内皮素受体A拮抗剂减轻糖尿病小鼠视网膜血管和神经视网膜病变

摘要

介绍

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病继发的微血管疾病的长期表现，10年后影响80%的糖尿病患者。¹它是美国工龄人群致盲的主要原因，也是全球第五大致盲原因。^2，三

周细胞丢失是DR的第一个细胞标志，突出了这些细胞在DR发病中的重要作用。⁴周细胞是包裹在血管基底膜内的壁细胞，与血管内皮细胞共享。它们通过调节血管修复来维持血管系统，⁵同时建立并维持与内皮细胞协同作用的内血-视网膜屏障。⁶视网膜是体内代谢需求最高的细胞之一，周细胞作为缺氧传感器，支持视网膜的代谢功能。⁷为了维持这些重要功能，视网膜与大脑相似，周细胞与内皮细胞在体内的比例最高。⁵尽管其重要性，但早期DR周细胞丢失的病理生理学仍不明确。⁸了解周细胞丢失的机制对于提高我们对DR早期变化发病机制的理解至关重要。

DR的另一个早期发现是内皮素-1升高^9，10据报道，2型糖尿病患者血浆内皮素水平与微血管病变程度呈正相关。^9，10内皮素-1是体内最有效的血管收缩剂之一¹¹; 它的作用是通过两个受体介导的，即ET_A类和ET_B类都存在于视网膜周细胞中。¹²尽管ET_A类对内皮素-1，ET有选择性亲和力_B类对内皮素的所有亚型都具有相同的亲和力，存在于周细胞和内皮细胞以及视网膜神经和胶质细胞上。¹³电子技师_A类受体已被证明在介导早期DR中所见的视网膜血流减少中发挥重要作用，¹⁴ET的反映_A类受体在血管收缩、纤维化和通过蛋白激酶C（PKC）增加细胞外基质以及增加细胞内钙中的作用。¹⁵

内皮素-1在糖尿病中的重要作用激发了人们对探索ET疗效的兴趣_A类受体拮抗剂治疗糖尿病各种并发症，尤其是肾病。^16——18内皮素-1在糖尿病肾病足细胞破坏中发挥作用，主要通过内皮素_A类受体，最终导致蛋白尿。^19，20肾小球足细胞具有与眼周细胞相似的特征，因为内皮素-1参与各种周细胞功能，包括收缩，²¹在这项研究中，我们试图探索一种假说，即周细胞丢失可以通过特异性ET来预防_A类受体阻断。因此，我们研究了选择性ET阻断剂阿特拉森坦的作用_A类受体，在2型糖尿病动物模型db/db小鼠的视网膜血管和神经视网膜病理学上。这项研究首次显示了ET的显著益处_A类阻滞剂对DR鼠模型周细胞丢失的影响。毛细血管闭塞和视网膜神经变薄也得到改善。这些发现扩大了我们对内皮素-1在DR发病机制中作用的认识，并确定了内皮素-1_A类受体作为潜在的治疗靶点。

方法

内皮细胞/周细胞比率、毛细管细胞密度和无细胞毛细管的定量

内皮细胞和周细胞根据特征形态学特征进行鉴定。内皮细胞核伸长，沿毛细血管轴线位于血管壁内，周细胞细胞核呈球形，染色浓密，通常在毛细血管壁上有突起位置(图1a） ●●●●。²⁴

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图1

胰蛋白酶消化（×600）和E/P比率。(一)H&E染色的对照db/m小鼠视网膜的胰蛋白酶消化物。内皮细胞(白色箭头)和周细胞(黑色箭头)突出显示。(b条)与db/m相比，db/db在统计学上增加了E/P比率(*P（P）< 0.001). 阿特拉森坦治疗的db/db能够使未治疗db/db的E/P比率显著正常化（†P（P）< 0.001).

