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生物化学杂志。2015年10月1日；471（第1部分）：79–88。
2015年9月21日在线发布。2015年7月28日在线预发布。 数字对象标识：10.1042/BJ20150336
预防性维修识别码：PMC4613529
PMID：26221024

一种非经典ESCRT途径，包括组氨酸结构域磷酸酪氨酸磷酸酶（HD-PTP），用于下调病毒泛素化的MHC I类

迈克尔D。J.帕金森,*,1 Sián C.公司。派珀,*,1,2 尼古拉斯A。明亮,* 詹妮弗·L。埃文斯,* 杰西卡·M。博纳姆,† 凯瑟琳·鲍尔斯,*,三 保罗·J·。莱纳,†和J.保罗·卢西奥*,4
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

使用RNAi，确定了运输所需的内胚体分选复合体的非标准途径，该途径负责在细胞表面该蛋白下调期间将病毒泛素化的MHC I类分选为多泡体（MVB）。

关键词：内吞作用、转运所需的内体分选复合物（ESCRT）、组氨酸域磷酸酪氨酸磷酸酶（HD-PTP）、组胺域蛋白酪氨酸磷酸酯非受体类型23（PTPN23）、溶酶体、泛素化（泛素化）

摘要

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）K3病毒基因产物有效下调细胞表面MHCⅠ类。K3是一种E3泛素连接酶，促进Lys63-MHC I类的连锁多泛素化，为氯氰菊酯介导的内吞作用提供信号。细胞内吞后，分选成多泡体（MVB）的管腔内小泡（ILV），并最终输送到溶酶体。将MHC I类分类为MVB需要运输所需的四种内体分类复合物（ESCRT）的许多单个蛋白质。在表达KSHV K3泛素连接酶的HeLa细胞中，RNAi介导的ESCRT-0和ESCRT-I复合物的单个蛋白和三个ESCRT-III蛋白的缺失效应表明，这些蛋白是下调MHCⅠ类所必需的。然而，ESCRT-II复合物或ESCRT-IIII蛋白的缺失，VPS20（空泡蛋白分选20）/CHMP6（带电MVB蛋白6）未能阻止细胞表面MHCⅠ类的丢失。组氨酸域磷酸酪氨酸磷酸酶（HD-PTP）的耗竭导致表达KSHV K3泛素连接酶的HeLa细胞中MHC类I的细胞表面浓度增加。野生型（WT）和突变型HD-PTP的救援实验支持了以下结论：HD-PTP可替代ESCRT-II和VPS20/CHMP6，作为ESCRT-I和ILV形成所需的ESCRT-III蛋白之间的链接。因此，由KSHV K3泛素连接酶多泛素化的细胞表面MHCⅠ类的下调不采用经典的ESCRT途径，而是利用HD-PTP替代ESCRT-II和VPS20/CHMP6的替代途径。

关键词：内吞作用、转运所需的内体分选复合物（ESCRT）、组氨酸域磷酸酪氨酸磷酸酶（HD-PTP）、组胺域蛋白酪氨酸磷酸酯非受体类型23（PTPN23）、溶酶体、泛素化（泛素化）

简介

卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）通过病毒编码的K3和K5泛素E3连接酶的作用，从感染细胞表面下调MHCⅠ类分子，从而使宿主免疫系统得以逃避[1]. KSHV K3（KK3）通过Lys的形成促进MHC I类分子的多泛素化63-连接的泛素链添加到每个MHC I类分子的细胞溶质尾部中间的保守赖氨酸[2–4]. 继KK3在HeLa细胞（HeLa-KK3细胞）中稳定表达后，新合成的通过分泌途径进入质膜的MHC I类分子被多泛素化，迅速被网格蛋白和epsin/Eps15 R依赖性途径内吞，并靶向溶酶体降解[1,4]. 这种溶酶体靶向需要转运（ESCRT）蛋白HRS和TSG101所需的内体分选复合物[2,5].

在哺乳动物细胞中，多泡体（MVB）的形成始于ESCRT蛋白的补充，ESCRT蛋白是酵母E类空泡蛋白分选（Vps）蛋白的哺乳动物同源物[6–8]. 这些蛋白在MVB管腔内小泡（ILV）的形成以及将泛素化膜蛋白分类到这些小泡中都起作用。在酵母中，结构和功能研究已经导致了一种模型，在该模型中，ESCRTs-0、I、II和III依次被招募，然后是AAA-ATP酶（与多种细胞活动相关的ATP酶）Vps4p，它从MVB的限制膜上分解ESCRT复合物[9–11]. 酵母ESCRT-III由四种成分（Vps2p、Vps20p、Vps 24p和Vps32p/Snf7p）与四种外周/调节蛋白组成的核心复合物组成，它是Vps32p/Snf7p的聚合以及Vps24p和Vps2p的共组装，通过弹簧机制驱动ILV从内体的限制膜上发芽[12,13].

