蛋白)和金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)(补充图1). 新分离的(第1天)HSC表达这些基因的低水平或检测不到的转录水平,随后在培养第3天诱导至可检测水平,并随着细胞获得肌纤维母细胞表型,随着进一步培养,表达继续增加。为了确定酒精对HSC转分化的影响,我们将早期转化的HSC(培养第1天和第2天)暴露于乙醇中(). 乙醇治疗过渡期HSC可增强胶原蛋白基因(I、III和IV)、弹性蛋白和TIMP-1的表达(). 乙醇还增强了甲基-DNA结合蛋白MeCP2的表达,MeCP2是HSC转分化的主要表观遗传调节因子[11]. 与这些刺激作用相反,乙醇对肌纤维母细胞aHSC的基因表达没有影响(补充图2A). 虽然醛脱氢酶(ALDH2)仍处于上调状态,但aHSC中代谢酶乙醇脱氢酶(ADH1)和CYP2E1的水平均显著降低,这可能解释了这种作用的缺乏(补充图2B).
乙醇加速HSC转分化并诱导ECM、纤维前生成基因和表观遗传调控因子的表达(A) HSC激活时间过程中乙醇处理的示意图。从细胞培养诱导激活的第1天、第2天或第10天开始,用86mM乙醇处理新鲜分离的大鼠HSC 48小时。通过RT-PCR对在第1天和第2天用86mM乙醇处理24小时或48小时的至少四种不同的原代大鼠HSC制剂中胶原蛋白I、III、IV(B)、弹性蛋白、MeCP2和TIMP-1(C)组蛋白赖氨酸甲基转移酶(D,E)和组蛋白赖胺酸脱甲基酶(F,G)的(B-G)mRNA水平进行量化。误差条表示平均值±平均标准误差(SEM)。*p<0.05;**p<0.005;***p<0.001。(H,I)通过SDS-PAGE分离来自至少2种用86mM乙醇培养48h的大鼠HSC制剂的30μg全细胞蛋白提取物,并对MLL1(H)或弹性蛋白(I)进行免疫印迹。β-actin作为负荷对照。
HSC转分化受到严格的表观遗传控制,因此我们有兴趣发现乙醇对表观遗传调节因子的影响,这可能是其增强HSC转分能力的基础。定量RT-PCR分析表明,乙醇对HSC过渡期组蛋白赖氨酸甲基转移酶和去甲基化酶转录本的表达具有广泛的刺激作用(). 特别令人感兴趣的是组蛋白3赖氨酸4(H3K4)甲基转移酶(MLL1、MLL2、MML3、MML5和ASH1)的增强表达,因为这种染色质修饰通常与转录活性基因有关[12]. MLL1是H3K4甲基转移酶,对乙醇的反应最显著且可重复诱导,而且这种作用在蛋白质水平上重现(). 我们还证实了在相同条件下弹性蛋白的上调().
