斑马鱼肠道神经系统发育过程中，Meis3是肠道神经嵴侵入所必需的

Meis3缺失导致迷走神经嵴细胞延迟迁移至发育中的前肠

的空间表达模式梅斯3前肠附近提示它可能在肠神经嵴和/或前肠发育过程中发挥作用。为了测试这一点，我们通过使用两种策略在Tg（-4.9）的单细胞阶段敲除Meis3进行了功能丧失实验sox10：GFP）转基因胚胎，以下简称sox10型：GFP:1）使用翻译阻断吗啉(diIorio公司等., 2007)或2）通过注射编码显性负性Pbx4结构的mRNA(公共出租车)阻止Meis蛋白的核进入(雀等., 2002). 在25 hpf时，Meis3变体和公共出租车-与对照注射胚胎相比，注射胚胎的大脑和眼睛尺寸减小（补充图S1，A-C），这与之前证明Meis蛋白在眼睛和大脑发育中的作用的研究一致(贝萨等., 2008;海涅等., 2008). 检查索10：绿色荧光蛋白⁺在Meis3基因敲除后的神经嵴细胞，我们用GFP抗体进行了整体免疫组化。在28和36 hpf的对照胚胎中，sox10：绿色荧光粉⁺神经嵴细胞在眼球周围向前迁移，进入舌骨弓和鳃弓（补充图S1D和图2A;n个= 20/20). 在Meis3变体中（补充图S1F和图2B;n个=18/20）和公共出租车-注射胚胎（补充图S1E；n个= 17/20),sox10：绿色荧光粉⁺神经嵴细胞也在眼睛周围迁移，进入舌骨弓和鳃弓，表明神经嵴的规格未受影响。证明了吗啉的特异性，Meis3蛋白水平在Meis3吗啉治疗后显著下降，并在联合注射梅斯3不能被Meis3 MO结合的信使核糖核酸与Meis3 MO结合（补充图S1G）。

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图2：

在ENS发育的早期阶段，迷走神经嵴需要Meis3及时迁移到发育中的前肠。（A） 对照注射和（B）Meis3 MO注射胚胎，36 hpf显示sox10型：GFP⁺眼、舌骨、耳和鳃弓周围的神经嵴细胞。（C–C〃）横截面描述sox10型：GFP⁺细胞位于对照胚胎耳后迷走神经区域的侧面，以及Meis3 MO注射胚胎内的（D–D′′）。（E–E〃）控制sox10型：GFP⁺在36 hpf的前肠环境中检测到迷走神经嵴细胞（E′，E′′；箭头）。（F–F〃）几乎没有索10：GFP⁺在前肠周围注射Meis3 MO的胚胎中观察到细胞。红色的F-actin（C–F），sox10型：绿色（C′，D，E′，F′）的GFP，并与蓝色（C′，D′，E′，F′）的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）合并。（G，H）对照注射胚胎含有甲壳素⁺神经嵴细胞位于耳后迷走神经区域内，位于沿着前肠以36 hpf（H；箭头）向腹中线方向放射的两条迁移细胞流的腹侧。（I–L）尽管Meis3 MO–注入和公共出租车-注射胚胎含有甲壳素⁺在听后迷走神经区的腹侧，没有检测到神经嵴向腹中线迁移。（M） 量化数量的条形图sox10型：GFP⁺对照组和注射Meis3 MO的36 hpf胚胎肠道附近的神经嵴细胞*第页< 0.05. ba，鳃弓；e、 眼睛；h、 舌骨；ot，耳鼻喉炎。比例尺，70μm（A，B），50μm（C–F），20μm（E′，F′），100μm（G，I，K）。