尽管HeLa-KK3细胞中哺乳动物ESCRT-0蛋白HRS或ESCRT-I蛋白TSG101的缺失通过再循环到细胞表面来保护MHC I类分子免受溶酶体降解[5]，我们观察到三种ESCRT-II蛋白（VPS22、VPS25和VPS36）的缺失都没有影响[14]. 在本研究中，我们检查了其他ESCRT蛋白在下调KK3多泛素化MHCⅠ类中的需求。我们发现，尽管需要核心ESCRT-III蛋白VPS32B、VPS24和VPS2A，但不需要剩余的核心ESCRT-III蛋白VPS20/CHMP6（带电MVB蛋白6）。相反，Bro1p/Vps31p相关蛋白HD-PTP[也称为组氨酸域蛋白酪氨酸磷酸酶非受体23型（PTPN23）]是MHC I类下调所必需的。HD-PTP突变体的作用表明，HD-PTP作为ESCRT-I和ESCRT-III之间的替代连接体，因此表明非经典ESCRT途径用于将KK3多泛素化MHC I类分类为MVBs。

实验

细胞和抗体

如前所述，HeLa和HeLa KK3细胞在添加10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640培养基（Gibco-BRL）中作为粘附单层生长[5].

小鼠单克隆抗MHC I类（w6/32）抗体来自Sigma–Aldrich，小鼠抗MHCⅠ类（HC10）抗体来自Hidde Ploegh（美国马萨诸塞州剑桥市怀特黑德生物医学研究所），FITC-w6/32和HRP（辣根过氧化物酶）-w6/32-小鼠单克隆抗体来自Serotec，来自Gene Tex的小鼠单克隆抗TSG101（4A10）抗体、来自Enzo Life Sciences的小鼠单抗抗泛素（FK2）抗体、与Invitrogen的Alexa Fluor 647偶联的山羊抗鼠IgG（高度交叉吸收）、小鼠抗钙粘蛋白抗体（AF8）迈克尔·布伦纳（美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）赠送的礼物、来自亲和生物试剂的兔多克隆抗钙网蛋白（PA3-900）抗体、来自Harald Stenmark（挪威奥斯陆蒙特贝罗奥斯陆大学医院癌症生物医学中心，N-0379）的礼物以及Matthew Seaman（英国剑桥希尔斯路剑桥医学研究院）赠送的兔多克隆抗GFP抗体。对于免疫金EM，我们使用来自分子探针的兔多克隆抗俄勒冈州绿488/FITC（A-889）抗体。蛋白质A与15nm胶体金结合，来自荷兰乌得勒支乌得勒支特大学细胞生物学系。

为了产生兔抗人VPS20/CHMP6多克隆抗体（编码8086），在细菌中表达GST–VPS20融合蛋白并按上述方式纯化[15]并用于哈兰Sera-Lab Ltd.的兔子免疫。

siRNA敲除

所使用的siRNA寡核苷酸是来自Dharmacon的siGENOME SMART或ON-TARGET plus池，如下所示：HRS，L-016835-00；TSG101，M-003549-01；VPS25，M-005201-00；VPS20，D-005060-00；VPS32A，M-020698-00；VPS32B，M-018075-00；VPS24，M-004696-01；VPS2A，M-020247-00；VPS2B，M-004700-00；HD-PTP，M-009417-01（以及单双工器oligo3，D-009417-03和oligo4，D-008417-04）。对于ALIX，siRNA双链与之前使用的一样[14]. 对于VPS20拯救实验，siRNA为寡核苷酸1，其序列为5′-UCACCAGAUCGAAAUGAAUU，对于HD-PTP拯救实验，siRNA为寡糖2，Doyotte等人[16]，其序列为5′-GCAAACAGCGGAUGCAAUU。

Motley等人描述了第5天收获细胞的siRNA双转染方案[17]和以前使用过[14]但转染后立即添加含有20%FCS的培养基，而不是在4小时后添加。对于TSG101敲除，在第1天和第2天转染细胞，并在第4天收获细胞，以防止在5天方案中出现广泛的细胞死亡。对于CHMP2A/VPS2A敲除，细胞仅在第1天转染，因为该蛋白的长期耗竭导致细胞死亡。如前所述，通过SDS/PAGE后的免疫印迹法评估敲除[14]使用来自NewEngland Biolabs、GE Healthcare Life Sciences和Bio-Rad的分子质量蛋白标记，或通过实时定量PCR。Ambion®细胞-CT型™试剂盒用于mRNA提取和cDNA转换，然后使用来自Life Technologies的TaqMan®引物/探针集进行实时PCR的TaqMan®基因表达分析，包括VPS24、VPS32B、HD-PTP。根据Larionov等人[18].