MLL1和H3K4甲基化在弹性蛋白基因处富集,以响应乙醇
由于弹性蛋白和MLL1在乙醇作用下表现出相似的表达增加,我们研究了功能关系。对弹性蛋白基因MLL1的ChIP分析表明,与定位于上游调控区域的qHSC相比,aHSC中的MLL1结合更丰富(). aHSC中也观察到ASH1结合增强的适度趋势,而MLL5与弹性蛋白基因的关联在qHSC和aHSC之间没有变化(补充图3). 这些数据表明,在与MLL1的HSC转分化过程中,H3K4甲基转移酶与弹性蛋白基因的占有率的选择性和动态变化可能发挥重要的调节作用。用乙醇处理HSC,使MLL1与弹性蛋白基因调控区的结合增强3倍(). 为了确定乙醇诱导的MLL1关联的功能后果,我们检测了对照组和乙醇处理的HSC中弹性蛋白基因的H3K4me2和H3K4me3景观(). 乙醇处理(虚线)增强了H3K4me2和H3K4me3的特征,特别是在弹性蛋白基因转录起始位点(-500到+500)周围的区域,这些区域有望促进染色质的转录活性状态。H3K4甲基化的这些变化可能仅仅是局部染色质结构显著改变的结果。然而,根据微球菌核酸酶消化谱测定,我们没有观察到乙醇诱导的弹性蛋白基因核小体间距的任何明显变化(补充图4),这反对乙醇对染色质的非特异性影响。
乙醇诱导MLL1与弹性蛋白启动子结合,增加H3K4的三甲基化以及弹性蛋白转录和蛋白表达(A) 50μg来自静止大鼠HSC或完全激活的肌成纤维细胞的交联染色质与5μg抗MLL1抗体孵育,并进行ChIP分析。用86mM乙醇处理第2天HSC 48小时后的交联染色质对MLL1(B)或H3K4me2和H3K4me3(C)进行(B-C)ChIP分析,如(A)所示。在ChIP之后,使用免疫沉淀的基因组DNA作为模板,使用针对弹性蛋白基因(A-C)不同区域的特异性引物进行qPCR反应。(D) 用qPCR定量三种不同PCLS制剂中的弹性蛋白mRNA水平,并用86mM乙醇处理24h、48h或72h。(E)如(E)所示,从切片中提取30μg全细胞蛋白,对弹性蛋白和β-肌动蛋白进行免疫印迹。(F) 用qPCR定量分析三种不同制备的精密切割正常大鼠肝组织切片中的弹性蛋白mRNA水平,分别用1mM醋酸钠处理24h、48h和72h。相关面板中的误差条代表平均值±平均标准误差(SEM)。*p<0.05;**p<0.005;***p<0.001。
乙醇直接诱导肝组织中弹性蛋白的表达
为了验证乙醇诱导弹性蛋白表达这一发现的生理相关性,我们询问是否可以在更复杂的组织培养系统中重现这种效应。为此,我们从正常大鼠肝脏中制作了精确切割的肝切片(PCLS),这些肝切片在无乙醇或有乙醇的情况下培养24、48或72小时。在转录水平上,我们观察到乙醇处理的PCLS在48和72小时后诱导弹性蛋白表达(). 这种效应与维持高水平弹性蛋白表达有关,而在对照培养物中,弹性蛋白表达在培养48小时和72小时时降低(). 人们普遍认为,乙醇的大多数毒性作用,包括其促纤维化特性,都是由其代谢物乙醛和醋酸盐介导的[13,14]. 因此,在PCLS中,很难区分乙醇对弹性蛋白表达的直接影响与其主要代谢物的间接影响。因此,我们重复了PCLS实验,但用其稳定代谢物醋酸盐替换了乙醇。醋酸盐处理对弹性蛋白mRNA或蛋白质水平的表达没有影响,这表明在这个复杂的培养系统中,乙醇对弹性蛋白基因转录有直接影响(). 接下来,我们检测了弹性蛋白及其调节因子MLL1在人类ALD中的表达。与正常人肝脏相比,ALD外植体肝组织中弹性蛋白mRNA表达以及胶原I和III升高(). 组蛋白赖氨酸甲基转移酶的表达谱显示,ALD与MLL1和MLL3转录物的显著表达增加以及MLL5和ASH1的高表达趋势有关(). 蛋白水平证实ALD组织中弹性蛋白和MLL的表达增加(). 弹性蛋白的IHC染色()和MLL1()显示前者主要局限于ALD中的纤维化组织,而组蛋白甲基转移酶在肝细胞、胆管和纤维化疤痕中表达。
