清髓剂白消安是骨髓移植或造血干细胞移植（HSTC）前对白血病、淋巴瘤或非恶性血液病患者进行预处理的“首选药物”。尽管白消安在预处理方面比全身照射有明显的优势，并且已成为HSTC的标准成分，但其治疗指数较窄，难以达到最佳剂量(1–三). 白消安治疗的相关毒性包括肺损伤、癫痫发作、白内障和肝窦阻塞综合征（SOS），这些症状在患者中经常致命(4–11). 许多最近的研究旨在通过改变给药方案或建立预测性药代动力学生物标记物来提高白磺坦的安全性，这些努力强调迫切需要更全面地了解白磺丹系统药理学(12,13). 最近对白消安给药的药代动力学策略的高度关注与其毒性分子机制信息的缺乏形成了鲜明对比。加深对白消安毒性机制的了解可以提高HSTC协议的安全性。
白消安的代谢物被认为是潜在的毒性来源，负责代谢的酶被认为是毒性的遗传因素，但尚未证实确切的机制(14–16). 白消安的代谢物库来源于其最初谷胱甘肽转移酶（GST）催化的与GSH的反应，包括四氢噻吩（THT+)和氧化THT+变体(17,18). 此外，还形成了GSH的脱氢丙氨酸类似物或EdAG（γ-谷氨酰-脱氢丙基-甘氨酸），如由于其化学反应性，EdAG需要被视为毒性来源。已知EdAG与额外的GSH反应形成不可还原的镧硫醚GSG()据推测，它与蛋白巯基反应，在不可逆的谷胱甘肽酰化蛋白中生成硫氢镧键(19,20). 然而，这一反应尚未得到实验证明。
白消安的谷胱甘肽依赖性代谢物。A）白消安的GSH加合物重排为GS-THT+，随后对EdAG进行β-消除。B）EdAG与GSH发生额外反应，形成GSG。
不可逆谷胱甘肽酰化的可能性对白消安毒性的机制具有重要意义，因为它可能导致许多蛋白质的失调，而这些蛋白质通常由可逆谷胱甘肽酰化调节。参与多种不同细胞功能的蛋白质通过可逆的谷胱甘肽酰化来调节，以响应细胞的氧化还原状态，包括转录激活物、细胞骨架蛋白、线粒体电子转移成分、信号蛋白和参与中间代谢的酶(21–23). 通常，这种调节依赖于GSH与蛋白cys残基的混合二硫化物的形成和还原，以响应氧化还原状态。因此，如果EdAG与蛋白质形成不可逆的镧硫氨酸连接，或与控制可逆谷胱甘肽酰化的酶形成这种连接，则EdAG可能会全面破坏细胞内稳态。
假设GSH结合位点内含有活性cys残基的蛋白质特别容易受到EdAG共价结合的影响。因为EdAG是GSH的直接结构类似物，它可能与GSH结合位点有亲和力，包括谷胱甘肽（Grx's）、硫氧还蛋白（Trx's）或其他GSH结合蛋白中的位点。Grx基序包括一个保守的GSH结合位点，或Grx折叠，发生在许多蛋白质中(24–27). 在许多情况下，Grx结构域包括在酶催化过程中与GSH形成二硫键的亲核cys(26). 例如，谷朊菌毒素-1（Grx-1）利用cys-23与GSH形成混合二硫化物（Grx-S-SG）来催化蛋白质在其游离硫醇处的谷胱甘肽酰化，或者它可以还原蛋白质-S-SG二硫化物，使其与中间产物Grx-S-SR脱谷胱甘氨酸化。Grx-2利用cys-77进行类似的反应，但机械上不同的反应。因此，Grx-1和Grx-2是调节“谷胱甘肽”或通常通过可逆谷氨酰化调节的蛋白质组的关键酶。
在这里，我们证明EdAG暴露于细胞溶质Grx-1或线粒体Grx-2可导致与其活性位点cys残基轻松形成镧硫氨酸连接。共价键的形成导致预期的功能抑制。这种效应的组合对白磺丹的毒性机制具有重要意义。最重要的是，这些结果确立了EdAG与折叠蛋白质中cys残基反应的化学能力。
材料和方法
化学制品
除非另有说明，否则所有化学品均购自Sigma-Aldrich。
γ-谷氨酰脱氢乙酰甘氨酸（EdAG）的合成