在VPS20拯救实验中，将myc-VPS20克隆到pIRESneo2中，该myc-VPS20在寡核苷酸siRNA序列一致性区域包含三个沉默突变，并用TransIT-HeLa Monster转染HeLa细胞®然后对稳定表达的细胞进行抗生素筛选。随后使用寡核苷酸1或ON-TARGET加上VPS20池siRNA对这些细胞进行处理，如上所述。

对于HD-PTP拯救实验，含有编码野生型（WT）和L202D/I206D突变体HD-PTP的寡2 siRNA抗性或敏感DNA序列的质粒[16]，是Philip Woodman（英国曼彻斯特大学生命科学学院）的礼物，并将编码HD-PTP的DNA序列扩增并克隆到pEGFP-C3中。采用单一敲除转染方案。HeLa KK3细胞在第1天以正常寡核苷酸转染，但12小时后使用来自Qiagen的Effectene转染pEGFP-C3质粒。在第4天收集瞬时转染细胞。

流式细胞术分析

采集细胞，与抗MHC I类w6/32抗体和与Alexa Fluor 647结合的山羊抗鼠IgG悬浮培养，然后使用FACScalibur（BD Bioscience）进行分析，如前所述[14]. 对照孵育使用仅与Alexa Fluor 647偶联的次级山羊抗鼠IgG。为了比较不同实验中击倒的效果，使用FlowJo软件计算每个特定击倒的荧光强度峰值的几何平均值，并与模拟击倒进行比较。配对t吨测试用于统计比较。在HD-PTP拯救实验中，GFP阳性细胞被选通，因为这些细胞比未转染的HeLa-KK3细胞具有更高的绿色荧光。

脉冲相位标记

MHC I类的放射标记和免疫沉淀如前所述[5,19]. 简而言之，在用siRNA去除单个ESCRT蛋白后，HeLa-KK3细胞在37°C下标记10分钟(35S） 半胱氨酸/(35S） -蛋氨酸使用来自Perkin Elmer的EasyTag™EXPRESS35S蛋白质标签混合物，然后在37°C的无放射性氨基酸培养基中培养3小时。在0分钟、45分钟或3小时时取出样品。在用1%Triton X-100溶解后，先用构象特异性小鼠单克隆抗MHCⅠ类（w6/32）进行一次免疫沉淀，然后在1%SDS中变性，再用“非形成性”抗MHCⅡ类小鼠单克隆抗体HC10和随后的SDS/PAGE和放射自显影术进行再免疫沉淀。

抗体摄取和EM

对于中所示的抗体摄取研究图1，在RPMI-1640培养基中的玻璃盖玻片上生长的HeLa-KK3细胞在37°C下用IFNγ（200单位/ml Peprotech EC）预处理过夜，以增加细胞表面MHC I类的浓度[20]. 这种预处理对细胞形态没有影响。对于所有抗体摄取研究，RPMI-1640中的细胞用HRP-w6/32或FITC-w6/32培养，最初在0°C培养2小时，然后在37°C培养90分钟。在初步免疫荧光显微镜实验后，选择90分钟的培养期以确保晚期内体室的负荷（结果未显示）。当培养基酸化至pH 5.5时，90%以上的w6/32在pH 7.4时与细胞表面MHC I类结合，与免疫荧光共聚焦显微镜下未标记w6/32的摄取相比，HRP或FITC的存在不会干扰抗体摄取（结果未显示），与标记的w6/32一致，该标记用于监测MHC I类通过内体的流量。用HRP-w6/32培养的细胞随后在室温下用PBS洗涤，用2%多聚甲醛/2.5%戊二醛在0.1M二甲酰二胺钠缓冲液中在室温下固定1h，在PBS中洗涤，用DAB（3,3′-二氨基联苯胺）/h培养2O（运行）2（1 mg/ml DAB；4μl H2O（运行）2在10 ml PBS中），在室温下黑暗中放置10分钟，并按照前面所述进行EM传输处理[21]. 对于免疫金EM，用PBS清洗与FITC-w6/32孵育的细胞，用4%多聚甲醛/0.1%戊二醛在0.1 M二甲氨基甲酸钠缓冲液中在室温下固定1 h，制备并冷冻超薄切片（50–70 nm），用抗FITC和金结合蛋白A标记，如前所述[21]. 为了量化，MVB被定义为含有一个以上内部囊泡的膜结合液泡。在将FITC-w6/32摄入HeLa-KK3细胞后，从两个单独的实验中，在六个独立标记的EM网格上总共计算了7839个金粒子，在VPS20耗尽后，在三个独立标记EM网格中计算了1535个金粒子。