在放大×60倍的显微镜下对血管细胞进行计数。显微镜的一个目镜中放置了一个方形十字线，以便于计数。内皮细胞/周细胞（E/P）比率按照Midena等人的描述进行计算。²⁵对于每个血管消化物，共计数200个细胞，并记录内皮细胞和周细胞的数量。为了评估毛细血管中的细胞密度，我们记录了在视网膜中部×60处计数50个内皮细胞和周细胞所需的十字线方块数。²⁵为了进行组间比较，将结果标准化为db/m对照中的细胞数。

无细胞毛细血管被定义为全长无细胞核的毛细血管(图2a） ，如前所述。²⁶简而言之，毛细管直径必须至少为相邻毛细管直径的20%才能被视为无细胞结构，而较窄的结构则被视为消化物的链或伪制品，因此被排除在外。在每只眼睛的中层视网膜周围随机选择五个视野（1.25mm²每视野视网膜面积×40）。

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图2

胰蛋白酶消化和脱细胞毛细血管（每五个视网膜区域，×400）。(一)db/db视网膜的胰蛋白酶消化显示无细胞毛细血管(红箭; ×400). (b条)与两种db/m相比，未处理的db/db在无细胞毛细血管中有统计学意义的增加(*P（P）<0.001）和阿特拉森坦处理的db/db小鼠（†P（P）< 0.001).

两名独立的观察者被蒙蔽在治疗任务中，测量了每五个高功率场的E/P比率、血管细胞密度和无细胞毛细血管。为了进行统计比较，我们使用了两位观察者获得的测量值的平均值。

结果

毛细血管细胞密度和E/P比

db/db小鼠的E/P比显著高于db/m对照组（分别为6.63±0.41 vs.3.73±0.28，P（P）< 0.001;图1b） ●●●●。相反，阿特拉森坦处理的db/db小鼠的E/P比率与db/m对照组没有显著差异（分别为4.35±0.19和3.73±0.28，P（P）=0.09）。与db/m小鼠相比，db/db小鼠的周细胞丢失和/或内皮细胞增加可以从理论上解释这些发现。因此，我们还评估了毛细血管细胞密度，以确定阿特拉森坦治疗的db/db眼中E/P比值正常化是否是由于周细胞存活率提高或内皮细胞丢失增加所致(图3)。四组之间的内皮细胞计数没有显示出显著差异。我们将周细胞密度归一化为db/m对照组，发现db/db小鼠周细胞密度与db/m控制组相比在统计学上有所降低（分别为29.2±0.4和50.0±1.3，P（P）< 0.001;表1)。相反，与未经阿特拉森坦治疗的db/db小鼠相比，阿特拉森坦治疗的小鼠周细胞密度显著增加（分别为44.4±2.0和29.2±0.4），P（P）< 0.001). 总的来说，阿特拉森坦治疗的db/db与db/m组的周细胞密度没有显著差异（分别为44.4±2.0和50.0±1.3，P（P）= 0.06). 在阿特拉森坦处理的db/db小鼠和db/m对照组之间，这些参数没有发现显著差异（参见表1).

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图3

毛细管细胞密度（×600）。将图形归一化为以db/m为单位计算50个内皮细胞和50个周细胞所需的十字线数量，以便更好地表示。(一)各组间内皮细胞密度无差异。(b条)与db/m和db/m相比，未处理的db/db周细胞减少，具有统计学意义(*P（P）<0.001）和阿特拉森坦处理的db/db小鼠（†P（P）< 0.001).

TUNEL和α-SMA在db/db眼睛中的颜色化

为了进一步证实db/db小鼠E/P比率增加是由于周细胞丢失所致，我们对每组三个单独的视网膜切片进行了TUNEL分析和α-SMA免疫染色。TUNEL分析和α-SMA在db/db眼视网膜血管中的共定位(图4d–f），这一发现在db/m对照组或阿特拉森坦处理的db/db小鼠中均未见(图4a–c、g–i）。

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图4

TUNEL结肠化（凋亡，绿色)和α-SMA（周细胞，红色)仅在未经治疗的db/db中可见眼部血管系统(d日——（f）) (箭头)。在db/m中未发现共定位(一——c（c）)或阿特拉森坦处理的db/db小鼠(克——我)。切片用DAPI（细胞核，蓝色;n个=每组3人）。