通过从S公司-Asquith等人之前描述的（2,4-二硝基苯基）谷胱甘肽(28). 具体来说，中间产物S公司-如Younis所述，合成了（2,4-二硝基苯基）谷胱甘肽(29). 简言之，将1-氯-2,4-二硝基苯溶液（10 mmol存于20 ml甲醇中）逐滴添加到还原谷胱甘肽-（10 mmol存于40 ml 1 N NaHCO中三)然后在室温下搅拌混合物。一小时后反应完成，由1核磁共振氢谱。然后过滤反应混合物，并用1 M HCl酸化沉淀产物。通过真空过滤收集黄色沉淀物，从热水中重结晶，在60°C下干燥48小时，并通过1核磁共振氢谱[DMSO-d6:δ1.79（m，1H），1.94（m，2H），2.24–2.37，J型=9.3，4.1赫兹，1H），7.97（d，J型=9.1Hz，1H）、8.47（dd，J型=8.9，2.5赫兹，1H），8.68（天，J型=8.7赫兹，1H），8.87（d，J型=2.5 Hz，1H）和8.98（t，J型=5.8 Hz，1H）]和ESI-MS（正离子模式，[MH]+=474.1米/赫兹）。S-（2,4-二硝基苯基）谷胱甘肽的收率为75%。
利用该产物合成了γ-谷氨酰脱氢酰基甘氨酸（EdAG）。2mmolS公司-将（2,4-二硝基苯基）谷胱甘肽溶解在50 ml 0.5 M NaOH中，并在室温下搅拌溶液。45分钟后，反应完成，根据1核磁共振氢谱。然后用正丁醇（6×20 ml）萃取溶液，并丢弃有机层（含有2,4-二硝基硫代酚）。为了去除钠离子，用Dowex 50W-X8阳离子交换树脂（氢型，Biorad，20-50目，用正丁醇饱和水预平衡）滴定橙色水层（pH~12），直到pH值接近~4.0。将所得淡黄色水溶液过滤并通过旋转真空蒸发器浓缩至小体积（~0.5 ml）。然后通过添加100 ml冷（-20°C）乙醇（200 proof，Decon Labs.，Inc.）沉淀EdAG。离心后（4100 rpm，4°C下5分钟），回收浅棕色固体，然后在室温和大气压下干燥。然后将产物在含有0.1%甲酸（F.A.）的水中重新溶解，并通过C18 RP-HPLC（Syncronis aQ，250×10 mm，5μm粒径，Thermo Scientific）纯化。采用水+0.1%F.A.流动相，流速设置为3 ml/min。在9.39 min洗脱EdAG。将含有EdAG的馏分混合并冷冻干燥，得到纯度>98%的白色固体，测定方法如下：1核磁共振氢谱。该产品的特点是1H、，13C和1H（H）-13C核磁共振(30).1核磁共振氢谱（D2O、 pH~3）：δ2.17（q，J型=7.3 Hz，2H），2.58（td，J型=7.3，4.5赫兹，2小时），3.82（吨，J型=6.4 Hz，1H），4.00（s，2H），5.68 ppm（s，1H。ESI-MS（正离子模式，[MH]+=274.1 m/z）。EdAG从开始的产量S公司-（2,4-二硝基苯基）谷胱甘肽含量为60%。附图30中显示了描述整个两步合成的方案以及详细方法和光谱数据。
重组人Grx-1和Grx-2（41-164）的表达和纯化
表达质粒大肠杆菌人类Grx-1和Grx-2（41-164）【手稿剩余部分的工程截短部分称为Grx-2】由Caryn E.Outten教授（美国南卡罗来纳大学化学与生物化学系）慷慨捐赠。
Grx-1和Grx-2的表达和纯化如前所述完成(31,32)，尽管使用三（2-羧乙基）膦（TCEP）代替DTT。根据SDS-PAGE测定，两种蛋白质的纯度均大于90%。在所有情况下，蛋白质浓度都是通过使用摩尔消光系数（ε280纳米)3160和6400 M−1厘米−1分别用于Grx-1和Grx-2（41-164）。MS表征表明Grx-1表达于大肠杆菌在没有N端Met的情况下获得。
谷胱甘肽活性测定（HED法）
