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鲜血。2015年9月10日；126（11）：1346–1356。
在线预发布2015年7月17日。 数字对象标识：10.1182/血液-2015-01-621870
预防性维修识别码：项目经理4608389
PMID：26186940

靶向性谷氨酰胺水解对急性髓细胞白血病具有抗白血病活性，并与BCL-2抑制协同作用

纳塔莉·雅克,1,2 安妮·玛丽·朗切蒂,1,2 克莱门特·拉鲁厄,三，4 虔诚的梅尼尔,1,2 鲁迪·伯森,1,2 莉斯·威廉姆斯,1,2,5,6 埃斯特尔·萨兰德,三，4 贾斯汀·德库克,7 蒂亚戈·特罗瓦蒂·马西尔,7 米雷尔·兰伯特,1,2 劳里·普兰,1,2 玛丽·安妮医院,1,2 皮埃尔·苏霍伯特,1,2 劳雷·约瑟夫,1,2 尼古拉斯·查普斯,1,2,6 凯瑟琳·拉科姆,1,2,6 伊万·克鲁斯·莫拉,7 苏珊·德莫,8 让·伊曼纽尔·萨里,三，4 克里斯蒂安·雷切尔,三，4 帕特里克·马约,1,2,6 杰罗姆·坦布里尼,1,2,5,6和迪迪埃·鲍提尔通讯作者1,2,5,6
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关键点

  • 基因或化合物CB-839诱导的GAC抑制减少OXPHOS，并在AML中具有抗白血病活性。
  • 化合物ABT-199对GAC的抑制与BCL-2的抑制协同作用。

摘要

癌细胞需要谷氨酰胺来适应增加的生物合成活性。细胞内谷氨酰胺分解代谢的限制步骤包括谷氨酰胺酶（GA）将其转化为谷氨酸。不同的GA亚型由基因编码GLS1级和GLS2型在人类中。在此，我们发现谷氨酰胺水平控制急性髓细胞白血病（AML）细胞中的线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）。谷氨酰胺酶C（GAC）是AML中表达最丰富的GA亚型。两次击倒GLS1级药物CB-839对GLS1的表达和药物抑制可以减少OXPHOS，导致白血病细胞增殖停滞和凋亡，而不会对正常人CD34产生细胞毒活性+祖细胞。引人注目的是，GLS1级敲除显著抑制NSG小鼠AML的发展。CB-839的抗白血病活性被高活性GAC的表达所抵消K320安等位基因和三羧酸循环产物α-酮戊二酸的添加，表明GLS1在AML细胞存活中的关键作用。最后，谷氨酰胺水解抑制激活线粒体凋亡，并协同致敏白血病细胞以启动BCL-2抑制剂ABT-199。这些发现表明，通过抑制GLS1靶向谷氨酰胺成瘾为AML提供了一种潜在的新的治疗策略。

介绍

癌细胞的存活依赖于持续的生物合成活动，而这些活动是通过增加对谷氨酰胺等营养物质的摄入而促进的。新陈代谢所需的能量产生依赖于糖酵解，而不是线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），这可能导致葡萄糖产生乳酸（称为Warburg效应）。1然而，癌细胞线粒体的功能保持不变，2允许三羧酸（TCA）循环中间产物“供给”生物合成途径。因此，癌细胞可能对谷氨酰胺分解“上瘾”（TCA循环中的一个限制步骤），因为谷氨酰胺是碳分子的主要来源，可以维持肿瘤生长-促进代谢途径。三谷氨酰胺水解的门控酶是谷氨酰胺酶（GA），它催化谷氨酰胺水解为谷氨酸。在第二步中，谷氨酸脱氢酶（GDH）或转氨酶从谷氨酸中产生α-酮戊二酸（αKG），供给TCA循环。在哺乳动物细胞中，GA家族包括由GLS公司、肾脏（K型）谷氨酰胺酶（KGA）和谷氨酰胺酶C（GAC），通常称为GLS1。4,5与正常组织相比，KGA和GAC在多种癌症中的表达增加，并且这些酶的靶向抑制已被证明具有抗肿瘤作用。6-9此外，GLS2级编码2种肝脏（L型）同工酶，LGA和GAB，统称为GLS2。10-12 GLS2级是一个执行肿瘤抑制功能的p53靶基因。13,14