视网膜厚度：阿特拉斯坦钠治疗改善db/db小鼠的视网膜厚度

视网膜亚层的平均厚度如图所示(表2)。在视神经附近，与db/m眼相比，未经治疗的db/db眼的视网膜内亚层减少，但没有达到统计学意义(图5a、 5c）。阿特拉森坦治疗的db/db眼与未治疗的db/db眼相比，显示出改善视网膜内厚度的趋势(图5c） ●●●●。在周边，与db/m组相比，未治疗db/db组的所有视网膜亚层均减少，视网膜内亚层达到统计学意义(图5b、 5d）。阿特拉森坦治疗的db/db与未治疗的db/db相比，视网膜内厚度有所改善；内核层差异达到统计学意义（46.1±2.8vs.37.8±3.6，P（P）< 0.05).

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图5

视神经附近视网膜的组织切片(一)和外围(b条)：神经纤维层/神经节细胞层（NFL/GCL）、内丛状层（IPL）、内核层（INL）、外丛状层、外核层（ONL）、感光层（PR）。(c（c）)视网膜亚层厚度(中心的)：三组之间没有差异(n个=每组3人）。(d日)视网膜亚层厚度(外围设备): (n个=3分贝/米；n个=3阿特拉森坦处理的db/db；n个=5未处理db/db）。

*NFL/GCL在db/m和未经处理的db/db小鼠之间存在显著差异(P（P）<0.05），IPL(P（P）<0.03），印度(P（P）<0.03）和OPL厚度(P（P）< 0.04).

†阿特拉森坦处理的db/db小鼠和未处理的db/db小鼠的INL厚度存在显著差异(P（P）< 0.02).

阿特拉森坦处理的db/db和db/m小鼠的INL厚度存在显著差异(P（P）< 0.05).

表2

视网膜厚度（像素）

	NFL/GCL	IPL公司	印度卢比	口服避孕药	ONL公司	公共关系
近视神经
分贝/米，n个= 3	78.1 ± 2.5	121.6 ± 13.5	71.7±2.7	31.6 ± 5.5	81.6 ± 14.5	60.5 ± 6.2
数据库/数据库，n个= 3	61.4 ± 12.4	99.4 ± 19.3	61.3 ± 5.5	24.9 ± 0.53	77.6±8.58	63.4 ± 9.2
db/db，阿特拉森坦，n个= 3	73.6 ± 1.9	114.4 ± 3.0	70.4 ± 5.6	35.2 ± 2.1	94.0 ± 13.6	82.4 ± 18.4
靠近外围
分贝/米，n个= 3	36.6 ± 4.0*	86.1 ± 8.6*	65.6 ± 5.4*	35.8 ± 2.2*	78.2 ± 10.5	74.7 ± 8.3
数据库/数据库，n个= 35	21.9 ± 2.0	51.1 ± 5.2	37.8 ± 3.6†	27.4 ± 1.7	64.8±4.8	56.2 ± 4.3
db/db，阿特拉森坦，n个= 3	24.8 ± 2.6	69.1 ± 10.2	46.1 ± 2.8‡	29.8±1.8	65.4 ± 4.3	58.7 ± 1.8

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一个像素相当于0.54μm。INL，内核层；IPL，内丛状层；NFL/GCL、神经纤维层/神经节细胞层；ONL，外核层；OPL，外丛状层；PR，感光层。

^*在NFL/GCL中，db/m和未经处理的db/db小鼠之间存在显著差异(P（P）<0.05），IPL(P（P）<0.03），印度(P（P）<0.03），OPL(P（P）< 0.04).

^†阿特拉森坦处理的db/db小鼠和未处理的db/db小鼠在INL中存在显著差异(P（P）< 0.05).

^‡阿特拉森坦处理的db/db和db/m小鼠在INL中存在显著差异(P（P）< 0.05).