纯化的hGrx-1和hGrx-2的催化活性通过标准耦合酶分析和监测模型底物2-羟乙基二硫（HED）的还原来测定，如前所述(33). 简单地说，将0.7 mM HED添加到含有100 mM Tris•HCl、pH 7.9、1 mM GSH、0.2 mM NADPH、2 mM EDTA、0.1 mg/ml牛血清白蛋白和6μg/ml（~3单位/ml）面包酵母谷胱甘肽还原酶（Sigma-Aldrich，500单位/mg蛋白质）的混合物中。培养3分钟后，将谷胱甘肽添加到样品比色皿中（10 nM下的Grx-1或100 nM上的Grx-2），并将等量的缓冲液添加到参考比色皿。上述所有浓度都是试管中的最终值。使用Varian Cary 3E UV-Vis跟踪340 nm处吸光度的降低（由于NAPDH氧化），并使用GraphPad Prism版本4.00（GraphPad-Software，San Diego，CA，USA）对数据进行线性回归拟合。使用6220 M的摩尔消光系数，以单位/mg蛋白质（即氧化NADPH的微米/分钟/mg蛋白质）表示活性−1厘米−1并在减去在缺乏谷胱甘肽的情况下观察到的自发还原率后测定。Grx-1和Grx-2的比活性分别为220和25单位/mg。
用EdAG培养谷胱甘肽
除非另有说明，否则所有培养均在pH 7.4、含有250μM TCEP的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行，搅拌速度为120 rpm，温度为37°C。初始EdAG/蛋白质摩尔比始终设置为20（即50μM谷朊毒素和1 mM EdAG）。
对于反应时间过程实验，在可变时间点取等分样品，并立即储存在−80°C下。在进行质谱分析之前，立即解冻每一等分样品。
在任何情况下，经谷胱甘肽活性测定的反应小份样品在分析前均未冷冻。在这些情况下，取一小部分等分时间点，立即进行活性测试。
胰蛋白酶消化法
用胰蛋白酶对hGrx-1、hGrx-2（41-164）及其EdAG基对应物进行蛋白质水解，以进行质谱分析。简言之，在室温下通过添加最终浓度为8 M的尿素对含有约5μg蛋白质（约500μg/ml）的等分试样进行变性。在添加pH 8.0的Tris•HCl至最终浓度为50 mM后，添加二硫苏糖醇（DTT）至最终浓度约10 mM，并在室温下将混合物放置1小时。随后，将碘乙酰胺（IAM）添加至最终浓度约20 mM，将混合物在黑暗和室温下保存1小时，然后将新鲜DTT添加至最终密度约10 mM，以淬灭未反应的IAM。然后用50 mM碳酸氢铵（pH 8.0）和1 mM CaCl将混合物稀释80倍2添加测序级胰蛋白酶至1:20胰蛋白酶/蛋白质质量比，并在37°C下培养过夜。然后将乙腈添加到5%的最终浓度，并通过添加88%的甲酸将pH降至~2.5。
质谱法
所有质量分析均在SYNAPT G2-Si四极飞行时间光谱仪上进行（马萨诸塞州米尔福德沃特斯）。为了确保整个分析过程中的高质量精度，锁定质量（亮氨酸脑啡肽，[M+H]+=556.2771 Da）。
对于完整蛋白质分析，在POROS-R1色谱柱（150×2.1 mm，10μm粒径，applied Biosystem）中加入约5μg，并在17 min内以0.3 ml/min的流速从10%到95%的二元流动相线性梯度（a=0.1%F.a.；B=ACN+0.1%F.a.）。MS光谱采集是在正模式下进行的，扫描范围为200–3000 Da。
在所有需要估计蛋白质/EdAG反应混合物中EdAG-蛋白质/蛋白质摩尔比的情况下，整合相同电荷态的平滑峰和分数面积（即a+x/（A）+x个+B类+x个)，其中A+x个和B+x个分别作为EdAG-ylated蛋白质和未修饰蛋白质的计算积分）。该方法基于以下假设/近似，即天然蛋白质和EdAG基蛋白质具有同等的电离效率。