我们之前表明，靶向谷氨酰胺摄取可以在急性髓细胞白血病（AML）中产生强大的抗白血病反应，我们在这方面提出了谷氨酰胺成瘾下游的mTORC1信号通路的参与。15然而，对于急性髓性白血病的线粒体代谢知之甚少。与正常造血细胞相比，原代AML细胞的线粒体质量和耗氧量增加，靶向线粒体翻译具有抗白血病作用。16二甲双胍对线粒体呼吸链复合物I的抑制可以减少AML的耗氧量并诱导细胞毒性。17此外，以低活性氧为特征的白血病干细胞对OXPHOS上瘾，而不是糖酵解，因为使用BCL-2抑制剂的OXPHOS靶向导致凋亡细胞死亡，而糖酵分解增加无法弥补。18

在此，我们报告GLS1，尤其是GAC亚型，是AML中在蛋白水平表达的主要GA亚型。利用遗传和药理学方法，我们发现GLS1抑制可以降低耗氧率（OCR），导致细胞增殖抑制和凋亡。在AML系统性小鼠异种移植模型中，多西环素诱导GLS1型击倒大大减少了AML的发展并延长了生存期。最后，抑制谷氨酰胺分解可激活半胱氨酸蛋白酶依赖的线粒体凋亡途径，BCL-2抑制可与GLS1抑制剂化合物CB-839协同作用。我们的研究结果表明，靶向性谷氨酰胺水解是一种利用AML细胞谷氨酰胺成瘾作为治疗手段的新策略。

材料和方法

主要人体样本

患者和健康捐赠者根据赫尔辛基宣言提供了书面知情同意书，并获得了科钦医院机构伦理委员会的批准。从31例新诊断的AML患者的骨髓（BM）或外周血（PB）中获取原始细胞含量>70%的样本；患者特征见补充表1，可在血液网站。CD34+使用MIDI MACS免疫亲和柱纯化BM健康供体或脐血中富含造血祖细胞（HPCs）的部分（Milteny Biotech，Bergish Badgash，德国）。

细胞系和试剂

我们使用了MOLM-14、MV4-11、MOLM-13、OCI-AML2、OCI-AML3、HL60、K562、HEL、THP-1、U937和KG1A AML细胞系；补充表2中列出了这些电池的主要特性。细胞在含有谷氨酰胺（Gibco 61870；法国圣奥宾生命科技公司）或无谷氨酰胺的RPMI（Gibco-21870）的RPMI中培养，补充有或没有4mM谷氨酰胺的10%透析胎牛血清，如图所示。CB-839由Calithera Bioscience（加利福尼亚州旧金山）提供。化合物968来自默克密理博公司（德国达姆施塔特）。双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）（SML0601）和二甲基-αKG（34963-1）从Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）获得。Z-IETD-FMK（CASPASE-8抑制剂）来自R&D Systems（明尼苏达州明尼阿波利斯），Q-VD-OPh泛酶抑制剂（SML0063）来自Sigma-Aldrich。ABT-199（GDC-0199）来自Selleck Chemical（德克萨斯州休斯顿）。

蛋白质印迹

如前所述，进行全细胞提取和蛋白质印迹。15抗聚ADP-核糖聚合酶（PARP）、裂解CASPASE-3、CASPASE-8、p21和p27的抗体来自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）；抗β-肌动蛋白和抗GLS2（HPA038608）抗体来自Sigma-Aldrich。抗-GAC（19958-1-AP）和抗GLS1（20170-1-AP）抗体购自Proteintech（英国曼彻斯特）。内部采集抗P85抗体。

增殖试验

细胞以5×10接种4/mL，第0天，在第3、5和7天后用台盼蓝染色手工计数。

细胞凋亡测定

通过流式细胞术用Annexin V-藻红蛋白（法国Le Pont De Claix的Becton Dickinson Biosciences）或四甲基罗丹明乙酯（TMRE）（ab113852；法国巴黎的Abcam）染色定量细胞凋亡。

慢病毒载体

GLS1（TCRN0000045630[shRNA#5]和TCRN0000055632[shRNAs#7]）和非靶向（对照）短发夹（sh）RNA购自Open Biosystems，并克隆到pLKO-Tet-On诱导或pLKO.1质粒（质粒#2191519和#845320; Addgene，马萨诸塞州剑桥市）。这个通用汽车公司K320安和通用汽车公司重量从pcDNA hGAC载体中克隆等位基因21进入pInducer质粒。22