为了检测Meis3缺失后肠道神经嵴定位是否发生改变，我们分析了36 hpf时耳后和前肠水平的连续横切面。在对照胚胎中，在胚胎发育后期，sox10：绿色荧光粉⁺外侧定位的神经嵴细胞(图2，C′和C′′;n个=10/10），而前肠水平的后段显示sox10：绿色荧光粉⁺肠道周围的肠神经嵴（箭头所示图2，E′和E′′;n个= 10/10). 虽然在Meis3缺失后，耳后迷走神经嵴细胞出现在外侧区(图2，D′和D′'），它们几乎沿前肠消失(图2，F′和F′′;n个= 8/10). 对照组胚胎平均发育4个sox10：绿色荧光粉⁺沿着前肠的细胞，而Meis3变体平均只含有0.33个sox10：绿色荧光粉⁺单元格(图2M;第页= 0.0053). 为了定性评估整个坐骑沿肠道的神经嵴细胞分布，我们进行了甲壳素原位杂交(图2，G–L). 在36 hpf的对照胚胎中，腹部视图显示两条链甲壳素-阳性细胞从左右迷走神经区向腹中线迁移(图2H，箭头；n个= 20/20). 在Meis3 MO和pbcab公司-不过，注射胚胎甲壳素-阳性细胞位于迷走神经区域，未检测到向中线的迁移链(图2，J和L;n个分别为18/20和20/20）。综上所述，这些结果表明，Meis3可能是迷走神经嵴细胞及时迁移到发育中的腹中线和前肠环境所必需的。

在ENS发育的初始阶段，迷走神经嵴细胞向腹中线迁移需要内胚层(赖森巴赫等., 2008). 一种可能性是，在Meis3变体中，迷走神经嵴向腹中线迁移的延迟实际上可能反映了前肠内胚层的缺失。为了检验这种可能性，我们使用消化内胚层标记物在36 hpf的原位杂交检测了肠道内胚层的存在狐狸1(Odental和Nüsslein-Volhard，1998年). 与对照注射胚胎类似，Meis3变体具有狐狸1-肠道内胚层阳性区域（补充图S2，A-D），如在两个整体中观察到的（补充图S2，A和B，n个=20/20）和切片胚胎（补充图S2、C和D，n个=6/6），表明肠道内胚层的存在不需要Meis3。为了评估Meis3缺失是否改变胰腺内胚层祖细胞的规格，我们还检测了pdx1型对照组和注射Meis3吗啉（MO）的胚胎。在斑马鱼胰腺规范化期间，pdx1型-内胚层阳性通过32hpf产生背胰芽和腹胰原基(比马尔等., 2001;罗伊等., 2001;字段等., 2003). 表达域无显著差异pdx1型在对照组和Meis3 MO注射胚胎之间观察到36 hpf（补充图S2、E和F；箭头；n个= 20/20). 因此，肠道和胰腺内胚层的规范或存活可能不需要Meis3，这表明Meis3缺失胚胎中的迷走神经嵴迁移缺陷可能并非源于前肠内胚层组织的缺乏。

中胚层衍生手动2在ENS发育期间，斑马鱼胚胎肠道前体物质的有效迁移是必需的(赖森巴赫等., 2008). 调查是否手动2Meis3缺失后定位发生改变，可能导致肠神经嵴迁移缺陷，我们也检测到手动2全山原位杂交定位于52hpf。与对照注射胚胎相比（补充图S2G；箭头；n个=20/20），Meis3变体和公共出租车-注射的胚胎基本正常手动2肠道沿线的表达域（补充图S2、H和I；箭头；n个分别为18/20和17/20）。这些结果表明，Meis3不需要用于规范手动2-阳性中胚层。