对于胰蛋白酶消化LC-MS/MS分析，在UPLC BEH C18色谱柱（100×1.0 mm，1.7μm粒径，Waters）上分解约350 ng消化蛋白，并在24分钟内以0.08 ml/min的流速从5%到50%B进行线性梯度（a=0.1%F.a.；B=ACN+0.1%F.a.）。
MS光谱是通过数据相关采集（DDA）获得的，在50–2000 Da的m/z范围内进行1秒的测量扫描，然后在50–1200 Da的范围内进行1秒的MS/MS扫描，陷阱碰撞能量为30 eV。在所有情况下，质量误差均小于5 ppm。
所有数据采集、处理和可视化均使用MassLynx（Waters）进行。在蛋白质探测仪（prospector.ucsf.edu）的帮助下，使用精确的质量和MS/MS光谱手动分配肽。
结果
EdAG的特性
尽管已报道EdAG的合成(17,29)，未发布完整的特征描述。因此，我们进行了完整的核磁共振表征，以测量纯度并确认结构。简单的一维1H和13C核磁共振波谱如所示这表明我们最终产品的纯度至少为99%。通过DQF-COSY、TOCSY、NOESY、，1H（H）-13C HSQC和1H（H）-13C HMBC在其他地方提供(30).
1无缓冲D中~5 mM EdAG的H-NMR谱2O、 pH~3和13非缓冲H中~40 mM EdAG的C-NMR谱2O/D（输出/输出）2O 90:10，pH~3。光谱提供了纯度的标准，估计>98%。”“FA”是甲酸，“DSS”是2,2-二甲基-2-硅烷-5-磺酸。
Grx与EdAG的共价加合物
为了验证EdAG与Grx有效反应的假设，将其与纯化的人Grx-1或Grx-2（分别代表细胞溶质和线粒体亚型）分开培养。这两种亚型在细胞氧化还原调节和控制多种蛋白质的可逆谷胱甘肽酰化中起着关键作用(24,27). 孵育包括50μM蛋白质和20倍过量的EdAG，生理pH值为37°C，其中大多数蛋白质巯基被质子化，反应性不高。在混合后的不同时间用ESI-MS监测反应。对未经修饰的完整蛋白质和预期加合物进行了监测。显示了以Grx-1和Grx-2的总蛋白质的百分比表示的加合物出现的时间过程。在这些条件下，两种蛋白质显示出相似的时间过程，其中50%的蛋白质在约10小时内加合。
A、 C）分别在8小时和10小时从1 mM EdAG和50μM Grx-1或Grx-2获得的反应混合物的反褶ESI-MS光谱。B、 D）EdAG加合物分别与Grx-1和Grx-2形成的时间过程。反应在37°C、pH 7.4、250μM TCEP存在的PBS中进行。加合蛋白的百分比是根据最强烈电荷态（即[M+11H]）的分数面积计算的+11适用于Grx-1/EdAG-Grx-1和[M+16H]+16对于Grx-2/EdAG-Grx-2）。
修改地点的标识
为了确定修饰位置，使用胰酶消化的Grx-1或Grx-2样品与EdAG孵育进行ESI-MS/MS。Grx-1和Grx-2的结果如所示和分别是。VVVFIKPT对应的肽片段C类PYCR清楚显示Grx-1在cys-23（粗体下划线）处的EdAG内收。除了肽链断裂产生的离子外，许多片段还观察到焦谷氨酸的中性损失（损失129 m/z），这与EdAG上的γ-谷氨酰连接一致，这是GSH加合物的一种公认的断裂(34,35). 与EdAG加合肽中焦谷氨酸损失相对应的离子用“y”标记x个-pGlu'英寸。与EdAG孵育的Grx-2也观察到类似结果。此处cys-77在肽TS中明显加合C类SYCTMAK，其中加成的cys-77加粗并加下划线。