代谢分析

使用基于发光的细胞分析（CellTiter-Glo；Promega，Madison，WI）量化细胞内ATP水平。如前所述，使用Seahorse XF96细胞外流量分析仪测量耗氧量。23简言之，2×105将每种条件下的细胞接种在96周的XF96孔板中，该孔板涂有BD Cell-Tak（Becton Dickinson Biosciences），并加载无血清无缓冲Dulbecco改良的Eagle's培养基（含（102365-100）或不含（102353-100）谷氨酰胺）。37°C无CO培养1小时后2进行稳态和干预后分析。在不同的实验时间，向井内注入浓度不断增加的羰基氰化物米-氯苯腙（CCCP）是一种解偶联剂，可将OCR提高到理论最大值。最后，注射抗霉素A以抑制电子通过复合物III的流动，从而关闭OCR，因为无法消耗更多的氧气。谷氨酸、苹果酸和柠檬酸盐的浓度如先前报道的那样进行测量。24

人白血病细胞在NSG小鼠中的异种移植

成年小鼠（6-8周龄）在注射白血病细胞前24小时腹腔注射20 mg/kg白消安（法国皮埃尔·法布雷，Busilvex）。将培养的AML细胞系（MOLM-14 shCTR、MOLM-14-shGLS1、OCI-AML2-shCTR、OCI-AMEL2 shGLS1）在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤并悬浮在PBS中，最终浓度为每只小鼠每200μL PBS 200万个细胞，用于静脉注射。通过在NSG小鼠的尾静脉注射AML细胞（200μL PBS）生成异种移植瘤。25细胞注射后，立即将多西环素（200µg/mL+1%蔗糖）添加到饮用水中以诱导shRNA表达。饮用水每周更换两次。每组9只小鼠注射不同的AML细胞系。每天对老鼠的疾病症状（皱褶的皮毛、驼背、虚弱和运动能力下降）进行监测，以确定有痛苦迹象的注射动物的死亡时间。所有实验均按照国际实验动物护理评估和认证协会的指南进行。

化合物协同效应的计算

CB-839与BH3-模拟物ABT-199联合使用不同剂量进行测试。计算每个剂量组合的细胞凋亡相对诱导率。使用Chalice软件，26根据广泛使用的Loewe模型对药物自身剂量相加性的反应，比较了联合用药与单药的反应。与相加性相比，过度抑制可绘制为全剂量矩阵图，以可视化出现协同作用的药物浓度。

统计分析

所有数据均表示为具有标准偏差的平均值。使用Studentt吨测试。使用Prism软件（加利福尼亚州La Jolla GraphPad）分析数据。在AML细胞系中进行的独立实验均进行了≥3次。

结果

谷氨酰胺控制急性髓性白血病线粒体氧化还原蛋白

我们以前曾报道过抑制谷氨酰胺摄取在AML中发挥抗白血病作用。15在我们目前的研究中，我们将之前的观察结果扩展到了11个AML细胞系，这些细胞系在有或无谷氨酰胺的培养下培养。去除谷氨酰胺显著诱导所有受试AML细胞系的凋亡(图1A). 由于谷氨酰胺为许多癌症的TCA循环提供营养，我们假设谷氨酰胺的清除会导致TCA循环抑制导致的细胞凋亡。因此，TCA循环中间产物αKG可以阻止谷氨酰胺去除诱导的OCI-AML2和MOLM-14细胞凋亡(图1B). 在6种不同的AML细胞系中，我们观察到谷氨酰胺去除后细胞内ATP含量迅速显著降低（补充图1）。当OCI-AML2和MOLM-14细胞系在含有或不含谷氨酰胺的情况下培养时，我们使用Seahorse XF96分析仪观察到OCR显著降低，这表明谷氨酰胺分泌型AML细胞中OXPHOS抑制(图1C). 在基线和注射CCCP后都观察到了这种对OCR的影响，CCCP是一种解偶联剂，可将OCR提高到最大速率。谷氨酰胺缺乏对OCR的影响可以通过在所有这些细胞系中与αKG共培养来减弱(图1D). 这些发现表明AML细胞对谷氨酰胺依赖性TCA循环上瘾。