Meis3是肠道神经嵴沿着发育中的肠道有效迁移所必需的

在斑马鱼ENS早期发育期间，肠道神经嵴细胞从耳后迷走神经区域以两条链的形式迁移，随后沿着发育中的肠管的左右两侧迁移(牧羊人等., 2004;奥尔登等., 2008). 沿着它的尾部，它们以54 hpf的速度在超过四分之一长度的肠道内定居，到了66 hpf，它们到达了后肠的尾端(奥尔登等., 2008). 这些迁移的肠道祖细胞的标志是phox2bb公司，肠神经嵴命运规范所需的转录因子(Elworthy公司等., 2005). 为了研究是否需要Meis3来确定肠道神经嵴的命运和/或肠道祖细胞沿肠道嘴-尾轴的定位，我们对phox2bb公司.在对照胚胎中phox2bb公司⁺细胞群在52 hpf时离开了耳后迷走神经区(图3A（如箭头所示）并向尾部迁移，沿着肠道长度的40%进行(图3D)两条迁徙的河流证明了这一点phox2bb公司⁺肠道前体位于中肠水平的肠管左右两侧(图3G; 箭头，背外侧视图；n个= 30/30). 相比之下，Meis3变体和公共出租车-注射胚胎具有扩张的耳后迷走神经phox2bb公司⁺52 hpf时的域(图3、B和C; 箭头；n个分别为25/30和28/30）。沿着Meis3变体的内脏，phox2bb公司⁺与对照胚胎相比，肠道前体位于更靠嘴的位置（前肠水平），并且仅进展了肠道长度的25%(图3、E和H; 箭头，背外侧视图）。公共出租车-注射胚胎表现出更严重的表型phox2bb型⁺位于前肠前部的肠道前体(图3、F和I; 箭头，背外侧视图），仅迁移肠道长度的10%。在横切面上，尽管对照胚胎的肠道前体沿着后前肠位于肠管的左右两侧(图3J，箭头），Meis3变形体和公共出租车-注射胚胎在可比较的位置没有可检测到的肠道前体(图3，K和L). 这些结果表明，肠道神经嵴需要Meis3才能及时有效地向发育中的肠道迁移，但它们的分化是正常的。

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图3：

的本地化phox2bb公司⁺失去Meis3后，肠道神经嵴发生改变。的侧面视图phox2bb公司（A）对照组、（B）Meis3变体和（C）颅骨区域内的定位公共出租车-在52 hpf时注射胚胎表明phox2bb公司⁺迷走神经嵴细胞已经离开对照胚胎的迷走神经区域（箭头），但在Meis3变形体和公共出租车-在同一位置注射显性阴性胚胎（箭头）。phox2bb公司⁺在（D，G）对照胚胎中，肠神经嵴细胞位于中肠的左右两侧，而肠嵴细胞则位于（E，H）Meis3变体前肠的吻侧，并存在于（F，I）前肠的最前部公共出租车-注射胚胎。剖视图证实，尽管phox2bb公司⁺在（J）对照胚胎中，肠道嵴细胞位于肠道周围（箭头），在（K）Meis3变体和（L）中未检测到类似水平的肠嵴细胞公共出租车-注射胚胎。比例尺，50μm（A–F），40μm（G–I）。

为了进一步验证Meis3功能丧失影响细胞迁移的假设，我们接下来使用体内延时共聚焦显微镜直接检查对照胚胎与Meis3变体相比的肠道神经嵴迁移。为此，我们对对照组和Meis3-孤儿双转基因胚胎的肠道区域进行了成像，结果显示sox10型：mRFP（膜红色荧光蛋白⁺神经嵴）和sox17型：GFP（GFP⁺肠内胚层）。如示意图所示，从侧面假设图像(图4A)，在发育的第二天（~54-57 hpf），当肠道神经嵴细胞沿着发育中的肠管迁移时。在对照胚胎中，sox10型：mRFP⁺观察到神经嵴细胞沿着sox17型：GFP⁺中肠速度为20μm/h(图4C; 箭头随时间变化；n个=3；补充电影S1）。相反，在Meis3变体中，sox10型：mRFP⁺神经嵴细胞在沿着sox17型：GFP⁺可比时间的前肠(图4A)并表现出10μm/h的缓慢迁移率(图4B; 箭头随时间变化；n个=3；补充电影S2）。事实上，同意phox2bb公司现场分析(图3)这些观察结果表明，Meis3缺失后肠道神经嵴的迁移受到影响，并表明Meis3是肠神经嵴沿着发育中的肠道有效迁移所必需的。