带有EdAG加合到cys23的Grx-1胰蛋白酶肽的高质量精度MS/MS光谱，cys23来源于质量为618.98 Da的前体离子（即[M+3H]3+). 重点介绍了选定的片段离子，包括与129 m/z中性损失相对应的离子，中性损失可诊断焦谷氨酸的损失。y轴4和y7离子识别cys23为EdAG加合位点。肽序列中的符号“CAM”表示特定的cys残基是与碘乙酰胺反应生成的氨基甲酰衍生物。
带有EdAG加合到cys77的Grx-2胰蛋白酶肽的高质量精度MS/MS光谱，cys77来源于质量为712.78 Da的前体离子（即[M+2H]2+). 突出显示了选定的片段离子，包括一个对应于129 m/z中性损失的离子，该中性损失可诊断焦谷氨酸的损失。y轴5–7和y8离子在cys77中明确识别EdAG-ylation的位点。
通过MS测定，其他每一种含有cys的肽均未显示加合物。具体而言，发现含有Grx-1的cys-8、cys-79和cys-83以及Grx-2的cys-68和cys-153的肽未经修饰，数据显示在其他地方(30). 有趣的是，发现Grx-2中的两个非活性位点cys残基以及两个活性位点cys残基在有或无EdAG的培养时间内缓慢形成二硫化物(30)，通过任意选择的[M+11H]的渐进质量偏移11+孵化过程中的电荷种类。这些物种很容易被TCEP还原，但除Grx-1的Cys-23或Grx-2的Cys-77外，EdAG从未加合任何半胱氨酸。然而，如下文所述，这种二硫化物异质性使得很难量化存在的单个物种的催化活性。
EdAG加成Grx的催化活性
预计在催化cys残基处形成一个镧硫键将使Grx-1和Grx-2失活。为了证明这一点，使用标准乙氧基二硫醚（HED）分析法与天然Grx的催化活性进行比较。在该分析中，HED二硫被还原，羟基乙基硫醇和GSH之间形成混合二硫。这个二硫键被Grx还原，在活性中心cys和GSH之间生成一个混合二硫键，而GSH又将其还原，生成GSSG。GSSG由Grx利用NADPH作为还原当量的来源进行还原。分光光度法监测NADPH的GSH依赖性氧化(33). 对于Grx-1和Grx-2，在与EdAG孵育期间，即使没有EdAG，也会失去一些催化活性。这在Grx-2构造中尤为明显，它是野生型的删除。此外，如上所述，在孵育过程中，我们观察到在无EdAG和有EdAG的完整Grx-2中，非活性位点半胱氨酸之间形成二硫醚，活性部位半胱氨酸单独形成二硫键，导致还原、部分氧化和完全氧化物种的异质混合物（如参考文献所示）。30). 我们推测，这些二硫化物是在培养过程中形成的，而不是在培养之前出现的，因为样品在开始时包括250μM TCEP。随着这些二硫键形式的积累，不可能确定不同氧化Grx物种的催化活性。由于我们无法分解还原的、部分氧化的或完全氧化的蛋白质，因此很难确定非活性位点cys残基之间的任何二硫键是否对活性位点cys-77的EdAG加合产生影响，因此与EdAG的加合蛋白质百分比基于全部的蛋白质，而不是完全还原的蛋白质。此外，由于质谱仪中未修饰蛋白质与EdAG修饰蛋白质的电离效率的不确定性，加合蛋白质数量的定量仅为半定量。由于这些复杂性，很难将催化活性的损失与EdAG的加合进行定量关联。这使得很难确定K我和k不正确的该活性位点定向抑制剂的参数。然而，从定性上讲，EdAG加合明显与活性丧失相关。对于Grx-1的部分加合样品，根据质谱法，在cys-23处估计有32%加合的酶失去了未经EdAG处理的对照样品的47%催化活性。Grx-2得到了基本相同的结果。因此，Grx-1和Grx-2几乎同样容易受到EdAG加合以及由此导致的催化活性损失的影响。与内收延伸相比，活性损失更大可能反映了多种失活途径，例如上述二硫键的形成和一些与时间相关的去折叠。证明部分加合Grx-1和Grx-2活性损失的数据如所示.