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谷氨酰胺控制AML中的线粒体OXPHOS。（A） 共有11个AML细胞系在加入或不加入Gln（4mM）的情况下培养48小时。通过流式细胞术分析Annexin V结合定量细胞凋亡。（B） 如图所示，OCI-AML2和MOLM-14细胞系在加入或不加入Gln（4 mM）和αKG（5 mM）的情况下培养48小时，并根据Annexin V结合定量细胞凋亡。（C） 如图所示，OCI-AML2和MOLM-14细胞系在添加或不添加Gln（4 mM）的情况下培养48小时，并使用Seahorse XF96细胞外通量分析仪在基础条件下以及添加增加剂量的CCCP（0.25、0.5和0.5μM）和抗霉素（10µM）后测量OCR。直方图显示了代表基线或CCCP后3个独立实验的数据（累积剂量，1µM）。（D） 如图所示，将MOLM-14细胞系在含有或不含有Gln（4mM）和αKG（5mM）的情况下培养48小时，并如C所示测量OCR。直方图显示了代表3个独立实验的数据*对< .05, **对< .01, ***对< .001.

GAC蛋白在AML中显著表达并调节OCR

我们测量了26份原发性AML样本、11份AML细胞系和CD34中KGA、GAC和GLS2的蛋白表达+来自4名健康捐赠者的HPC。在这些样本中，GLS1的GAC亚型在大多数AML细胞系和原代AML细胞中表达最多，而KGA几乎检测不到，GLS2缺失(图2A; 补充图2A）。在原发性AML细胞、白血病细胞系和正常CD34中，GAC在蛋白水平的表达与KGA相比在统计学上增加+造血细胞（补充图2B）。在mRNA水平上观察到类似结果（数据未显示）。我们使用2个Dox-诱导发夹（shRNA#5和shRNA#17）靶向GLS1亚型。归纳GLS1级敲除MOLM-14和OCI-AML2细胞可降低基线OCR和CCCP诱导的OCR(图2B)表明氧磷代谢减少。在HL-60细胞中也得到了类似的结果，但在OCI-AML3细胞中没有得到（补充图2C）。然后我们测试了3种GSL1抑制剂对OCR的影响。化合物CB-83924和BPTES27可以抑制这两种亚型，而化合物968被认为是GAC特异性的。8在OCI-AML2细胞中，CB-839，而不是BPTES或化合物968，可以抑制基线OCR(图2C). 与化合物968相比，CCCP解偶联线粒体后，CB-839和BPTES均能显著降低OCR。在MOLM-14细胞中观察到类似结果（补充图2D）。除了OCI-AML2细胞中的OCR调节外，CB-839和BPTES（而非化合物968）降低了细胞内谷氨酸、苹果酸和柠檬酸的浓度，表明这些化合物是靶向谷氨酸分解和TCA循环的有用工具(图2D). 在OCI-AML2细胞中，αKG可以逆转CB-839在基线和去耦后诱导的OCR抑制，表明在这种情况下OCR抑制与CB-839诱导的谷氨酰胺酶抑制有关(图2E). 在MOLM-14细胞中也获得了类似的结果（补充图2E）。然后用Dox诱导的GAC转导OCI-AML2细胞重量或GACK320安等位基因(图2F-G). GAC公司K320安等位基因编码对BPTES不敏感的纤维倾向性超活性形式的GAC。21GAC的表达K320安OCI-AML2细胞中的突变促进了对CB-839的抗性，因为OCR中没有观察到任何变化(图2F，右侧）。总的来说，这些发现表明靶向谷氨酰胺解作用影响线粒体呼吸和OCR。