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来自HeLa-KK3细胞表面的MHC I类分子被内吞入MVB，而不是TGN

(A类)用干扰素γ处理的HeLa-KK3细胞在37°C下与HRP-结合的抗MHCⅠ类细胞孵育90分钟后固定，与DAB/H孵育2O（运行）2电子密度HRP/DAB反应产物显示，胞内HRP标记的抗MHC I类抗体积聚在MVB（箭头）中。比例尺，1μm。(B类)用IFNγ处理HeLa-KK3细胞，在37°C下用FITC-结合的抗MHCⅠ类培养90分钟，冰冻超薄切片用抗FITC（15 nm金）进行免疫标记。有代表性的MVB含有累积的内吞抗MHC I类抗体（箭头）。比例尺，200纳米。(C类)在37°C下摄取90分钟后，在冷冻超薄切片上对免疫金标记的FITC缀合的抗MHC I类进行定量。计数的金颗粒的平均值±S.E.M。缩写：OMA，其他膜相关金颗粒。

结果

内吞多泛素化MHC I类被输送至MVB

先前确定的HRS和TSG101在下调细胞表面MHCⅠ类和靶向多泛素化MHCⅠ级中的需求，用于内吞后HeLa-KK3细胞的溶酶体降解，这意味着该蛋白是通过MVB运输到溶酶体的[2,5]. 为了证实这一点，我们在HeLa-KK3细胞上进行了抗MHC I类抗体摄取实验，然后进行了EM分析。我们观察到，在摄取HRP-结合的抗MHC I类抗体并与DAB/H孵育后，用电子致密反应产物标记MVB2O（运行）2(图1A） ●●●●。我们还通过免疫电镜检查了FITC-结合的抗MHCⅠ类细胞内吞和抗FITC抗体检测后的HeLa-KK3细胞。在多泡结构中，尤其是在MVB中的ILV中，始终观察到I类内源性抗MHC(图1B） ●●●●。定量分析表明，在摄取细胞表面结合的抗MHC I类抗体90分钟后，44.9±7.7%的抗MHC-I类抗体位于定义为MVB的隔间(图1C） ●●●●。其余的与其他膜相关，包括管状和囊泡成分，与内吞途径一致。

不同ESCRT蛋白缺失对多泛素MHC I类下调的影响

为了研究不同ESCRT蛋白在下调KK3多泛素化MHCⅠ类中的需求，我们在与各种siRNA孵育后，通过细胞荧光分析测定了HeLa-KK3细胞表面MHCⅠ的数量。与之前的实验一致[2,5]ESCRT-0蛋白HRS或ESCRT-I蛋白TSG101的缺失增加了MHCⅠ类的表面浓度(图2A） ●●●●。这被观察到是细胞荧光测量痕迹向右移动(图2B代表TSG101缺失后的代表性个体痕迹），表明KK3介导的MHC I类下调受到抑制。耗尽ESCRT-II蛋白VPS25未能增加MHCⅠ类细胞表面浓度(图2A和​和2C），2C） ，如前所述（中的图8[14])消耗ALIX也没有影响(图2A和​和2D），2D） 是酵母Bro1p/Vps31p的哺乳动物同源物，可在将ESCRT-I的TSG101连接到ESCRT-III中的VPS32/CHMP4时替代ESCRT-II[22,23].