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图4：

Meis3是肠道神经嵴细胞沿肠道有效迁移所必需的。（A） 示意图描述了沿肠道轴获取实时延时电影的位置。彩色方框表示在Meis3变形体（红色方框）和对照胚胎（绿色方框）中观察到神经嵴流的位置。延时静物画的横向裁剪视图sox10型：mRFP⁺;sox17型：绿色荧光粉⁺（B） Meis3变体和（C）在胚胎发育的第二天控制胚胎的发育（～54–57 hpf）。（B） 在Meis3变形胚胎中，sox10型：mRFP⁺观察到肠神经嵴链沿着前肠后端以10μm/h的速度迁移，在3小时内迁移30μm（箭头随时间推移）。在Meis3变体中，迁移锋的前缘沿肠道尾部出现膜突起（小箭头）。（C） 在对照胚胎中，sox10型：mRFP⁺肠道神经嵴迁移链沿中肠以23μm/h的速度迁移，在3小时内迁移70μm（随时间箭头）。星号标志着迁移锋的开始；底部，合并显示的位置sox10型：mRFP⁺肠道神经嵴细胞（红色）sox17型：GFP⁺肠内胚层（绿色）。比例尺，40μm。

在ENS发展过程中，Meis3缺失导致结肠无神经节细胞增生症

由于Meis3缺失导致肠道神经嵴沿肠道迁移紊乱，这可能导致神经元分化缺陷。斑马鱼肠神经元分化过程中，在～55 hpf时沿前肠检测到第一个分化的肠神经元(Elworthy公司等., 2005;奥尔登等., 2008)和74 hpf，Hu⁺肠神经元出现在肠的最末端，靠近肛门(奥尔登等., 2008;奥尔森等., 2008). 为了检测神经元分化，我们分析了对照组、Meis3 MO和公共出租车-当肠神经元覆盖整个肠道长度时，用抗全神经元标记物Hu的抗体在96 hpf下通过整体免疫组织化学注射胚胎(图5). 在对照胚胎中，胡⁺沿着肠道的整个长度，一直到肛门都可以观察到神经元(图5，A和D;n个= 12). 在Meis3变体中，Hu⁺神经元仅存在于前肠和中肠区域，没有Hu⁺在后肠检测到的神经元(图5、B和E;n个=10/12），表明Meis3缺失导致结肠（后肠）无神经节细胞增生症，这是一种后肠缺乏神经元的疾病(贝杰隆等., 2013). 表现出更严重的表型，公共出租车-注射胚胎显示出全肠无神经节细胞增生症，除前肠外，前肠中没有神经元(图5、C和F;n个= 12/12). 与对照胚胎相比，平均含95.6 Hu⁺整个肠道的神经元(图5I,n个=8），Meis3缺陷胚胎的含量明显较少，平均为55.6 Hu⁺整个肠道的神经元(图5I,第页= 0.0004,n个=8），而pbcab公司-注射的胚胎只有八个(图5I,第页= 0.0001,n个= 8).

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图5：

在ENS发展过程中，Meis3缺失导致结肠无神经节细胞增生症。96 hpf下针对Hu的全套免疫组化显示，肠道神经元存在于（A）对照胚胎的整个肠道中，而它们不存在于（B）Meis3变体的后肠区域，只存在于（C）的前肠中公共出租车-注射胚胎。（D） A的放大视图显示了对照胚胎的肠神经元密度和形态，而B和F的（E）Meis3变体的放大视图公共出租车-注射到C区的胚胎显示在失去Meis3后出现的神经元较少。（G，J）对照胚胎中5HT神经递质的整体免疫组化显示肠道中存在终末分化神经元。（H，K）在Meis3变体中，5HT的存在⁺前肠和中肠有明显的终末分化神经元，但后肠区域没有，以星号标记。（一） 量化对照组、Meis3 MO组和公共出租车-96 hpf的注射肠道，以及对照和Meis3变形肠道中肠内的总5HT神经元**第页< 0.05; ***第页< 0.01. 误差线表示±SEM。比例尺，80μm（A–C，G，H），30μm（D–F，J，K）。

我们还检测了5-羟色胺（5HT）神经递质的定位，作为终末分化的指标。在对照胚胎中，肠道中检测到5HT(图5、G和J)，对照前肠-中肠区域平均含19.5 5HT⁺神经元(图5I;n个= 8). 在Meis3变体中，5HT⁺检测到神经元，平均13.25 5HT⁺前肠-中肠区域的神经元(图5、H、I和K； 第页= 0.018,n个= 6); 然而，在后肠中没有检测到神经元(图5H，星号）。因此，尽管Meis3缺陷的肠神经嵴细胞有能力分化为肠神经元，但与对照组相比，它们数量较少，而且后肠中也没有。综上所述，这些数据表明Meis3是整个肠道有效定植所必需的(图3和​和4）4)因此，它的丢失会导致后肠区域内肠神经元的缺失(图5).

