脑卒中自发性高血压大鼠巨噬细胞耗竭后大脑中动脉结构和内皮功能的改善

血压测量

如前所述，使用RTBP1001尾切血压系统（Kent Scientific，Torrington CT）通过尾切测量血压(34).

流式细胞术

使用流式细胞仪对PBS脂质和CLOD处理的SHRSP中的循环和腹腔吞噬细胞进行定量。在肝素化管中从腹主动脉采集血液，并使用Z1 Coulter粒子计数器（加利福尼亚州Fullerton Beckman Coulter）定量血白细胞总数。含有1×10的等分样品⁶用ACK缓冲液培养细胞5分钟（单位：克/升：NH₄第8.024条，韩国可可_三1.001、EDTA 0.0037）在室温下用于红细胞裂解。然后用FCM缓冲液（含1%牛血清白蛋白（BSA）和0.1%叠氮化钠的Hank’s平衡盐溶液）清洗细胞三次，并用Fc块（加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences）在冰上培养20分钟。然后将细胞与FITC-偶联抗CD11b和藻红蛋白偶联抗CD163（英国牛津ABD-Serotec）在冰上培养20分钟。通过在未染色细胞上使用抗Fc受体抗体阻断所有细胞中的Fc受体来评估非特异性染色。细胞在FCM缓冲液中清洗两次并用BD Cytofix（BD Biosciences，San Diego，CA）固定，用FCM缓冲溶液清洗两次，使用BD FACSCanto II结合FACSDiva软件（BD bioscience）收集50000个事件，并使用FlowJo 8.8.6（Treestar software，Ashland，OR）进行分析。使用Fc阻断的非染色细胞设置门控。采用上述相同方案处理通过腹腔灌洗获得的细胞。

免疫荧光

使用灌流固定大鼠大脑（10µm厚）的冷冻切片进行CD163（巨噬细胞标记物）和α-SMA的IF鉴定。用戊巴比妥钠麻醉大鼠，暴露胸腔，用0.9%氯化钠溶液（生理盐水）和肝素（1000UI/mL）和罂粟碱（10⁻⁵mol/L）注入左心室，洗血扩张血管。右心房穿刺后，血液+盐水被洗掉。灌注压力维持在80mmHg，250ml生理盐水冲洗大鼠。之后，灌注250 ml 4%多聚甲醛。然后取出大脑，置于4%多聚甲醛中48小时，在PBS中清洗，并置于20%蔗糖-PBS中进行冷冻切片。用CD163（英国牛津ABD Serotec）和α-SMA（马萨诸塞州剑桥Abcam）的一级抗体培养切片过夜，然后用荧光标记的二级抗体培养。然后将切片安装在具有DAPI的ProLong Gold抗褪色试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）中。使用Axioskop 40（墨西哥卡尔蔡司公司）和相机（AxioCam MRc5，卡尔蔡斯公司）进行图像采集，并使用AxioVision Rel.4.6软件计算6个显微视野中血管周围CD163阳性细胞的数量。没有主要抗体的切片为阴性对照。一名对实验组盲的研究人员进行了细胞计数。数据表示为每个显微视野中血管周围CD163阳性细胞的数量。

软脑膜动脉形态计量学

对灌注固定大鼠的脑组织切片（10µm厚）进行血纤-伊红染色，以对软脑膜小动脉进行形态计量分析。如上所述采集图像。由一名对实验组不知情的研究人员使用校准的AxioVision Rel.4.6软件测量软脑膜小动脉的横截面积。横截面积测量仅包括动脉内膜和中层。每只动物共测量5条小动脉，并对每只动物的数据进行平均。数据表示为平均横截面积。