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耗尽ESCRT蛋白对病毒泛素化MHCⅠ类下调的影响

(A类)使用siRNA池去除单个ESCRT蛋白后，HeLa-KK3细胞中MHC类I细胞表面表达的细胞荧光分析总结。在每次实验中，将siRNA处理细胞的几何平均荧光数据与模拟处理细胞的数据进行比较，并将其归一化为100%。平均值±S.E.M.，括号内的实验次数，P（P）-值**≤0.01，*<0.05。(B–G类)单个ESCRT蛋白耗竭后HeLa-KK3细胞中MHC I类细胞表面表达的代表性细胞荧光测定痕迹（未填充的黑色痕迹）。还显示了次级抗体对照（填充的黑色痕迹）、模拟处理的HeLa-KK3（未填充的灰色痕迹）和HeLa（填充的灰色痕）细胞的痕迹。通过免疫印迹或实时定量PCR（三个样品的平均值±S.E.M.）显示敲除的有效性。钙网蛋白。(H（H）)单个ESCRT蛋白耗竭后MHC I类HeLa-KK3细胞降解的脉冲相分析。CANX（calnexin）与小鼠抗CANX抗体AF8的免疫沉淀（来自脉冲期放射性标记细胞裂解物）提供了输入裂解物控制。

核心酵母ESCRT-III蛋白的人类同源物为VPS20/CHMP6、VPS24/CHMP3、VPS2/CHMP2和VPS32/CHMP4，但前一对都有一个哺乳动物亚型，VPS2/CHMP2有两个亚型，而VPS32/CHMP4有三个亚型。VPS24/CHMP3耗尽(图2A和​和2E）2E） 和VPS2A/CHMP2A(图2A） ，但不是CHMP2B/VPS2B(图2A） 导致HeLa-KK3细胞表面MHC I类增加。与之前的研究一致[24]VPS32B/CHMP4B的耗竭，但VPS32A/CHMP4A或VPS32C/CHMP4C的耗竭不会特别增加细胞表面MHC I类(图2A和​和2F2F和结果未显示）。在siRNA处理后，上述细胞表面MHC I类的所有观察到的增加均发生在HeLa-KK3细胞中，而不是HeLa细胞中，并用构成每个siRNA池的至少两个单独的寡核苷酸进行了证实（结果未显示）。

尽管HeLa-KK3细胞中VPS24/CHMP3和VPS2/CHMP2或VPS32/CHMP4各一亚型的缺失导致细胞表面MHC I类增加，但当ESCRT-III的第四个核心亚单位VPS20/CHMP6被耗尽时，未观察到任何影响(图2A和​和2G）。2G） ●●●●。此外，HeLa-KK3细胞的脉冲相放射标记实验表明，与此观察结果一致，VPS20/CHMP6耗尽后MHC I类降解，而VPS24/CHMP3或TSG101耗尽后观察到MHC I级降解的保护作用(图2H） 。Langelier等人之前曾报告过，消耗VPS20/CHMP6对KK3刺激MHC I类降解的影响也类似[25]，但不显示数据。

VPS20/CHMP6的耗尽改变了内吞小室的形态

在我们的实验中，尽管VPS20/CHMP6耗尽对内胚体系统的形态有着深刻的影响，并且高达80%的细胞中出现了扩大的泛素化间隔，但观察到VPS20/CHMP6对细胞表面MHC I类细胞没有影响(图3A） ●●●●。这些扩大的泛素化小室也呈LAMP1阳性（结果未显示），当HeLa或HeLa-KK3细胞与四个VPS20/CHMP6 siRNA寡核苷酸池孵育时可见。当细胞与来自siRNA池的三个单一寡核苷酸孵育时，也观察到类似的效果（参见图3A代表寡核苷酸1），尽管在单个寡核苷酸的个体实验中，具有扩大的泛素化隔室的细胞比例在～10%～70%之间变化，与SDS/PAGE评估的～40%～90%的VPS20/CHMP6耗竭程度广泛相关（结果未显示）。当ESCRT蛋白如HRS或TSG101耗尽时，扩大的泛素化隔室与先前观察到的有一些相似之处[26,27]. 考虑到在用单个siRNA寡核苷酸去除VPS20/CHMP6后，细胞比例的变化清楚地显示出扩大的泛素化隔室表型，我们设计了一个拯救实验。与寡核苷酸1孵育后形成的扩大的泛素化隔室，而不是siRNA池，可以通过表达寡核苷酸siRNA抗性myc标记的VPS20/CHMP6来挽救(图3A–三C） ●●●●。传输EM显示，MVB簇通常与扩大的隔室相关(图3D） 。在VPS20/CHMP6缺失的HeLa-KK3细胞中，对MHC I类的胞内FITC-标记抗体仍被传递到这些MVB(图3E） 在这些细胞中，40.3±1.3%的抗体与MVB相关，抗体摄取90分钟后。