在未治疗的db/db中可以看到视网膜内部的中央和外周凋亡，但在阿特拉森坦治疗的db.db中只能看到外周凋亡

为了评估db/db小鼠视网膜厚度降低是否与细胞凋亡增加有关，我们对每组的三个视网膜切片进行了TUNEL分析。在视神经附近，未经治疗的db/db眼显示视网膜内凋亡(图6c、，​c、 6d）；6d） ；这在atrasentan处理的db/db中没有发现(图6a、，​a、 6b、，6b、，​b、 6e、，6e、，​e、 6f）。6f） ●●●●。在外围，我们观察到未经治疗和阿特拉森坦治疗的db/db组的视网膜内部凋亡，这表明视网膜变薄是细胞凋亡的继发因素(图6i–l）。此外，未经处理的db/db在外核层也表现出轻微的凋亡。对照db/m小鼠未发现凋亡(图6g中，​g、 6小时）。6h） ●●●●。这些数据结合视网膜厚度分析表明，阿特拉森坦能够改善db/db小鼠的视网膜厚度，但不能完全消除周围视网膜的细胞凋亡。

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图6

TUNEL分析（DAPI复染）。视网膜切片×200。中央视网膜(一——（f）)。无TUNEL阳性区域（单位：db/m）(一，b条)或阿特拉森坦处理的db/db小鼠([e（电子），（f）]; 插入2）。未经治疗的db/db小鼠的视网膜内TUNEL阳性，主要是GCL([c（c），d日]; 插入1和箭头)。外周视网膜(克——我)。未经治疗的db/db小鼠的所有核层（GCL、INL、ONL）TUNEL阳性，但阿特拉森坦治疗的db/db小鼠的主要是GCL/INL和GCL/INL（见插入物2和3以及箭头; [我——我]; *工件）。db/m小鼠中无TUNEL阳性区域([克，小时];n个=每组3人）。

讨论

本研究使用肥胖db/db小鼠（一种已建立的2型糖尿病动物模型）来检测ET的作用_A类受体阻断DR的血管和神经视网膜方面。与之前的研究类似，我们发现与db/m小鼠相比，db/db小鼠的E/P比率和脱细胞毛细血管增加。²⁵我们发现选择性阻断ET_A类受体使用阿特拉森坦8周后，可使E/P比值正常化，改善血管网络完整性，并减少db/db小鼠的脱细胞毛细血管。此外，阿特拉森坦治疗的db/db眼显示出周边视网膜厚度的显著改善，以及中枢和周边神经视网膜凋亡的改善。总的来说，这些结果表明特定ET具有保护作用_A类DR动物模型中的受体拮抗剂。

E/P比率通常被用作反映周细胞相对于内皮细胞的变化的一种方便方法，尽管这两种细胞类型都可能受到内皮素-1过量和/或内皮素阻断的影响_A类受体。我们想探讨阿特拉森坦治疗是否通过改善周细胞存活率或内皮细胞丢失而导致E/P比值正常化。我们对毛细血管细胞密度的评估显示，各组间周细胞密度而非内皮细胞密度存在差异(图3)。免疫组织化学显示，未经治疗的db/db眼的血管系统中，凋亡标记TUNEL和周细胞标记α-SMA共定位，反映周细胞凋亡，这一发现在对照db/m或阿特拉森坦治疗的db/db眼中未见(图4)。E/P比、周细胞密度和无细胞毛细血管的改善表明阿特拉森坦对视网膜周细胞的存活起到保护作用。肾脏也有类似的作用，其中ET_A类在啮齿动物模型中，受体拮抗剂已被证明可以改善肾功能，防止足细胞细胞骨架的破坏，并显著减少蛋白尿¹⁹在人类身上。²⁹

尽管内皮素-1与DR周细胞丢失没有直接关系，但几条证据支持这种可能性。在血糖正常的环境中，内皮素-1对周细胞有丝分裂作用。³⁰核因子（NF）-κβ类似于内皮素-1，在正常血糖状态下支持周细胞存活，但在高血糖环境下激活时，NF-κ。³¹因此，可以推断内皮素-1在高血糖环境中可能具有类似的功能逆转。事实上，已经证明糖尿病患者周细胞有丝分裂活性降低。³²这表明在高血糖病理条件下，内皮素-1诱导ET的激活_A类受体可能具有减少有丝分裂的作用，或者可能有利于周细胞丢失的功能改变。