定量实时聚合酶链反应

使用RNeasy从大脑皮层和PVAT中提取mRNA^®脂质组织试剂盒（QIAGEN），来自CBV，使用TRIZOL试剂。mRNA被逆转录（上标^®VILO™、Invitrogen、Carlsbad、CA）和qRT-PCR使用Taqman进行^®7500实时PCR系统（应用生物系统）中的探针。使用2计算对照组的折叠变化^-ΔΔCT方法(25). CBV mRNA表达归一化为2-β微球蛋白mRNA表达；RP132用于大脑皮层和PVAT mRNA。

压力肌电图

如上所述，通过压力肌描记术（丹麦奥胡斯Myo Technology公司）评估MCA结构(35). MCA对5-HT的收缩性（10⁻¹⁰–10⁻⁵mol/L）和内皮依赖性舒张对ADP腔内灌注的影响（10⁻⁹到10⁻⁵mol/L）。MCA在含氧生理盐溶液（PSS，单位：mmol:141.9 NaCl，4.7 KCl，1.12 KH）中平衡₂人事军官₄，1.7硫酸镁₄'7小时₂O、 2.8氯化钙₂，10 Hepes，5葡萄糖，0.5 EDTA，pH 7.4），直到形成自发肌源性张力，使用以下公式计算：%tone=[1-（主动管腔直径/被动管腔直径）]×100。用含2mmol/L EGTA和10的无钙PSS评估MCA的被动结构⁻⁵以20mmHg为增量，SNP和腔内压的摩尔/升从3 mmHg增加到180mmHg。计算了壁腔比、周向壁应力和壁应变(三). 如前所述计算被动膨胀性(5). 使用指数模型（y=ae）根据应力/应变曲线计算弹性模量（β系数^βx)其中β是曲线的斜率：β系数越高，容器越硬。

导线肌电图

使用钢丝肌电图仪（丹麦奥胡斯，丹麦Myo Technology）进一步评估MCA内皮功能。分离并清洁MCA，并使用40µm厚的不锈钢丝将2mm环安装到钢丝肌电图仪中。允许MCA在37°C的含氧PSS中平衡30 min，无张力，然后以0.5mN的增量增加至2mN，平衡时间为10 min。在2mN下稳定后，通过将环暴露于10⁻⁶mol/L 5-HT，内皮完整性通过10⁻⁶摩尔/升Ach。清洗戒指并用10⁻⁶mol/L 5-HT建立Ach（10）浓度响应曲线⁻¹⁰至3×10⁻⁵mol/L）±eNOS抑制剂L-NAME，10⁻⁵mol/L和NO供体SNP（10⁻¹⁰至3×10⁻⁵摩尔/升）。用100mmol/L KCl冲洗环并收缩，以分析激动剂非依赖性收缩。数据表示为KCl收缩百分比。

肠系膜阻力动脉结构

在完成MCA实验后，分离肠系膜血管床的三级分支，并将其储存在冰镇PSS上，以安装在压力肌电图仪上。被动结构的评估如上所述，但腔内压力以30mmHg的增量增加。

CLOD治疗的SHRSP的循环巨噬细胞和腹腔巨噬细胞较少

用流式细胞术评估外周巨噬细胞耗竭。在CLOD治疗的大鼠中，CD11b和CD163双重阳性的循环巨噬细胞数量减少（0.28±0.03 vs 1.19±0.34%总细胞，CLOD（n=3）vs SHRSP（n=4），p=0.04）。同样，SHRSP+CLOD患者腹腔灌洗液中的巨噬细胞数量减少(图2).

在单独的窗口中打开

图2

对PBS脂质或CLOD处理的SHRSP中巨噬细胞进行代表性FCM定量分析。上图表示对血液中CD11b和CD163双重阳性的循环吞噬细胞的分析。注意，用PBS lipo（左上面板）治疗的SHRSP的事件数高于用CLOD（右上面板）处理的SHRSP-。腹腔内巨噬细胞的数量也通过FCM（下部面板）进行量化。细胞群通过侧向散射和正向散射进行分离。注意，CLOD治疗的SHRSP（右下面板）的事件数小于PBS脂肪治疗的SHRS（左下面板）。

CLOD治疗降低了大脑皮层血管周围CD163阳性细胞的数量

为了验证循环吞噬细胞的耗竭会导致脑血管周围吞噬细胞的减少，通过IF评估SHRSP大脑皮层血管周围CD163阳性细胞的数量。CLOD治疗降低了SHRSP脑皮层每个显微视野中血管周围CD161阳性细胞数量，与PBS脂类治疗的SHRSP相比(图3).