Meis3缺失导致肠道周围肠神经嵴细胞的数量和增殖减少

Meis3缺陷胚胎ENS内肠神经元数量减少的观察(图5I)提示Meis3可能在控制发育过程中出生的肠神经元的适当数量方面发挥重要的功能作用。肠神经嵴细胞在迁移过程中积极增殖(皮奇等., 2006;奥尔登等., 2008). 目前肠道定植的一个模型是，神经嵴细胞在迁移过程中发生增殖扩张，进入新的肠道区域，推动神经嵴向前移动(兰德曼等. 2007). 因此，神经嵴迁移效率的降低和肠神经元形成的减少可能反映了迁移过程中前体细胞数量和/或其增殖的减少。

为了测试这种可能性，我们在52 hpf时对尾部前肠水平的连续横向冰冻切片进行了免疫组化，并量化了肠道附近神经嵴细胞的数量(图6). 在控制段中，sox10型：GFP⁺肠道周围大量检测到肠神经嵴细胞(图6，A–A〃、D和D′，箭头），平均每节15个单元格(图5G,n个= 6). 在Meis3变体中索10：GFP⁺神经嵴细胞显著减少，平均6.7个细胞/节(图6，B–B′′、E、E′和G;第页= 0.0012,n个= 6). 同样，pbcab公司-注射胚胎仅显示4.5个细胞/节(图6，C–C′，F，F′和G;第页= 0.0002,n个= 6). 为了确定Meis3变体中的细胞数量缺陷是否可以被挽救，我们猜测梅斯3mRNA不能与Meis3 MO结合sox10型：GFP胚胎，48 hpf时免疫组化分析。对照组胚胎平均发育12个sox10型：GFP⁺肠道附近的肠神经嵴细胞(图6、H和K,n个=6），而Meis3变体的含量明显较少，平均为5.3(图6、I和K;第页=0.0075，n个= 6). 胚胎与Meis3 MO和梅斯3导致肠道周围神经嵴细胞数量的部分挽救，胚胎平均数为9.6sox10型：GFP⁺细胞，与Meis3变体相比显著增加(图6、J和K;第页= 0.01,n个= 6).

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图6：

肠道周围适当数量的肠道神经嵴细胞及其增殖需要Meis3功能。采用免疫组织化学方法分析（A–A′′）对照组、（B–B′′）Meis3 MO′和（C–C′′）公共出租车-注入sox10型：GFP⁺52 hpf时的胚胎。控制-（D，D′）、Meis3 MO-（E，E′）和的放大视图公共出租车-注射胚胎（F，F′）在失去Meis3或Meis功能后，肠道附近的肠神经嵴细胞较少；sox10型：GFP（绿色）、F-肌动蛋白（红色）和DAPI（蓝色）。（G） 显示对照组、Meis3 MO和公共出租车-注射胚胎52 hpf。（H–K）救援实验免疫组化和定量显示梅斯3与单独注射Meis3-MO（I，K）相比，在48 hpf（K）时，不与Meis3-MO结合的mRNA和Meis3-MO（J）足以部分挽救肠道附近的肠神经嵴细胞数量；sox10型：GFP（绿色），F-actin（红色）。（五十） 52 hpf和（M）Meis3 MO注射胚胎中有丝分裂标记物pH3的免疫组化对照；sox10型：GFP（绿色）、pH3（红色）和DAPI（蓝色）。（N） 条形图显示对照组和Meis3 MO注射胚胎肠道周围有丝分裂神经嵴的量化。对于所有图形*第页<0.05**第页< 0.01. 误差条表示±SEM。比例尺，40μm（A–C），20μm（D–F），20微米（H–m）。