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耗尽VPS20/CHMP6对内吞小室的影响

(A类)模拟击倒或用siRNA池或单个siRNA寡核苷酸击倒后，用抗泛素抗体染色的HeLa细胞的免疫荧光共聚焦显微镜观察（上面板）。下部面板显示稳定转染的HeLa细胞表达寡核苷酸siRNA-耐药myc-标记的VPS20（myc-VPS20RNAires公司HeLa细胞）。比例尺=10μm(B类)免疫印迹显示VPS20和myc-tagged VPS20在HeLa细胞和myc-VPS20中的表达RNAires公司siRNA敲除后的HeLa细胞*myc-VPS20；钙网蛋白。(C类)HeLa细胞或myc-VPS20中具有扩大的泛素化区室表型的细胞比例RNA红外线HeLa细胞在内源性VPS20被siRNAs或寡核苷酸耗尽后。平均值±S.E.M.（三个盖玻片，每个盖玻片50个细胞）。(D类)用VPS20 siRNA池处理的HeLa细胞的透射电子显微照片，显示了膨胀的内吞室和相关的MVB。比例尺=500nm。(E类)抗FITC抗体（15 nm金）染色的HeLa-KK3细胞冷冻切片的透射电镜照片，在VPS20被击倒后，允许在37°C下内吞FITC-结合的抗MHC I类90分钟。有两种典型的MVB含有累积的内吞抗MHC I类抗体。比例尺=200nm。

HD-PTP是下调I类多泛素化MHC的必要条件

在酵母中发现的典型ESCRT途径中，ESCRT-II与Vps20p结合，并触发Vps32p/Snf7p的同源低聚化[12]. 鉴于ESCRT-II、VPS20/CHMP6和ALIX不需要下调HeLa-KK3细胞中KK3多泛素化MHCⅠ类的表达，我们寻找了另一种蛋白，该蛋白可以将哺乳动物ESCRT-I与ESCRT-III中的VPS32/CHMP4连接起来。我们研究了HD-PTP蛋白缺失的影响，该蛋白在结构上与ALIX有关，是酵母Bro1p/Vps31p的哺乳动物同源物[28]. HD-PTP可以绑定到ESCRT-I组件TSG101和UBAP1，并且具有可以与CHMP4B交互的中央Bro1域[29,30]. 与耗尽HeLa-KK3细胞中ALIX时缺乏效果相反，HD-PTP被四个siRNAs池击倒，导致MHCⅠ类细胞表面浓度显著增加(图4A和​和4B）。4B） ●●●●。该效果与消耗VPS2A时的效果最接近(图2A） 在五次实验中测量几何平均荧光(图4A） ●●●●。池中的四个单一寡核苷酸都有类似的作用(图4C和​和4D4D代表oligo3和oligo4；其他未显示的结果），当对照HeLa细胞用池处理时，细胞表面MHC I类没有变化(图4E） ●●●●。siRNAs池和池中的单个寡核苷酸都降低了HD-PTP转录水平>90%(图4F） ●●●●。然后，我们在先前研究的基础上设计了一个救援实验，在该实验中，HD-PTP的缺失可以减少液相标记物和EGFR（表皮生长因子受体）向溶酶体的转移[16]. 正如预期的那样，瞬时转染HeLa-KK3细胞中表达的siRNA-敏感GFP-标记HD-PTP通过单一siRNA双链（oligo2）处理而耗尽，但oligo2 siRNA--耐药GFP-标签HD-PTP没有(图5A） ●●●●。在瞬时转染WT-siRNA-resistant GFP-tagged HD-PTP（WT-GFP-HD-PTP）的HeLa-KK3细胞群中RNAires公司)分别对GFP阳性细胞和GFP阴性细胞的细胞表面MHCⅠ类进行分析。表达WT-GFP-HD-PTP的GFP阳性细胞中MHCⅠ类的细胞荧光示踪RNAires公司在oligo2被击倒后，几乎没有向右转，证明了救援行动(图5B） ●●●●。这与来自相同寡核苷酸处理的瞬时转染人群的GFP阴性、HD-PTP-depleted细胞中MHC I类细胞荧光测定迹线的预期右移形成对比(图5C） ●●●●。在表达WT-siRNA-敏感GFP-标记HD-PTP（WT-GFP-HD-PTP；图5D） 或siRNA-resistant GFP-tagged L202D/I206D突变体HD-PTP（Mut GFP-HD-PTPRNAires公司;图5E） ●●●●。L202D和I206D突变位于Bro1结构域，阻止与VPS32B/CHMP4B结合[16]. 因此，中显示的数据图5与HD-PTP与VPS32B/CHMP4B的结合是HeLa-KK3细胞中MHC I类下调所必需的。