在单独的窗口中打开

图3

SHRSP脑血管内血管周围巨噬细胞的免疫荧光（IF）染色。巨噬细胞被鉴定为对CD163（红色）具有免疫反应性的细胞，仅对血管周围的CD163阳性细胞（通过α-SMA免疫反应性鉴定，绿色）进行计数。通过DAPI染色（蓝色）鉴定细胞核。上面板是经PBS脂类治疗的SHRSP的代表性图像，下面板是经CLOD治疗的SHRS的图像。条形图：IF的量化。CLOD导致SHRSP血管周围CD163阳性细胞显著减少。*p<0.05，Student t检验。

CLOD治疗的SHRSP患者软脑膜小动脉横截面积增加

软脑膜小动脉的形态计量学分析显示，与PBS脂质治疗的SHRSP相比，CLOD治疗增加了其横截面积(图4A，p=0.05）。流明略有增加，但并不显著(图4B（p=0.14）和壁横截面（4C，p=0.12）。

在单独的窗口中打开

图4

软脑膜小动脉的形态分析。与PBS脂质治疗的SHRSP相比，CLOD治疗导致SHRSP（a）软脑膜小动脉横截面积显著增加。CLOD治疗6周后，管腔（B，p=0.14）和管壁（C，p=0.12）的横截面积略有增加，但并不显著。（D） PBS脂类（左）和CLOD（右）治疗的SHRSP软脑膜小动脉的代表性图像。圆形区域代表小动脉的横截面积。棒材=25µm。对来自灌注固定大鼠的10µm厚的脑切片进行形态计量学测量。由一名对实验组不知情的研究人员使用校准软件，通过40倍客观和横截面积测量获得图像。数据为平均值±SEM。*p=0.05，学生t检验。

CLOD治疗降低了大脑皮层和CBV中CD68和TNF-αmRNA的表达

CLOD治疗降低了大脑皮层中CD68 mRNA的表达（1.06±0.12 vs.0.78±0.10，PBS lipo vs.CLOD，p<0.05），但CBV中没有降低（1.00±0.03 vs.1.06±0.1，PBS lipo vs CLOD）。此外，大脑皮层中TNF-αmRNA的表达降低（1.04±0.10 vs.0.76±0.07，PBS lipo vs.CLOD，p=0.02）和CBV（1.02±0.09 vs.0.82±0.05，PBS lipo vs CLOD（p=0.03））。

CLOD没有改变MCA的收缩力、肌生成张力和肌生成反应性

外周吞噬细胞耗竭并没有改变MCA的自发肌源性张力(表1)以及对收缩剂5-HT的反应(图5).

在单独的窗口中打开

图5

CLOD处理不会改变MCA对收缩剂5-HT的反应性。通过在组织浴中增加5-HT浓度来评估MCA对激动剂诱导的收缩反应的能力。CLOD治疗并没有改变5-HT的浓度-反应曲线，如最大反应百分比（A）或与基线相比的管腔直径变化（B）。将MCA维持在温暖（37°C）、含氧PSS、80 mmHg腔内压力下，并使其平衡10分钟，然后进行测量，并添加下一剂量的5-HT。数据为平均值±SEM。