为了验证Meis3变体中神经嵴细胞数量减少可能是由于其增殖变化所致的假设，我们使用抗磷酸组蛋白H3的抗体分析了连续横切面中的细胞分裂，该抗体标志着有丝分裂细胞处于细胞周期的G2/M期。在对照切片中，有丝分裂sox10型：GFP⁺肠周围平均有两个细胞/节(图6，L和N，箭头；n个=6），而注射Meis3 MO的胚胎显示少于一个有丝分裂细胞的平均数(图6，M和N，箭头；第页= 0.02,n个= 6). 总的来说，这些定量数据表明，Meis3对于肠道周围正确数量的肠神经嵴细胞及其增殖是必要的，这表明肠神经细胞发育后期的缺乏至少部分是由于总迁移人口的减少。

吗啉、mRNA注射和mRNA拯救实验

Meis3 MO（5′-ATCACTGCGATACGGAAGCGAGCT-3′；Genetools，LLC，Philometh，OR；diIorio公司等., 2007)针对5′非翻译区梅斯3被用于吗啡啉基因敲除实验。使用标准对照MO（5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTATA-3′）作为阴性对照。野生型AB菌株和Tg（-4.9sox10型：GFP）(卡尼等., 2006)使用纳升2000注射器在单细胞阶段注射2.3 nl 0.75 mM Meis3 MO（佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）。对于pbcab公司注射，pCS2-pbcab-myc汽车构造(雀等., 2002)，对的截断版本进行编码pbx4电缆标记有myc的基因用线性化不是1，并使用Sp6 RNA合成试剂盒转录capped mRNA（Ambion，Waltham，MA）。200-pg量公共出租车注射到单细胞胚胎中进行显性-阴性实验。对于mRNA拯救实验梅斯3从斑马鱼28-hpf cDNA文库中，从起始密码子开始PCR扩增编码序列，从而去除吗啉识别序列的19个碱基对，用引物添加5′生态RI限制位点和3′Xba公司I限制位点分别如下：正向，5′-CGGATATTCCATGGAGAGG-3′；背面为5′-GCTCTAGATAGTGGCATGT-3′。产生的结果梅斯3然后将PCR片段凝胶切除，用生态RI和Xba公司I、 定向克隆到pCS2+中，并进行序列验证。pCS2型-梅斯3用线性化不是我和用作模板来生成梅斯3用Sp6 RNA合成试剂盒（Ambion）封盖mRNA。150毫克梅斯3mRNA与Meis3 MO共注入，用于单细胞期的拯救实验，胚胎固定在48 hpf进行免疫组化，如后文所述，或处理在25 hpf进行Western blot分析。

蛋白质印迹

对照注射和Meis3 MO注射的胚胎用三辛麻醉，用细镊子手动去蛋黄，然后转移到冰上1.7-ml Eppendorf试管中。将胚胎在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中冲洗两次，然后立即在补充有完整蛋白酶抑制剂（罗氏，麦迪逊，威斯康星州）的蛋白溶解缓冲液（5 mM EDTA，50 mM Tris，pH 8，100 mM NaCl，1%NP-40）中均质。按照制造商的说明，使用Invitrogen NuPAGE LDS样品缓冲液和还原剂对蛋白质匀浆进行变性，装入Novex Bis-Tris SDS–PAGE凝胶中并运行。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，在室温下在5%牛奶/1×PBS/Tween-20（PBST）中封闭1h，并在4°C下在兔抗Meis3（1:1000；ab82761；Abcam，Cambridge，MA）中培养过夜。在室温下，将印迹在辣根过氧化物酶结合的抗兔次级1:13000中培养2小时，并使用GE Healthcare ECL检测系统进行开发。

核糖体和原位杂交

杂交基本上按照描述进行(Jowett和Lettice，1994年). 使用三个生物复制品重复所有实验。以下cDNA构建物被用作模板，以生成核糖探针用于全山原位杂交：梅斯3(劳赫等., 2003),甲壳素(罗等., 2001),狐狸1(Odental和Nusslein-Volhard，1998年),pdx1型(比马尔等., 2001)，以及ptch2型(李等., 2008). 从28-hpf cDNA文库中PCR扩增出以下cDNA，连接到pGEM-Teasy载体，线性化，并用作模板来生成探针：phox2bb公司正向，5′-TTCTTCTCCACTCGACCCTT-3′，反向，5′-CGTCGCTTTTTTCTCCATC-3′；手动2正向，5′-TGTTCGCCGTAGGGTATAG-3′，反向，5′-TCTTGTCATTGCTGCCCT-3′；什哈，正向，5′-CTCGCGCAGA­AGAGCAT-3′，反向，5′-CTGGCGCTATCATCAACAACAA-3′。