ALD与MLL1和弹性蛋白表达增加相关(A) 用qPCR法对六种不同制备的正常人肝脏或酒精性肝病外植体细胞外成分胶原蛋白I、III、弹性蛋白和纤维连接蛋白的mRNA水平进行定量。(B) 组蛋白赖氨酸甲基转移酶通过qPCR定量,如(A)所示。相关面板中的误差条代表平均值±平均标准误差(SEM)。*p<0.05;**p<0.005。(C-D)对6例正常人肝脏(NHL)或5例酒精性肝病移植组织样本的30μg全细胞蛋白进行MLL1、弹性蛋白和β-肌动蛋白免疫印迹。(E) 正常人肝脏或ALD移植肝脏中显示MLL1和弹性蛋白免疫化学染色的代表性切片。
为了检测MLL1表达的增加是否与ALD而不是肝硬化的存在有特异性关系,我们检测了移植的肝硬化原发性硬化性胆管炎(PSC)肝脏中MLL1和弹性蛋白的表达(补充图5A和B). 肝硬化PSC肝脏中未检测到MLL1的表达,而弹性蛋白水平与正常人肝脏中的相似(补充图5A和B). 这些数据表明,MLL1表达的增加以及下游事件与ALD的病因有关,而与晚期肝硬化的存在无关。
乙醇改变了HSC的全球染色质景观
预计HSC转分化的基础是HSC表观基因组的整体重塑,特别是与基因激活和沉默相关的组蛋白修饰。然而,上述数据仅限于一个基因弹性蛋白,因此不能充分支持乙醇对HSC染色质重塑有更广泛的影响。为了解决这一缺陷,我们对MLL1和H3K4me3进行了ChIPseq,比较了控制过渡HSC和乙醇处理过渡HSC。根据获得的原始ChIPseq数据(补充图6),我们对基因组中的MLL1和H3K4me3峰进行了组合生物信息学分析。在对照组HSC培养物中,MLL1和H3K4me3峰值之间似乎存在密切的相关性(). 乙醇处理显著重塑了这种紧密的MLL1/H3K4Me3关联,结果显示,单独的MLL1、单独的H3K4Me3或作为紧密组合的MLL1/H3K4Me3中显示的峰子集诱导增加(). 对这些图的查询显示,乙醇诱导MLL1和H3K4me3联合富集的41个基因位点(表4). 选择其中两个MLL1/H3K4me3靶点,即原癌基因c-Jun和成纤维细胞生长因子结合蛋白3(FGFBP3),我们确认其表达受到乙醇处理的刺激(和补充图7A). 此外,局部特异性ChIP分析证实,这两个基因在MLL1结合和H3K4me3修饰方面都经历了乙醇诱导的组合富集(和补充图7B). 鉴定了乙醇对造血干细胞的表观遗传学修饰在体外,我们想知道是否也发生了类似的变化体内乙醇消耗后。为此,我们比较了FACS分类法分离的HSC的表观遗传修饰第1a1-GFP列对小鼠进行WD+酒精喂养和每周狂欢或定期喂食,使用ChIPseq进行MLL1和H3K4me3修饰。我们不是从WD或酒精喂养小鼠中获得对照HSC(这将构成最合适的实验对照),而是故意使用从第1a1-GFP列正常饮食的小鼠表现出最正常的状态,强调了复杂的ALD发病机制引起的变化体内。对获得的数据进行生物信息学分析后,我们能够确认体内WD+乙醇联合体内治疗对HSC表观基因组的影响与在体外培养的大鼠HSC中观察到的相似(表5和). 分析显示543个基因与高H3K4me3富集相关;在WD+乙醇喂养的小鼠中,468个基因与MLL1相关,其中42个基因同时富集H3K4me3和MLL1(表5和). 重要的是,在所有组中发现的大约四分之一的基因在功能上与纤维化和染色质修饰过程有关(,所有面板)。
