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临床癌症研究。作者手稿；2016年9月15日PMC提供。
以最终编辑形式发布为：
《临床癌症研究》，2015年9月15日；21(18): 4184–4193.
2015年3月16日在线发布。 doi（操作界面）：10.1158/1078-0432.CCR-14-2112
PMCID公司：项目经理4573368
NIHMSID公司：NIHMS672577
PMID：25779942

SLFN11型是EWS-FLI1的转录靶点，是尤因肉瘤药物反应的决定因素

西文堂,1 斯文·比尔克,2 梁操,2 村井俊子,1 法布里西奥·G·苏萨,1,4 山美子,1 维诺德·拉贾帕克塞,1 苏迪尔·瓦尔马,1 李·赫尔曼,三 官员扎维德,2 保罗·S·梅尔泽,2和伊威斯·波米尔1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

摘要

目的

通过分析NCI-60和CCLE数据集的基因表达和药物敏感性，SLFN11被确定为DNA靶向治疗反应的关键决定因素。然而，如何SLFN11型在癌细胞中被调节仍然未知。以嵌合转录因子EWS-FLI1为特征的尤因肉瘤（ES）具有显著的高表达SLFN11型表达式，引导我们调查EWS-FLI1是否驱动SLFN11型SLFN11的表达及其在ES细胞药物应答中的作用。

实验设计

EWS-FLI1在SLFN11型启动子通过染色质免疫沉淀-DNA序列（ChIP-Seq）和启动子荧光素酶报告子分析进行分析。之间的关系SLFN11型在EWS-FLI1敲除或过度表达细胞和临床肿瘤样本中进一步检测EWS-FLI 1。

结果

EWS-FLI1在转录起始位点附近结合SLFN11型促进剂并作为SLFN11型在ES细胞中的表达。EWS-FLI1-介导SLFN11型这种表达是ES对喜树碱和PARP抑制剂与替莫唑胺联合使用的高敏感性的原因。重要的是，ES患者SLFN11型表达结果显示无瘤生存率较高。之间的相关表达式SLFN11型和FLI1公司扩展到白血病、儿童、结肠癌、乳腺癌和前列腺癌。此外，其他ETS成员的表达与SLFN11型在NCI-60和CCLE数据集中，分子实验证明ETS1对SLFN11型在乳腺癌细胞中表达。

结论

我们的研究结果表明SLFN11型作为ETS转录因子反应基因，用于ETS激活的癌症对拓扑异构酶I抑制剂和替莫唑胺-PARP抑制剂组合的治疗反应。

关键词：SLFN11、EWS-FLI1、ETS1、尤因肉瘤、PARP抑制剂、喜树碱

介绍

的家庭沙拉芬基因(SLFN公司)仅在哺乳动物中发现，据报道可调节几个关键的生物功能，包括细胞周期阻滞、分化和癌细胞侵袭(1–三). 此外，最近发现SLFN11是癌细胞对拓扑异构酶I抑制剂的主要反应因子(4,5). 敲除SLFN11可增加癌细胞对多种DNA损伤剂的耐药性(4,6)SLFN11的异位表达使结肠癌细胞对拓扑异构酶I抑制剂敏感(7)与SLFN11参与DNA损伤反应一致(4). 同时，David和同事证明了SLFN11具有抗人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的功能，这是由于以密码使用依赖的方式选择性抑制病毒蛋白合成，从而抑制复制(8). SLFN11在癌症生物学和治疗反应中的新兴相关性促使我们研究如何SLFN11型癌细胞的表达受到调控。

尤因肉瘤（ES）是一种恶性肿瘤，主要发生在儿童和年轻人的骨骼或软组织中。它很容易转移到其他器官，包括肺、骨骼和骨髓(9). ES患者的总体生存率仍然很低；25%的局限性肿瘤患者和75%的转移患者没有持久的治疗反应(9,10). 约85%的ES具有编码嵌合转录因子EWS-FLI1的染色体易位（11；22）（q24；q12）的特征，该嵌合转录因素包含EWSR1的氨基末端反式激活域与FLI1羧基末端ETS DNA结合域融合(11). FLI1是ETS转录因子家族的成员，含有一个高度保守的结构域，可识别ETS核心一致性位点（GGAA/T）；提供亲和力和特异性的侧翼DNA序列(12,13). EWS-FLI1通过与典型ETS核心共识位点或GGAA微卫星结合调节多个靶基因而致癌(14,15). 此外，EWS-FLI1能够在近端启动子上与E2F3共定位以激活靶基因(16).