免疫组织化学

对于免疫组织化学处理，胚胎在4°C的4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，在1×PBS中清洗三次，并在15%蔗糖/1×PBS的4°C中培养过夜。然后将胚胎在38°C的温度下在7.5%明胶/15%蔗糖中孵育过夜，在橡胶模具中对齐，并在液氮中快速冷冻。在12μm处切下冰冻切片并安装在玻璃载玻片上，通过在42°C的载玻片夹中1×PBS中培养载玻片20分钟来去除明胶。然后按照前面所述进行免疫组织化学(乌里韦和格罗斯，2007年). 在切片上使用了以下抗体：兔抗GFP 1:500（A-11122；马萨诸塞州沃尔瑟姆市生命科技公司）、山羊抗GFP 1:250（ab6673；Abcam）和兔抗pH3 1:250（马萨诸塞洲比列里卡市EMD Millipore）。使用以下二级抗体：以1:700的比例使用Invitrogen Alexa Fluor山羊抗兔488、驴抗羊488和山羊抗兔568。Hoechst 3358和/或Alexa Fluor 568卵磷脂包含在二次孵化中。对于整体免疫组织化学，将28、36或96 hpf的胚胎在4°C的4%PFA中固定过夜，在1×PBS中冲洗三次，在−20°C的100%甲醇中培养1小时，然后在室温下逐步复水到1×PBS。然后将胚胎在−20°C的100%丙酮中培养11分钟，在1×PBS中冲洗三次，然后在室温下在10μg/ml蛋白酶K中消化12分钟（28 hpf）、16分钟（36 hpf）或45分钟（96 hpf）。然后在1×PBS中冲洗胚胎三次，在室温下在4%PFA中固定10分钟，在1×PBS中冲洗三次，然后在添加有1%二甲基亚砜（DMSO）的1×PBST稀释的5%正常山羊血清块中孵育3小时，然后在兔抗GFP 1:500（A-11122；Life Technologies）中孵胚，小鼠抗HuC/D 1:200（Invitrogen，Waltham，MA）或兔抗5HT 1:1000（Immunostar，Hudson，WI）在4°C下过夜。然后将胚胎从1×PBST中的一级抗体中洗出，然后在室温下在二级抗体Alexa Fluor山羊抗兔488或山羊抗鼠568（1:700；Invitrogen）中孵育3小时。胚胎在1×PBST中冲洗，并在加利福尼亚理工学院贝克曼成像中心的蔡司710双光子共焦显微镜上在75%甘油/1×PBS中成像。

时间推移成像

Tg阳性胚胎(sox10型：mRFP）和Tg(sox17型：GFP）横向安装在1%低熔点琼脂糖溶解于补充1×N个-成像室中的苯硫脲和三辛麻醉剂。Z轴-使用蔡司LSM 710显微镜上的20倍物镜，每隔5分钟采集10–13μm的样品堆，持续约3小时。Z轴-堆栈使用Imaris图像分析软件进行编译和导出。

量化和统计

在所有实验中，使用了三个生物复制品n个每个实验≥6个。对于切片上的细胞计数，对每个胚胎的相邻切片进行计数并取平均值。所有统计显著性和SEM的图表和计算均使用双参数非配对t吨测试（GraphPad Prism）。

我们感谢Charles Sagerström为我们建造了pCS2-pbcab-myc，Tatiana Hochgreb-Hägele狐狸1cDNA，Shuo Lin代表pdx1型cDNA和Jeff Grossptch2型cDNA。我们感谢加州理工学院贝克曼研究所生物成像中心和鱼类设施、Marcos Simões Costa提供的双荧光原位杂交建议，以及Martha Henderson和David Mayorga提供的鱼类护理建议。研究得到了美国国立卫生研究院（DE024157）对M.E.B.和美国国立卫生院F32（HD080343）对R.A.U.的资助，以及Burroughs Wellcome基金对R.A.U的博士后充实项目奖学金的支持。