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GAC蛋白在AML中显著表达并调节OCR。（A） 人类白血病细胞系分析。8例患者的AML细胞和正常CD34+用抗GLS1、抗GLS2和抗ACTIN抗体对4名健康献血者的HPC进行免疫印迹分析。（B） 用表达强力霉素诱导的GLS1 shRNA（#5）结构的慢病毒载体转染MOLM-14（左）和OCI-AML2（右）细胞。通过嘌呤霉素筛选建立稳定的感染细胞系。如图所示，在多西环素暴露2天后，使用Seahorse XF96细胞外流量分析仪在基础条件下以及添加CCCP和抗霉素后测量OCR。用抗GAC抗体在western blots中控制GAC表达的抑制。直方图显示了代表3个独立实验的数据。（C） OCI-AML2细胞与CB-839（1μM）、BPTES（10μM）或化合物968（10µM）一起培养6小时，并使用Seahorse XF96细胞外通量分析仪测量OCR。直方图显示了代表3个独立实验的数据。（D） 将OCI-AML2细胞与CB-839（1µM）、BPTES（10µM6细胞在冷PBS中清洗两次；将颗粒冷冻，并测量每种指示代谢物。（E） OCI-AML2细胞在加入或不加入CB-839（1µM）和αKG（5 mM）的情况下培养6 h，并测量OCR。直方图显示了代表3个独立实验的数据。（F） 用表达多西环素诱导的V5标记GAC的慢病毒载体转染OCI-AML2细胞重量或GACK320安构造。通过嘌呤霉素筛选建立稳定的感染细胞系。如图所示，在使用或不使用CB-839的多西环素暴露6小时后，在两种基本条件下以及添加CCCP和抗霉素后测量OCR。直方图显示了代表3个独立实验（G）OCI-AML2细胞稳定感染GAC的数据重量或GACK320安用强力霉素或CB-839（1µM）培养6小时，并用抗GAC和抗ACTIN抗体进行western印迹分析*对< .05, **对< .01, ***对< .001.

靶向谷氨酰胺酶活性抑制AML细胞增殖

通过多西环素处理，在几种AML细胞系（OCI-AML2、MV4-11、MOLM-14、HL-60和OCI-AML3）中诱导shGLS1#5和shGLS1#7的表达（补充图3A）。打开GLS1级在所有条件下都可以观察到敲除，细胞增殖减少，OCI-AML2细胞的作用更为显著(图3A-B). 与αKG共培养可部分恢复细胞增殖(图3C). 在10种不同的AML细胞系中，化合物CB-839可降低细胞增殖(图3D)可以通过与OCI-AML2、HL-60、MOLM-14和MV4-11细胞中的αKG共培养来钝化(图3E; 补充图3B）。与增殖阻断的结果一致，我们观察到p21的积累计算机集成电路1和第27页基普1用化合物CB-839处理的2个细胞系中的蛋白质（补充图3C）。相比之下，化合物CB-839在四个不同的CD34富集HPC样品中并没有减少细胞增殖(图3F).

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靶向谷氨酰胺酶活性抑制AML细胞增殖。（A） OCI-AML2和MOLM-14 shGLS1#5白血病细胞接种于5×105加或不加强力霉素的细胞/mL；在台盼蓝染色后的第3、5和7天，人工计数活细胞。每个实验独立进行≥3次。（B） 转染shGLS1#5或#7的OCI-AML2、MV4-11、MOLM-14、HL-60和OCI-AML3细胞接种于5×105加或不加强力霉素的细胞/mL；台盼蓝染色后第3、5和7天计数活细胞。每个实验独立进行≥3次。（C） OCI-AML2和MOLM-14 shGLS1#5白血病细胞接种于5×105在第7天台盼蓝染色后，计算含或不含多西环素的细胞数/mL、αKG（5 mM）和活细胞数。（D） 共有10个细胞系以5×10接种5细胞/mL，含或不含CB-839（1µM）；台盼蓝染色后第3、5和7天计数活细胞。（E） OCI-AML2细胞接种于5×105细胞/mL，含或不含CB-839（1µM）和αKG（5 mM）；台盼蓝染色后第3、5和7天计数活细胞。（F） CD34型+来自4名健康供体的HPC以5×10的比例接种5细胞/mL（含或不含CB-839）（1µM）；在第2、3、4和5天，台盼蓝染色后计数活细胞*对< .05, **对< .01, ***对< .001.

GLS1通过调节TCA循环控制AML生存

如Annexin V染色所示，我们在5种不同的AML细胞系中观察到凋亡GLS1级敲除，尤其是OCI-AML2细胞(图4A). 与αKG共培养的细胞凋亡减少（补充图4A）。在正常CD34中+高性能混凝土，GLS1型敲低不会导致显著的细胞凋亡(图4B). 为了测试与抑制谷氨酰胺分解相关的体内抗白血病潜力，我们在注射表达shGLS1#5或对照shRNA的MOLM-14或OCI-AML3细胞系的NSG小鼠中建立了一个系统性异种移植AML模型GLS1级敲除抑制了两种细胞系中AML的生长，减少了OCI-AML2中脾肿大的发展，并显著延长了小鼠的生存期(图4C-D). 然后在11个AML细胞系中测试CB-839抑制GAC产生的抗白血病活性；化合物CB-839在其中7种细胞系中诱导凋亡(图4E). 在OCI-AML2和HL-60细胞中与αKG共培养可以完全逆转这种促凋亡活性(图4F). 同样，超活性GAC的异位表达K320安突变蛋白保留了CB-839处理的OCI-AML2细胞的细胞活力(图4G). 化合物CB-839在原发性AML样本中也诱导了细胞凋亡，但在正常CD34中没有诱导细胞凋亡+高性能混凝土(图4H). 这些发现表明GLS1抑制作用靶向白血病细胞，而非正常造血细胞。