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HD-PTP耗竭对病毒泛素化MHC I类下调的影响

(A类)用siRNA池模拟敲低或耗竭HD-PTP后，HeLa-KK3细胞中MHC I类细胞表面表达的细胞荧光分析总结。将来自siRNA处理细胞的几何平均荧光数据与来自模拟处理细胞的数据进行比较，归一化为100%。平均值±S.E.M.，括号内的实验次数，P（P）-值**≤0.01。(B–D类)使用siRNA池耗尽HD-PTP（未填充的黑色痕迹）后，HeLa-KK3细胞中MHC类I细胞表面表达的代表性细胞荧光测定痕迹(B类)或来自池中的单个siRNAs，oligo3(C类)和寡核苷酸4(D类). 还显示了模拟处理的HeLa-KK3细胞（未填充的灰色痕迹）和二级抗体对照（填充的黑色痕迹）的痕迹。(E类)使用siRNA池（未填充的黑色痕迹）耗尽HD-PTP后，HeLa细胞中MHC I类细胞表面表达的代表性细胞荧光测定痕迹。还显示了模拟处理HeLa细胞的痕迹（填充灰色痕迹）和二级抗体控制（填充黑色痕迹）。(F类)实时定量PCR显示面板中显示的代表性实验中敲除的有效性(B类–E类). 三个样品的平均值±S.E.M。

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HD-PTP敲除后病毒泛素化MHCⅠ类下调的拯救

(A类)在第1天用非靶向siRNA（NT）或HD-PTP oligo2 siRNA处理HeLa-KK3细胞，然后在12小时后用pEGFP-C3质粒转染含有编码WT、oligo2 siRNA抗性WT（WT）插入物的质粒RNAires公司)或oligo2 siRNA抗性L202D/I206D突变体（MutRNAires公司)GFP-HD-PTP。第4天，用抗GFP免疫印迹法检测收获细胞中是否存在GFP-HD-PTP。(B–D类)经寡核苷酸siRNA处理并转染GFP-HD-PTP构建物的HeLa-KK3细胞中MHC I类细胞表面表达的代表性细胞荧光测定痕迹（未填充的黑色痕迹）。在(B类和C类)用寡核苷酸siRNA处理细胞并转染WT-GFP-HD-PTPRNAires公司在分析GFP阳性之前(B类)和负片(C类)单元格。在(D类)用寡核苷酸siRNA处理细胞，并转染WT-GFP-HD-PTP(E类)，用寡核苷酸2 siRNA处理并转染L202D/I206D突变的Mut-GFP-HD-PTPRNAires公司。还显示了二级抗体对照（填充的黑色痕迹）和模拟处理的HeLa-KK3（未填充的灰色痕迹）的痕迹。

讨论

在本研究中，我们已经表明，在HeLa-KK3细胞中，下调KK3-多泛素化MHCⅠ类涉及通过MVB从质膜到溶酶体的交通。我们的siRNA敲除实验，以及之前公布的数据[5,14,24,25]与需要ESCRT-0（HRS）、ESCRT-1（TSG101）以及ESCRT-III四个核心成分中的三个（VPS32B/CHMP4B、VPS24/CHMP3和VPS2A/CHMP2A）的下调相一致，但不包括ESCRT-II（VPS25）或ESCRT-IIII蛋白VPS20/CHMP6。这些数据表明，ESCRT-II和VPS20/CHMP6将ESCRT-I连接到ESCRT-III蛋白VPS32/CHMP4聚合的经典ESCRT途径不能解释MVB的分类和KK3多泛素化MHC I类的下调。这与显示ESCRT-II在下调多种转运蛋白、趋化因子和生长因子受体中的需求的研究形成了对比[31,32]. 然而，应该注意的是，ESCRT-II和VPS20/CHMP6不是ESCRT依赖性过程所必需的，胞质分裂和逆转录病毒从细胞表面出芽[7,12]. 此外，对酵母核孔复合物组装的ESCRT依赖性监测不需要Vps20p[33]ESCRT依赖的质膜伤口修复不需要VPS20/CHMP6[34].