表达EWS-FLI1的ES细胞对聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制剂非常敏感(17). 新的研究表明，PARP抑制剂与替莫唑胺联合使用在ES细胞中表现出显著的协同作用(18,19)与任何一种单一制剂相比，联合用药诱导更多的细胞毒性PARP-DNA复合物(20,21). 此外，Barretina等人表明，ES细胞系SLFN11型对拓扑异构酶I抑制剂高度敏感(5). 基于这些发现，我们假设EWS-FLI1在SLFN11型ES细胞对喜树碱的反应以及PARP抑制剂和替莫唑胺的联合作用。在本研究中，我们证明了EWS-FLI1作为一种阳性转录调节因子对SLFN11型SLFN11与拓扑异构酶I抑制剂的敏感性以及PARP抑制剂与替莫唑胺的协同作用与EWS-FLI1表达的关系有关。我们进一步扩展SLFN11型另一种ETS转录因子ETS1对乳腺癌和其他癌症的调节。

材料和方法

细胞、质粒和药物

293T和A673细胞保存在37°C下添加10%胎牛血清（FBS）、2 mmol/l l-谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。HT1080/GFP、HT1080/EWS-FLI1和Hs 343。T细胞保存在罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（RPMI）中，该培养基补充有10%的FBS、2 mmol/l的l-谷氨酰胺、4µg/ml的巴司他丁和抗生素，37°C，5%CO2中。Heinrich Kovar博士提供了具有多西环素诱导的靶向EWS-FLI1（ASP14）的shRNA的A673细胞(22)并用10%的FBS、2 mmol/l的l-谷氨酰胺、2µg/ml的Balsicdin、50 ug/ml的Zeocin和抗生素在37°C的5%CO2中保存在DMEM中。pCB6/EWS-FLI1表达质粒是苏珊·贝克博士赠送的礼物。pCMV6-ETS1表达质粒来自OriGene。药物来自NCI药物开发治疗计划（DTP）。

ChIP-Seq数据分析

A673 ES细胞系EWS-FLI1染色体结合区的ChIP-Seq数据集如先前研究所述获得(16). 来自ChIP-Seq分析的标签数据从UCSC上传到Integrative Genomics Viewer(http://www.genome.ucsc.edu)和EWS-FLI1在转录起始位点（TSS）附近结合的标签密度SLFN11型进行了分析。

ETS绑定主题预测

EWS-FLI1结合区的潜在ETS结合位点SLFN11型使用JASPAR数据库预测启动子（33700532−33700847），包括转录因子和其他序列特异性DNA结合蛋白的DNA结合模式(网址：http://jaspar.genereg.net) (23,24). 相对得分大于0.9的预测位点被认为是潜在的ETS结合位点。

人的建构SLFN11型发起人

全长（TSS的−840~+460 bp）SLFN11型用引物（正向，5'-TTTTCTCTATCGAGAGTACCAGTGCGCATTAACGCTGCT-3’；反向，5'-ACGGTAAGCGCGAGCTCGGACCGGAGAGAGAAAGCA-3’）通过PCR扩增启动子，并按照制造商的说明克隆到pGL3-碱性荧光素酶报告载体中（In-Fusion HD克隆试剂盒；Clontech Laboratories，Inc.）。根据制造商的说明，使用QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit对三个潜在的EWS-FLI1结合位点进行突变（Stratagene）。用于引入突变的引物为：mt+91:5′-TCGCGCTTAGACCTATACATCGTCTCTCCC-3′；mt+181:5′-ACCTGGGCGCTCCAGCATGACGCTAAGGGGCTTC-3′；mt+201，5′-ACGCTTAAGGGGCTTTCCATGGCGCTGGTGAG-3′。所有结构均通过核苷酸测序进行验证。

启动子荧光素酶报告分析

细胞与pGL3共转染-SLFN11型启动子质粒和pCMV-β-半乳糖苷酶质粒，根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000转染试剂（Life Technologies）。转染24 h后，使用荧光素酶检测试剂盒（Promega）检测荧光素素酶活性，并按照制造商的说明使用Tropix Galacto-Star化学发光报告基因检测（Applied Biosystems）检测β-半乳糖苷酶活性。发光信号由EnVision 2104多标签阅读器（PerkinElmer）测量。β-半乳糖苷酶活性是荧光素酶活性正常化转染效率的内部控制因素。