Grx与EdAG反应后的催化活性。在室温（Grx-1）或4°C（Grx-2）下，在存在或不存在1mM EdAG的情况下，在pH为7.4的PBS中培养50μM Grx的样品。24小时后，按照材料和方法部分所述进行HED活性测定。EdAG部分（约35%）加合后，Grx催化活性降低约47%。超过内收水平的活性损失可能是由于氧化和变性。
Grx-1和Grx-2的分子模型是根据可用的晶体结构生成的(36,37)，加合的半胱氨酸蛋白酶残基的位置如所示两种亚型的活性位点相似，因此对EdAG的敏感性相似也就不足为奇了。这些结构强调加合的半胱氨酸蛋白酶残基不暴露在蛋白质表面，而是在谷胱甘肽结合位点内。
静电势面和动画表示A）hGrx-1（改编自pdb:1JHB，型号8），以及B）hGrx-2（改编自pdb:2FLS）。特写显示了催化cys残基的结构细节（Grx-1和Grx-2分别为23、26和77、80）。图像是使用PyMol Molecular Graphics System（1.2r1版，Schrödinger，LLC）生成的。
EdAG不与谷胱甘肽转移酶反应
为了进行比较，hGSTA1-1与EdAG孵育，并监测与谷胱甘肽化蛋白对应的加合物。GSTA1-1是主要的肝脏亚型，催化谷胱甘肽与许多亲电药物（包括白消安）的偶联。GSTA1-1提供了一个有用的比较，因为它包含一个结合活性位点中GSH的谷胱甘肽氧还蛋白基序，并且已经定性地证明它与EdAG有一定的亲和力(17). 虽然GSTA1-1的活性位点中没有活性半胱氨酸，但由于低pKa，活性位点残基Tyr-9在pH 7.4下部分电离，酪氨酸可能具有一些亲核特性(38). 因此，酪氨酸-9与EdAG的反应被认为是可能的。此外，GSTA1-1的Cys 112远离活性位点，但已知与GSH形成二硫化物(39). 因此，考虑了EdAG在Cys-112上形成加合物的可能性。实际上，GSTA1-1提供了GSH结合位点中EdAG与cys以外的亲核试剂的反应性测试，以及GSH反应性硫醇对蛋白质加合EdAG的能力测试。与Grx-1和Grx-2相比，GSTA1-1-不与EdAG反应。我们观察到Cys-112或Tyr-9均无内收。完整蛋白质的MS数据如参考文献30所示。
讨论
该结果首次证明了EdAG与蛋白质形成不可逆的镧硫键的能力。EdAG与Grx-1和Grx-2的反应对busulfan的细胞毒性具有重要意义。许多具有广泛功能的蛋白质都是通过可逆的谷胱甘肽酰化来调节的，而Grx在调节其谷胱甘苷酰化以响应氧化还原状态方面起着关键作用。这些过程如图所示细胞溶质Grx-1和线粒体Grx-2均被不可逆转地灭活，这一事实表明，在足够高浓度的EdAG作用下，广泛的细胞功能将被失调。据推测，EdAG的最高浓度达到体内存在于GSH和GST浓度最高的肝细胞中。有理由推测，EdAG导致肝窦阻塞综合征或其他与白消安治疗相关的毒性。当然，如果EdAG进入全身循环，其他器官也可能出现毒性。例如，白消安作为清髓剂的作用机制可能包括其对谷胱甘肽酰化状态的影响。据推测，白消安影响癌性骨髓细胞的能力可能并不局限于其作为DNA烷基化剂的活性。如果EdAG在骨髓细胞中生成或在肝脏生成后到达骨髓，那么EdAG对骨髓细胞的作用可能有助于其治疗效果。