内皮素-1水平升高与周细胞损失之间的另一个潜在联系是蛋白激酶PKC-δ，它在糖尿病中上调，并已被证明在糖尿病小鼠的周细胞凋亡中发挥重要作用。³³PKC-δ及其下游靶点p38αMAPK激活了两条参与高血糖环境中周细胞凋亡的独立途径：活性氧增加导致NF-κβ活化，SHP-1激活导致PDGFR-β失活。³³研究进一步表明，在高血糖状态下，PKC-δ和PKC-β是视网膜血管细胞内皮素-1增加的主要介质。³⁴此外，内皮细胞培养实验表明，内皮素-1可以直接诱导PKC-δ移位，导致内皮素-1活性进一步增加，可能通过内皮素-1_A类受体，可能造成恶性循环。^35，36因此，有理由认为，这些途径在DR中可能被激活，内皮素-1的增加刺激PKC-δ活性并随后导致视网膜周细胞死亡。

内皮素-1通过内皮细胞和周细胞之间的旁分泌信号在维持血流动力学环境中的血管系统中发挥重要作用。³⁷在细胞培养模型中，高流量环境对内皮细胞具有促生存作用，同时增加周细胞凋亡。双内皮素受体拮抗剂的使用降低了内皮细胞的促生存作用，并减少周细胞凋亡。³⁷事实上，ET_A类受体主要存在于周细胞上，并参与调节PKC-δ活性，这表明过度的ET_A类高血糖环境下受体的激活可能与周细胞凋亡有关。类似地，通过选择性ET抑制这些分子途径_A类受体阻滞剂可以解释周细胞存活率提高的原因，我们的研究表明，E/P比率提高，脱细胞毛细血管减少。我们通过TUNEL免疫组织化学双重染色进一步证实了这一对周细胞的保护作用，显示TUNEL和α-SMA在db/db血管系统中共定位，这一发现被阿特拉森坦所消除(图4).

我们的研究表明，糖尿病db/db小鼠的外周视网膜可能更容易发生DR的病理改变。我们观察到，与中央视网膜相比，未经治疗的db/db鼠外周视网膜亚层的凋亡和变薄更为显著，这表明视网膜外周可能在早期更易发生DR。此外，阿特拉森坦治疗能够减少视网膜两个区域的细胞凋亡和视网膜变薄，但对视网膜厚度的保护作用仅在周边视网膜达到统计意义，这可能是因为细胞凋亡的严重程度相对较高。外周视网膜敏感性的增加也在Ins2中显示^秋田小鼠，糖尿病22周后，内丛状层中央减少16.7%，而外周减少27%。³⁸我们还发现未经治疗的db/db周围的外核层有轻微的凋亡，这表明随着时间的推移，外视网膜可能有视网膜变薄的风险。在链脲佐菌素诱导的小鼠和大鼠的纵向研究中也观察到了这一点。^39，40

在其他糖尿病动物模型中，如链脲佐菌素诱导的大鼠（在诱导后7.5个月观察到）和Ins2中，也有报道称视网膜内部变薄^秋田22周龄的小鼠。^38，41类似地，2型糖尿病患者的视网膜变薄，随着时间的推移，他们的视网膜内部变薄。⁴²在我们的研究中，我们通过TUNEL分析证实视网膜变薄是由于细胞凋亡所致(图6)。虽然先前的研究主要关注视神经附近的视网膜厚度，但我们的研究表明，在比较中央和周边视网膜时，神经视网膜变化的时间线可能是不同的。通过比较不同动物模型的中央和周边视网膜厚度，未来研究DR中的视网膜变化可能有助于阐明神经视网膜损害的过程。