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GLS1通过调节TCA循环来控制AML存活。（A） 用强力霉素诱导OCI-AML2、HL-60、MV4-11、MOLM-14和OCI-AML3白血病细胞中的ShGLS1#5持续4天，并根据Annexin-V结合评估凋亡。（B） CD34型+用表达不可诱导GLS1 shRNA（#5）的慢病毒载体转染3名健康供体的HPC，用嘌呤霉素筛选转染细胞2天；3天后，根据Annexin-V染色评估细胞凋亡，并用抗GAC和抗ACTIN抗体对蛋白提取物进行免疫印迹。（C） 向NSG小鼠（2×106每只老鼠的细胞数）。小鼠经口灌胃给予强力霉素。两种细胞系均显示了用强力霉素治疗的小鼠的卡普兰-迈尔生存曲线。（D） 测量注射OCI-AML2 shGLS1和OCI-AML2 shCTR细胞系小鼠的脾脏。（E） 共有11个细胞系在有或无CB-839（1µM）的情况下培养4天，并根据Annexin-V染色评估细胞凋亡。（F） OCI-AML2和HL-60细胞在加入或不加入CB-839（1µM）和dmαKG（5 mM）的情况下培养4天，并根据Annexin-V染色评估细胞凋亡。（G） 稳定感染GAC的OCI-AML2细胞重量或GACK320安加入或不加入强力霉素或CB-839（1µM）培养2天。基于膜联蛋白-V染色来评估细胞凋亡。（H） 10名患者的AML样本和CD34+来自6名健康供体的HPC在添加或不添加CB-839（1µM）的情况下培养4天。根据Annexin-V染色评估细胞凋亡*对< .05, **对< .01, ***对< .001.

GLS1抑制诱导线粒体凋亡并使白血病细胞对ABT-199启动敏感

在OCI-AML2细胞中，GLS1抑制与线粒体去极化相关，如CB-839处理和GLS1型敲低细胞(图5A，上部）。因此，GLS1阻断诱导CASPASE-8、CASPASE-3和PARP裂解(图5A，下部）。为了确定GLS1中断下游参与的促凋亡途径，我们使用了一种特异性CASPASE-8抑制剂（IETD）和泛酶抑制剂（QVD）。IETD或QVD均不能逆转化合物CB-839诱导的线粒体去极化，而CASPASE-8的断裂可被这两种抑制剂消除(图5B). QVD阻止了化合物CB-839诱导的Annexin V染色，但IETD没有阻止，排除了CASPASE-8依赖的外源性途径在CB-839诱发的细胞凋亡中的作用(图5B，右侧）。因此，我们假设线粒体启动可能增强GLS1抑制产生的抗白血病作用。我们用增加剂量的BH3模拟物ABT-199与AML细胞共培养，该模拟物能特异性抑制BCL-2，28以及CB-839。在OCI-AML2和MOLM-14细胞中，ABT-199和CB-839协同诱导Annexin V染色(图5C-D). CB-839耐药OCI-AML3细胞中Annexin V染色缺乏BH3模拟启动效应，证实了我们观察的特异性（补充图5）。总的来说，这些发现表明，谷氨酰胺水解抑制依赖于线粒体去极化和内源性CASPASE依赖性凋亡来产生抗白血病活性，并支持GLS1抑制剂和BH3模拟化合物的组合作为AML临床治疗中一种有前景的潜在药物组合。