EdAG对谷胱甘肽的可能影响。EdAG可以通过抑制Grx’s直接改变谷胱甘肽，如本文所示，或者假设通过抑制Trx’s。此外，EdAG可以与cys残基在蛋白上形成不可逆加合物，这些蛋白通常被谷胱甘肽酰化激活或抑制。EdAG的加合可以激活或抑制这些蛋白质。
如所示原则上，EdAG也可能与不在GSH结合位点的cys残基形成镧硫键。反应性的主要决定因素是半胱氨酸的pKa及其空间可及性。这可能解释了Grx中cys残基的差异反应性，其pKa接近4，具有亲核性(26,27)与GSTA1-1的表面cys-112相比，其pKa可能接近9.5。包括推测硫氧还蛋白（具有低pKas的亲核cys残基）也会与EdAG反应，尽管我们在EdAG活性的初始证明中没有明确寻找到这一点。关于具有“正常”pK的cys残基一s、 这里我们只采集了GSTA1-1的cys-112，已知其与GSH形成二硫化物(39)，并发现EdAG不与之反应，这表明EdAG与整个蛋白质组的cys残基之间可能存在差异反应性。另一个体内决定反应性的重要参数是浓度。高表达的蛋白质可能优先于具有更易接近的cys残基或更具活性的cys残留物的蛋白质加合。有鉴于此，进行蛋白质组学实验以鉴定与EdAG反应的任何其他蛋白质将是有用的体内如果EdAG与作为调节机制的一部分被可逆谷胱甘肽酰化的cys残基发生反应，那么这也可能会失调谷胱甘膦。因此，EdAG可以通过与通常通过可逆谷胱甘肽酰化参与调控的cys残基反应，以及通过其对控制谷胱甘膦酰化/脱谷胱甘氨酸硫基化过程的Grx或Trx的失活，来改变谷胱甘肽。除Grx’s和Trx’s外，硫氧还蛋白还利用谷胱甘肽催化脱谷氨酸硫代化(40)GSTω可能在GSH非依赖性脱谷氨酸硫代化过程中发挥作用(41). 因此，这些酶也是EdAG的潜在靶点。我们有限因为它们似乎是谷胱甘肽酰化状态的主要决定因素，但这些其他蛋白质也可能受到影响，因为它们在潜在的GSH结合位点中有活性cys残基。类似地，GSTP1-1被建议介导蛋白质的谷胱甘肽酰化，但唯一的活性cys（cys-47）不是典型GSH结合位点的一部分。不过，GSTP1-1可能是EdAG的另一个有趣的目标。
从生物化学的角度来看，结果是新颖的。我们还没有发现其他由任何药物或药物代谢物引起的不可逆蛋白谷胱甘肽酰化的例子。因此，白消安对谷胱甘肽的任何影响都可能代表一种新的药物依赖性毒性机制。此外，值得强调的是，EdAG与蛋白质的反应是我们所知道的唯一一个例子，即一种药物（busulfan）通过内源性肽（GSH）产生“活性代谢物”。请注意，如中所述，最初在白藜芦丹中发现的原子都没有保留在与EdAG的最终GSH加合物中，这由蛋白质加合物的结果证实。含EdAG的不可逆蛋白质加合物仅含有GSH的原子，不含白消安的原子。这是一个有趣的变化，在更常见的情况下，药物代谢为反应性物种，导致药物支架并入蛋白质。此外，在抗生素天然产物中观察到了镧硫键，而催化其形成的酶是将新型镧硫烯并入工程蛋白的潜在工具(42). 与EdAG的反应是一种有趣的“非天然”镧系元素来源。综上所述，结果表明，常用药物白消安可以通过新的机制参与与蛋白质的有趣化学反应。