尽管有几种可能的机制，但DR中神经视网膜变薄的确切病理生理学仍不清楚。毛细血管闭合、周细胞丢失和内皮素-1诱导的血管收缩导致视网膜血流量减少，可导致缺血和相对的视网膜内损害。虽然血流量减少可能会通过缺血导致神经视网膜变薄，但也可能涉及非血管代谢途径。研究表明，神经视网膜功能在血管损伤发生之前就受到损害，神经视网膜缺陷在DR中可能与血管缺陷同样重要。^43，44内皮素-1对神经存活有不利影响，糖尿病BB/W大鼠的感光细胞、内核层和神经节细胞中内皮素-1免疫反应增强。⁴⁵内皮素-1也与星形胶质细胞增生密切相关，星形胶质细胞增生是一个导致毒性介质释放并最终导致神经元死亡的过程。^46，47先前的研究表明，内皮素-1增强了谷氨酸诱导的无长突细胞死亡，无长突上皮细胞也能释放内皮素-1，从而可能影响邻近的水平细胞和双极细胞。⁴⁸在培养的大鼠视网膜神经元中，已显示ET_A类受体拮抗剂可以抑制内皮素-1引起的视网膜毒性。⁴⁸这些研究支持了我们的发现，阿特拉森坦处理的db/db小鼠可能通过其神经保护作用显著改善了视网膜厚度。

在本研究中，我们在23周龄的db/db小鼠中开始阿特拉森坦治疗，此时db/db鼠中已经出现DR的病理变化，包括毛细血管闭合。²⁵事实上，ET_A类视网膜病变发病后受体阻断能够显著改善db/db小鼠的外周视网膜厚度和周细胞存活率，这表明在血管病变发病前进行早期治疗可能会保护外周视网膜的健康。更长的随访时间，以及早期治疗的研究，可以让我们进一步探讨这些重要问题。

值得注意的是，阿特拉森坦治疗的糖尿病组的血糖水平介于对照db/m和未治疗db/db小鼠之间(表1)。尽管无统计学意义，但阿特拉森坦治疗的db/db小鼠的血糖比未治疗的db/db小鼠低约100 mg/dL。为了解决血糖控制问题，我们根据更严格的血糖水平进行了子集分析，基本上证实了E/P比率和无细胞毛细血管的差异表1然而，阿特拉森坦改善的代谢控制可能会潜在地增强视网膜血管参数的改善。内皮素-1已被证明对葡萄糖代谢具有重要的有害作用，尽管其确切机制尚未完全阐明。⁴⁹动物研究表明ET_A类受体阻断改善了Zucker脂肪大鼠的糖耐量、高胰岛素血症和胰岛素敏感性，Zucker脂肪大鼠是胰岛素抵抗的动物模型。⁵⁰其他研究表明，ET_A类受体阻断8周可延迟非肥胖小鼠（1型糖尿病动物模型）的高血糖发作。⁵¹ET的影响_A类受体阻断可增强周细胞的代谢有利效应，并可能解释我们治疗的db/db小鼠中100 mg/dL平均血糖的非统计显著差异。我们的研究不足以研究ET的这一方面_A类受体阻断，但这可能是未来研究的重点。

内皮素受体拮抗剂在糖尿病中的应用已经在各种研究中进行了探索，并取得了可喜的结果。电子技师_A类在链脲佐菌素诱导和Zucker糖尿病大鼠的糖尿病肾病中，受体拮抗剂已被证明可以提高足细胞存活率并保护其免受肾损伤。^19，52，53在健康人和链脲佐菌素诱导的小鼠中，ET_A类受体拮抗剂可以防止内皮素-1引起的视网膜血流减少。^14，54Macitetan是一种双重内皮素受体拮抗剂，它可以降低db/db小鼠视网膜中异常升高的分子生物标记物（如内皮素-1、TGF-B、VEGF、纤维连接蛋白、胶原）。⁵⁵我们目前的研究表明内皮素-1拮抗剂在db/db小鼠的视网膜血管和神经视网膜结构保护中具有新的作用。

总之，我们的研究表明，特定ET_A类db/db小鼠的受体阻断能显著提高周细胞存活率，减少细胞凋亡，减少无细胞毛细血管，减少外周视网膜变薄，这些都是DR的重要病理表现_A类由于周细胞丢失和视网膜变薄是DR的重要病理特征，因此需要进一步研究ET保护DR的确切机制_A类受体阻断。此外，还需要进一步研究，以探讨内皮素受体拮抗剂是否可以在糖尿病微血管并发症的预防和治疗中发挥作用。

致谢

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