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GLS1抑制诱导线粒体凋亡，并使白血病细胞对ABT-199启动敏感。（A） 如图所示，OCI-AML2 WT细胞或转染shGLS1#5的细胞在加入或不加入CB-839（1µM）或强力霉素的情况下培养。使用抗CASPASE-8、裂解CASPASE-3、抗PARP和抗ACTIN抗体通过western blotting评估细胞凋亡。（B） OCI-AML2细胞在有或无CB-839（1µM）和有或无CASPASE-8抑制剂（IETD）或泛酶抑制剂（QVD）的情况下培养。使用抗CASPASE-8、抗裂解CASPASE-3和抗ACTIN抗体对蛋白质提取物进行免疫印迹。用TMRE染色评价线粒体去极化，用Annexin V染色定量细胞凋亡。（C） OCI-AML2细胞在添加或不添加指定剂量的CB-839和ABT-199的情况下培养1天；根据Annexin V染色评估细胞凋亡。（D） 将MOLM-14细胞培养1天，加入或不加入指定剂量的CB-839和ABT-199；根据Annexin-V染色评估细胞凋亡。直方图显示了代表3个独立实验的数据。使用Chalice软件对比了联合用药与单一用药对广泛使用的Loewe模型的反应，该模型用于药物自身剂量相加性26并以等深线表示。*P（P）< .05, **对< .01, ***对< .001.

讨论

靶向谷氨酰胺代谢最近成为癌症治疗中一种很有前途的方法，因为它影响癌细胞的能量生成、存活和生长。29SLC1A5质膜转运体促进细胞内谷氨酰胺积累，进而通过SLC7A5氨基酸转运体增加亮氨酸摄取。这一过程对于通过Ragulator-Rag复合物激活mTORC1信号通路至关重要，Ragulator-Rag复合体将mTORC1-转移到溶酶体膜，这是氨基酸信号传递到mTORC1.的关键事件。30,31谷氨酰胺分解代谢是在GA催化的反应中将谷氨酰胺转化为谷氨酸的过程中开始的，这些反应要么将酰胺氮分子提供给生物合成途径，要么将其释放为氨。谷氨酸是GA反应的产物，是αKG的最重要来源，αKG是一种主要的TCA中间体和双加氧酶的底物，包括脯氨酰羟化酶、组蛋白脱甲基酶和TET2 5-甲基胞嘧啶羟化酶。αKG的主要功能是通过TCA循环维持OXPHOS，因此它是一种重要的能量来源。然而，谷氨酸也为谷胱甘肽的生成提供前体，有助于维持细胞的氧化状态。它也是非必需氨基酸的氨基来源，如丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丝氨酸。最后，谷氨酰胺衍生的氮是己糖胺的一种成分，用于N个-糖基化反应，并且可以起到控制核酸合成的作用。32

在急性髓性白血病中，谷氨酰胺通过氨基酸途径控制mTORC1活性，谷氨酰胺缺乏则阻碍蛋白质合成。15除mTORC1外，依赖谷氨酰胺的其他代谢途径可能是谷氨酰胺缺乏导致抗白血病活性的原因。在我们目前的报告中，我们发现AML细胞通常对谷氨酰胺上瘾，并依赖线粒体OXPHOS生存。谷氨酰胺作为TCA循环中的一个限制步骤发挥着关键作用，而TCA循环中间产物αKG在谷氨酰胺侵蚀的AML细胞中的促生存活性支持了这一点，这促使我们研究谷氨酰胺水解对AML细胞增殖和存活的影响。根据对其他类型癌症的观察，我们发现GLS1，尤其是GAC亚型，是AML细胞中最常见和最强烈表达的GA亚型。7发现AML样本中GLS1的表达水平在相同范围内，并且与正常HPC相比较，这表明与其他癌症模型相比，GLS1过度表达很可能不是白血病特征。33

目前有三种GLS1抑制剂：BPTES、化合物938和化合物CB-839。在这些化合物中，CB-839目前正用于人类实体瘤、淋巴和髓系恶性肿瘤的1期临床试验(NCT02071862号,NCT02071888号、和NCT02071927号）。化合物968是通过使用RhoGTPase转化的成纤维细胞进行小分子筛选确定的，其活性据报道是针对GAC而非KGA的。8在我们目前的研究中，化合物968对谷氨酰胺水解没有影响，因为它没有降低AML中测得的OCR或影响TCA代谢物中间体。此外，化合物968在AML细胞系中诱导了轻微的凋亡，而αKG并未对其进行挽救，这强烈表明这些功能效应与非靶向效应有关（数据未显示）。相反，BPTES和CB-839都影响TCA循环和OCR。引人注目的是，临床候选分子CB-839的促凋亡活性被αKG联合治疗和GAC的表达减弱K320安超活性突变体。我们通过药理学方法获得的这些发现，通过AML细胞系中两个不同发夹序列的GLS1敲除作用得到了证实。基于这些数据，我们得出结论，特定GLS1阻断剂，尤其是使用化合物CB-839，可以在临床前有效地根除AML细胞。