CLOD治疗改善MCA的内皮依赖性舒张功能

外周吞噬细胞耗竭改善了内皮依赖性MCA扩张至ADP腔内灌注(图6). CLOD治疗导致ADP浓度-反应曲线向上和向左移动，并增加MCA对该药物的最大扩张。然而，logEC50未因治疗而改变（−7.02±0.29 vs.−6.54±0.27 mol/L，PBS lipo vs.CLOD）。通过在钢丝肌电图仪中培养MCA环和Ach，无论有无L-NAME，进一步证实了内皮功能的改善。CLOD治疗的SHRSP的MCA环显示Ach介导的扩张改善，与L-NAME孵育后消失(图7A). 不同治疗组对SNP的内皮非依赖性扩张没有差异(图7B). 乙酰胆碱舒张功能的改善并不是5-HT收缩力降低的结果（%KCl收缩：114±4 vs 111±4，PBS脂肪vs CLOD）。尽管Ach的最大扩张有所改善，但其logEC50没有改变（−9.61±0.18 vs−9.47±0.16 mol/L，PBS lipo vs CLOD）。

在单独的窗口中打开

图6

CLOD治疗改善了MCA对ADP的内皮依赖性舒张。CLOD治疗增加了MCA的原始扩张，观察到与基线相比的直径变化（a）和被动直径百分比（B）*p<0.01，双向方差分析。数值为平均值±SEM。MCA安装在压力肌电图仪上，并保存在80 mmHg腔内压力和生理流量下的含氧温热PSS中。在腔内灌注液中加入ADP。

在单独的窗口中打开

图7

CLOD治疗改善了MCA对Ach的扩张。将MCA环（2 mm）安装在钢丝肌电图仪上，并用10–6 mol/L 5-羟色胺预收缩（5-HT，%KCl收缩：114±4 vs.111±4，PBS脂质vs.CLOD）。构建了在没有或存在NOS抑制剂l-NAME的情况下，Ach的浓度响应曲线。CLOD处理后，SHRSP中MCA对Ach的舒张作用得到改善，并且这种作用通过用l-NAME（10–5 mol/l，A）预培养MCA环来减弱。MCA对内皮非依赖性血管舒张剂SNP的反应在各组之间没有差异（B）*p<0.05，PBS lipo vs.CLOD，双向方差分析。数值为平均值±SEM。

CLOD处理改善了MCA无源结构

外周巨噬细胞耗竭导致MCA管腔直径增加11%(图8A). 内腔横截面积（CSA）增加(表1)，不改变外径(图8B)和容器CSA。壁厚(图8C)，壁CSA(表1)和壁腔比(图8D)CLOD治疗后下降。血管应力增加，但不改变应变、刚度和膨胀性。β系数未发现差异(表1). 重要的是，与未经治疗的SHRSP相比，PBS脂类对SHRSP的MCA结构没有影响（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图8

外周吞噬细胞耗竭改善了SHRSP的MCA被动结构。CLOD治疗增加了管腔直径（A），降低了壁厚（C）和壁腔比（D），但未改变外径（B）*p<0.05，PBS lipo vs.CLOD，双向方差分析。数值为平均值±SEM。将MCA安装在压力肌电图仪中，并在无流量条件下保存在补充有2 mM EGTA和10µM的含氧温热无钙PSS中。

CLOD治疗没有改变MRA结构

外周吞噬细胞耗竭不能阻止SHRSP的MRA重塑(图9A-D和表1).

在单独的窗口中打开

图9

外周吞噬细胞耗竭并没有改善SHRSP的MRA被动结构（p>0.05，PBS与CLOD，ANOVA）。CLOD治疗未改变管腔（A）和外径（B）。在较高的腔内压力下，壁厚（C）和壁腔比（D）略有下降，但无显著意义。数值为平均值±SEM。MRA安装在压力肌电图仪上，并保存在补充有2 mM EGTA和10µM硝普钠的含氧温热无钙PSS中，并在无流量条件下保存。

作者感谢Robert Crawford先生对流式细胞仪分析的技术帮助。

支持：美国国立卫生研究院（HL077385 to AMD，DA007908，DA020402 to NEK）和美国心脏协会（0840122N:AMD，12PRE8960019:PWP）。