ChIP-Seq揭示了乙醇处理的早期过渡HSC中MLL1和H3K4三甲基化的复杂性使用来自对照组(A)的交联染色质或用86mM乙醇(B)处理48小时的第2天HSC进行MLL1或H3K4me3的(A-B)ChIP分析,并在Illumina测序器MiSeq上对gDNA进行测序。显示MLL1和H3K4me3与大鼠HSC基因组内序列结合的相关分析图,红色簇表示序列高度相似的区域。MLL1和H3K4me3与对照组(A)和乙醇处理的HSC(B)大鼠基因组序列结合的相关性分析。红色圆圈(左上)表示乙醇暴露后MLL1仅富集的区域,浅蓝色圆圈(右下)表示结合与对照HSC中的结合没有变化的区域;绿色圆圈(右上)突出显示了MLL1和H3K4me3结合随着乙醇处理而增加的区域,紫色圆圈(右下)显示了仅H3K4me3结合在乙醇暴露后增加的区域。(C) 在用86mM乙醇培养48小时的第2天,用qPCR对四种不同的对照或大鼠HSC制剂中C-Jun的mRNA水平进行定量(左面板)。用SDS-PAGE从相同样品中分离30μg全细胞蛋白,并对c-Jun和β-actin进行免疫印迹。(D) 使用来自对照组或第2天用86mM乙醇处理48小时的HSC的交联染色质对MLL1和H3K4me3进行ChIP分析验证,并测试其与c-Jun启动子的结合。误差条表示平均值±平均值的标准误差(SEM)。*p<0.05;**p<0.005。E) 对从WD+乙醇饲料或对照中分离的HSC的染色质进行A-B中的ChIP分析第1a1-GFP列老鼠。饼图显示了MLL1、H3K4me3和双阳性ChIP-seq组中发现的基因的数量和百分比功能聚类。
发现列出的一些基因与体外ChIPseq结果重叠;这些在中以红色突出显示表5此外,体内分析确定弹性蛋白是体内WD+乙醇喂养诱导表观遗传变化的靶点之一(表5,以蓝色突出显示)。
讨论
肝病进展为肝硬化是高度动态的,患者之间存在差异。这种变异性的部分原因是遗传因素、发病年龄、性别和各种环境共同发病因素,包括饮食、吸烟和饮酒。了解这些遗传、年龄/性别和环境影响如何结合起来决定疾病的病程是一个重要的挑战,可以改善疾病预后和患者分层。酒精既是肝脏疾病的重要原发病因素,也是继发性共发病因素,可影响不同原发病原因(如病毒性、自身免疫性和代谢性损伤)的慢性肝病进展[1,2]. 因此,了解酒精是如何影响炎症和纤维化等核心机制的,而炎症和纤维化是肝脏疾病进展的常见原因,这一点非常重要。HSC转分化被广泛认为是肝纤维化的关键事件,而与肝损伤和炎症的原因无关[15]. 因此,调节HSC转分化的微环境中的线索有可能改变纤维化反应,进而改变肝脏疾病的进展速度。这里我们已经表明,在HSC转分化的早期阶段,HSC表观基因组的重塑可以受到乙醇的影响,从而导致基因表达的全基因组改变,包括ECM的增强表达。因此,HSC在其他主要损伤(如病毒、免疫攻击或代谢因子)的刺激下被激活,将有效地受到乙醇的“二次打击”,乙醇在表观遗传水平上起作用,以修改基因表达和纤维形成。
先前的研究表明,乙醇通过许多潜在机制在肝脏中发挥其基因诱导作用,这些机制集中于组蛋白H3中赖氨酸乙酰化的增加。这些机制包括氧化应激(通过ROS),除了诱导H3K9乙酰化的变化外,还影响ALD1转录。进一步的研究表明H3K9和H3K23是乙醇相关表观遗传调控的直接靶点,至少在肝细胞中可能是ERK信号的下游[16-18].