在正常造血中，新陈代谢最近已成为生存、增殖和干细胞谱系规范的关键因素。正常小鼠HSC表现出较高的糖酵解速率，这是由丙酮酸脱氢酶激酶的大量表达所支持的，该激酶抑制线粒体葡萄糖氧化，这一过程对自我更新能力至关重要。34研究还表明，缺乏糖酵解酶（如M2丙酮酸激酶或乳酸脱氢酶A）的小鼠存在造血缺陷，具有异常的祖细胞功能，在乳酸脱氢酶A敲除的情况下，HSC异常，长期重建能力受损。35谷氨酰胺代谢还调节人类HSC谱系规范，因为已证明SLC1A5谷氨酰胺转运体是通过调节从头核苷酸生物合成实现红系规范所必需的。36从GSL1靶向治疗人类的角度出发，我们研究了正常造血过程中GLS1抑制引起的潜在毒性。纯合子GLS1型由于神经系统疾病，出生后第一天的缺失是致命的。37然而GLS1级对血液形成的敲除尚未见报道。正常未成熟CD34+造血祖细胞，我们的数据显示GLS1的抑制并没有转化为细胞增殖和/或存活率的降低。此外，口服CB-839不会改变乳腺癌小鼠异种移植模型中的血细胞计数参数。24正在进行的临床试验的结果可能会证实我们在临床前分析中发现的GLS1靶向的有利治疗指标。

我们从目前的分析进一步表明，GLS1抑制诱导的凋亡触发了caspase激活，这在很大程度上涉及固有的线粒体凋亡途径。虽然导致GLS1断裂导致线粒体膜去极化的分子机制尚不完全明确，但这种半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活模式可能提示新的治疗组合。事实上，BH3模拟化合物，如ABT-199或ABT-737，专门作用于BCL-2，并通过激活Bak/Bax二聚体的形成导致随后的细胞组C释放和线粒体凋亡。38在原代AML白血病干细胞中，BCL-2的高表达主要支持OXPHOS代谢，并与该细胞室中对BCL-2抑制的高敏感性相关。18我们目前关于BCL-2（使用ABT-199）和GLS1（使用CB-839）联合抑制的协同抗白血病活性的研究结果为在临床试验中测试该策略提供了可能性。

总之，AML细胞对谷氨酰胺分解抑制具有独特的敏感性，这是由于持续抑制TCA循环和OXPHOS活性所致。我们对GLS1抑制下游细胞凋亡的分子机制的分析也为GLS1和BCL-2抑制剂的联合协同作用提供了分子基础，这可能代表一种新的AML治疗策略。

致谢

作者感谢Andre L.B.Ambrosio博士提供pcDNA hGAC WT和K320A质粒，并感谢Virginie Penard-Lacronique博士的合作。

这项工作得到了国家癌症研究所（Projet Recherche Translationnelle TRANSLA13-087 to N.J.）和国家癌症法律研究所（Equipe Labellisée EL2014）的资助。项目编号：R14077KK）。

脚注

本文的在线版本包含数据补充。

有一个内部血液评论在本期文章中。

这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节，本文特此标记为“广告”。

作者

贡献：N.J.进行了实验，分析了数据，并撰写了手稿；A.M.R.、C.L.、G.M.、R.B.、E.S.、L.W.、J.D.、L.P.、M.A.H.、P.S.、LJ.和C.R.进行实验；T.T.M.、I.C.M.、J.E.S.和C.R.进行体内实验；M.L.帮助设计了分子结构；N.C.对原发性AML样本进行细胞学和流式细胞术分析；C.L.和P.M.写了手稿；S.D.提供了CB-839化合物和分析数据；J.T.分析数据并撰写手稿；D.B.设计并监督研究项目，分析数据，撰写手稿；所有作者都批准了手稿的最终版本。

利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。

通讯地址：法国巴黎AP-HP圣雅克郊区街27号Hópital Cochin酒店服务部Didier Bougrable，邮编：75014；电子邮件：rf.phpa.hcc@yracsuob.reidid邮箱.

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文章来自血液由以下人员提供美国血液学会