虽然发现Bro1p相关蛋白ALIX与ESCRT-I和ESCRT-III之间存在联系，从而导致人类免疫缺陷病毒的萌芽[25]下调KK3-泛素化MHCⅠ类并不需要HD-PTP。我们发现，下调KK3-polyubiquitinated MHCⅠ级需要不同的Bro1p-related蛋白HD-PTP，这与用于下调这种特定货物的非标准ESCRT途径一致。有趣的是，HD-PTP的L202D/I206D突变体不能结合VPS32B/CHMP4B[16]尽管先前已经证明，内源性HD-PTP缺失在支持EGF分选为MVB方面与WT HD-PTP一样有效，但无法挽救内源性HD-PTP缺失对KK3介导的MHC I类下调的影响[16]. HD-PTP在EGFR分类中的作用似乎比简单地作为ESCRT-I和ESCRT-III之间的链接更为复杂，因为它还与哺乳动物ESCRT-0中的STAM2结合，并被提议与氘化酶UBPY结合，将EGFR从ESCRT-01转移到ESCRT-IIII，并帮助将EGFR分类到MVB[35]. 实验数据果蝇属和/或哺乳动物细胞也与整合素、E-cadherin和Toll受体的内胚体分选有关[36–39]尽管在这些情况下，其作用机制尚不清楚。

众所周知，在哺乳动物细胞中形成泛素化货物并将其分类为MVB的分子机制比酵母中使用的经典ESCRT途径更复杂和多样[40]. 一种不依赖于HRS和TSG101但需要ALIX和ESCRT-III蛋白的非规范ESCRT途径被证明负责将非泛素化G蛋白偶联受体、蛋白酶激活受体1分类为MVB，以便随后被溶酶体水解酶降解[41]. 此外，有证据表明同一小区中存在多种MVB[42]以及非ESCRT介导的形成和分类成MVB[43–46]. 此外，对三种哺乳动物ESCRT-III蛋白VPS24/CHMP3、VPS60/CHMP5和VPS2/CHMP2B的研究表明，它们在内切体-溶酶体融合中具有不同于MVB形成的调节作用[47–49]. 本研究中观察到的VPS20/CHMP6耗竭的影响，以及与LAMP1阳性内吞室肿胀相关的栓系MVB的积累，也与内体-溶酶体融合的调节作用相一致，尽管它们同样意味着，如果要使所有泛素化货物能够胜任融合，就必须将其正确分类为多功能车辆。

总之，我们的数据提供了非标准ESCRT途径的证据，该途径将一种特殊的货物，即KK3-多泛素MHC I类，分类为哺乳动物细胞中的MVB。该途径利用HD-PTP而非ESCRT-II和VPS20/CHMP6将ESCRT-I连接到ESRCT-III。与用于下调其他细胞表面蛋白的ESCRT途径的差异可能反映了Lys的同质性63KK3将多泛素链添加到MHC I类细胞溶质尾部，这与多个单泛素化和多泛素化以及/或混合链接的多泛素链条的混合物形成对比，该混合物已被报道用于其他一些下调的膜蛋白的细胞溶质尾和/或与其他E3连接酶的泛素化[50–52].

致谢

我们感谢利迪娅·邓肯（Lidia Duncan）和萨利·格雷（Sally Gray）在实验方面的建议和帮助，感谢剑桥医学研究院（Cambridge Institute for Medical Research）核心支持科学人员在流式细胞术和显微镜技术方面的帮助。

缩写

热电联产带电MVB蛋白
轻而快地擦掉3,3′-二氨基联苯胺
表皮生长因子受体表皮生长因子受体
电子顺磁共振成像运输所需的内胚体分选复合体
未来作战系统胎牛血清
HD-PTP（HD-PTP）组氨酸结构域磷酸酪氨酸磷酸酶
人力资源计划辣根过氧化物酶
ILV公司腔内小泡
KK3公司卡波西肉瘤相关疱疹病毒蛋白K3
KSHV公司卡波西肉瘤相关疱疹病毒
多功能车辆总线多泡体
PTPN23型组氨酸结构域蛋白酪氨酸磷酸酶非受体23型
Vps/Vps空泡蛋白分选
重量野生型

作者贡献

Michael Parkinson、Sián Piper和Jennifer Evans进行了siRNA实验、流式细胞术、免疫印迹、实时定量PCR和处理数据。Nick Bright执行了所有EM，包括量化，Jessica Boname执行了脉冲相位标记实验和处理数据。凯瑟琳·鲍尔斯、保罗·莱纳和保罗·卢西奥构思并指导了这项研究。所有作者讨论了结果，解释了数据，并共同撰写了论文。

基金

这项工作得到了医学研究委员会的支持G0900113号（对J.P.L.）]；Wellcome Trust[拨款数量101835; （对P.J.L.）和100140和093026（剑桥医学研究所）]; 和英国心脏基金会FS/02/045（致K.B.）]。M.D.J.P.和J.L.E.是MRC研究生，S.C.P.是Wellcome Trust研究生。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供波特兰出版社