为了理解我们研究中乙醇诱导的表观遗传变化的本质,我们首先将ECM基因作为乙醇诱导HSC转化修饰的读数,目的是确定HSC的纤维化表型是否易受酒精影响。我们对乙醇暴露后弹性蛋白表达的增强特别感兴趣。以前的研究报告称,弹性蛋白在肝损伤开始时由HSC表达,但仅在损伤后期积聚在组织中[19]. 弹性蛋白在瘢痕组织中的沉积主要由巨噬细胞衍生的MMP12的弹性蛋白酶降解活性控制,在损伤后期,MMP12被TIMP-1抑制,这使弹性蛋白得以净积累。我们观察到,乙醇不仅刺激弹性蛋白的增加表达,还通过HSC增加TIMP-1的表达,因此,乙醇暴露可以增强弹性蛋白的合成和稳定性。值得注意的是,在我们的PCLS模型中,我们可重复观察到在培养24到48小时之间发生的弹性蛋白表达的时间依赖性丢失(). 然而,在乙醇处理的PCSL中,弹性蛋白的表达在72小时内是稳定的,而乙醇代谢产物醋酸盐则无法稳定。我们对这些发现的解释是,在乙醇暴露的PCLS中,弹性蛋白和TIMP-1的高表达将至少部分地促进弹性蛋白的持续表达和沉积,而在对照组和经醋酸盐处理的PCLS可能会受到弹性蛋白酶的快速降解。但结合我们在HSC单细胞培养中的发现,我们可以得出结论,乙醇对原弹性蛋白基因转录、弹性蛋白蛋白表达和TIMP-1基因转录具有直接刺激作用,这些转录有可能促进弹性蛋白的积累。这与病理生理学的相关性是弹力蛋白增加了与纤维化ECM的结合,这通过弹力蛋白介导的交联促进瘢痕组织的成熟和不溶性[20]. 在慢性肝病的反复损伤特征的背景下,预计会有从头开始qHSC的激活和转分化以及成熟HSC衍生肌成纤维细胞的维持。因此,新激活的HSC有可能在乙醇的影响下促进现有纤维化ECM的成熟。
发现HSC中乙醇刺激ECM基因表达的表观遗传基础表明,可能会对HSC表观基因组和表型产生更全面的影响。为了质疑这一概念,我们采用了一种无偏见的ChIPseq方法来鉴定与MLL1及其组蛋白修饰H3K4me3的改变相关的基因,我们最初认为这是由原弹性蛋白基因处的乙醇诱导的。虽然ChIPseq可能是一项强大的技术,但当它应用于表观遗传调节器或组蛋白修饰时,如果要报告具有生物学意义的发现,所获得的数据集需要知情的生物信息分析和验证[21,22]. 特别是,重要的是要认识到,由于表观遗传密码固有的复杂性以及调节酶的特异性冗余,对单个组蛋白特征或修饰酶的ChIPseq分析可能会产生误导[23,24]. 因此,我们对从对照组和乙醇暴露HSC获得的MLL1和H3K4me3 ChIPseq数据进行了组合分析。从中我们确定了MLL1和H3K4me3关联性独立或组合变化的基因。我们假设,那些仅在H3K4me3中显示变化的基因可能在该残基处被其他乙醇调节的H3K4甲基化酶注释,如MLL2、MLL3、MLL5或ASH1,所有这些酶在乙醇处理的HSC中均上调(). 仅MLL1发生改变的基因可能受到其他调节机制的影响,例如对抗H3K4脱甲基酶活性,并且我们再次观察到乙醇诱导JARID1家族的几个成员(包括多个成员)的表达(). 共发现41个基因响应乙醇获得MLL1/H3K4me3的组合富集。选择其中2个基因c-Jun和FGFBP3,我们通过局部特异性ChIP证实了MLL1/H3K4me3特征,重要的是,这种表观遗传重塑与基因表达增加有关。
尽管在体外研究产生了可靠的数据,我们特别感兴趣的是,是否长期接触乙醇体内将在HSC中产生类似的表观遗传变化。为了解决这个问题,我们使用了基于饮酒和西方饮食的肝纤维化双击模型。食用西方对照液体饮食或低脂/酒精饮食不会诱发脂肪性肝炎或细胞周/类周肝纤维化。然而,西方饮食和酒精的结合会导致酒精性脂肪性肝炎并肝纤维化,从而限制了酒精性肝病的双发病或多发病机制的流行观点。值得注意的是,本研究侧重于模型中活化肝星状细胞的表观遗传调控,我们使用从喂食动物中分离的HSC作为最正常状态的细胞,以突出在两次饮食/酒精模型中检测到的活化HSC的变化。从乙醇饲料或对照中筛选出的FACS HSC中MLL1和H3K4me3结合的ChIPseq组合分析第1a1-GFP列小鼠发现了一些重叠的基因在体外和体内研究。此外,它还鉴定了许多在在体外学习,大概是因为体内由于乙醇及其代谢物(乙醛和乙酸)都有助于体内效果。重要的是,体内该方法清楚地表明,四分之一的酒精诱导基因具有纤维化或染色质重塑相关功能(). 此外,体内研究表明,小鼠弹性蛋白基因与H3K4me3增加有关。尽管在我们的候选基因方法研究中有大量数据显示乙醇诱导MLL1/H3K4me3在大鼠弹性蛋白启动子处富集,但我们在我们的在体外MLL1/H3K4me3 ChIP序列。这一差异突显了ChIPseq分析的一个重要但并非意料之外的局限性,这是由于本研究中使用的测序和PCR技术以及ChIPseque与局部特定ChIP协议的下游数据分析平台的差异而产生的。
总之,我们发现乙醇可以直接影响支持qHSC向aHSC转分化的表观遗传重编程过程,从而影响HSC表型。这一发现揭示了乙醇导致ALD的分子机制,同时也是其他慢性肝病的共同发病因素。
致谢
财务支持:本研究得到了医学研究委员会(MRC)(发给D.A.M和J.M)、国家酒精滥用和酒精中毒研究所(NIAAA)(发给H.T、D.A.M与J.M)资助U01AA018663(发给J.M),欢迎信托基金会和纽卡斯尔生物医学研究中心(发给J.M.),NIAAA资助P50011199(动物核心)和R24AA012885(非实质性肝细胞核心)的资助(至H.T)和1I01BX001991(至HT)
缩写词表
阿尔德 | 酒精性肝病 |
ASH1型 | 无、小或同源盘1 |
炸薯条 | 染色质免疫沉淀 |
发动机控制模块 | 胞外基质 |
H3K4型 | 赖氨酸4组蛋白3 |
HSC公司 | 肝星状细胞 |
MeCP2型 | 甲基-CpG结合蛋白2 |
MLL1级 | 髓细胞/淋巴细胞或混合淋巴细胞白血病 |
M底座 | 单核酸酶 |
非霍奇金淋巴瘤 | 正常人肝脏 |
PPARγ | 过氧化物酶体增殖物激活受体-γ |
质量健康安全委员会 | 静止的肝星状细胞 |
rHSC公司 | 大鼠肝星状细胞 |
定量PCR | 定量聚合酶链式反应 |
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
α形状记忆合金 | α平滑肌肌动蛋白 |
转化生长因子-β1 | 转化生长因子β1 |
TIMP-1公司 | 金属蛋白酶组织抑制剂-1 |
脚注
Agata页面–生成和分析大多数结果
P.Paoli码头–构建ChIP-seq库,执行ChIP-se q和生物信息分析斯蒂芬·希尔–精确切割肝脏切片(PCLS)的制备和乙醇处理
雷切尔·霍沃思–协助动物实验
津本英和–讨论和对想法的贡献;建立酒精性肝纤维化模型和基于FACS的HSC分离方法;阅读和修改手稿。
Raymond Wu–协助HSC的动物模型实验和FACS分离
Soo-Mi Kweon–FACS分离和鉴定来自第1a1-GFP列老鼠
杰里米·弗伦奇–提供人体肝脏样本
史蒂夫·怀特–提供人体肝脏样本
Derek A.Mann(德里克·A·曼)–帮助进行实验设计、解释数据和起草文章
杰勒娜·曼–对项目概念和设计以及数据解释的主要贡献;论文的写作
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利益冲突:作者报告没有利益冲突
工具书类
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