定量实时PCR

用PBS清洗细胞两次，使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，并根据制造商的说明，使用SuperScript™II逆转录酶试剂盒（Invit罗gen）逆转录到互补DNA。用于扩增特定基因的引物如下：SLFN11型（正向5'-GGCCCAGACCAAGCCTTAAT-3'和反向5'-CACTGAAAGCCAGGGCAAAC-3'）、FLI1（正向5'-CCAAAGTGCACGGCAAAAGA-3'和反向5'-GGCATGGTAGGAAGGT-3'）和GAPDH公司（向前5'-TCAACGACTTTGTCAAGCT-3'和向后5'-GTGAGGTCTCTCTCTTCCTTGT-3'）。根据制造商的说明，通过7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems），使用FastStart Universal SYBR Green Master（罗氏应用科学）进行定量实时PCR。生成熔化曲线以确认扩增特异性。内部控制采用GAPDH。基因表达的相对水平用2（-ΔΔCt）方法。

西方印迹法

用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，然后在50 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1%Triton X-100、0.1%添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）的SDS中溶解。裂解产物在8%的SDS-PAGE中分离，并转移到聚偏氟乙烯膜（Millipore）。使用SLFN11（sc-374339，Santa Cruz Biotechnology）、FLI1（sc-356，Santa Cruz Bietechnologies）、GSK3β（610201，BD Transduction Laboratories）或肌动蛋白（MAB1501，Chemicon International）特异性抗体进行免疫印迹，然后使用辣根过氧化物酶结合二级抗体（GE Healthcare Life Sciences）。肌动蛋白作为负荷控制。

微阵列和RNA-Seq数据

NCI-60的全基因组表达谱分析（CellMiner工具：http://discover.nci.nih.gov/cellminer网站)和CCLE(http://www.broadinstitute.org/ccle/home)细胞系最近被描述(5,25). 微阵列分析44例ES肿瘤和18例正常骨骼肌组织的基因表达谱(26)从基因表达综合网站下载(GSE17674,网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) (27). 原始信号强度通过稳健多芯片平均（RMA）方法和对数归一化2-改变了。The median-normalized expression ofSLFN11型和FLI1公司在163例儿童癌症数据集中，来自儿科临床前测试项目(http://home.ccr.cancer.gov/nocology/oncogenomics网站) (28). 从TCGA门户检索结肠癌、乳腺癌和前列腺癌数据集中基因表达的RNA-Seq数据(网址：http://cancergenes.nih.gov).

siRNA转染和细胞活性测定

细胞转染10 nM的SLFN11型-瞄准，ETS1型-根据制造商的说明（生命技术），使用Lipofectamine 2000转染试剂靶向或非靶向siRNAs（Thermo Scientific Dharmacon）。转染1天后，按指示处理细胞。通过MTS测定法（Promega）测量细胞活力。将未经处理的细胞设为100%，计算细胞存活率。

统计分析

双尾独立样本t吨-采用试验确定两个实验组在启动子荧光素酶报告子分析、定量实时PCR和细胞活力分析方面差异的统计学意义。采用非线性回归计算抑制浓度50%（IC50)喜树碱。数据集中两个单独基因表达水平之间的相关性通过皮尔逊相关性进行评估，在进行多次比较的情况下，使用Bonferroni方法调整p值。Kaplan-Meyer曲线基于SLFN11型在44例ES患者队列中，表达高于或低于中位数(26)使用Mantel-Cox log-rank检验进行分析。测试结果与第页除非另有说明，否则<0.05被视为具有统计学意义。

结果

EWS-FLI1绑定并激活SLFN11型发起人

确定EWS-FLI1是否调节SLFN11型，我们分析了ES A673细胞染色质免疫沉淀和DNA序列分析（ChIP-Seq）的结果(16)通过关注SLFN11型启动子区。值得注意的是，EWS-FLI1的优先结合位于SLFN11型(图1A). 确定EWS-FLI1是否直接激活SLFN11型转录，我们克隆了SLFN11型（从TSS的−840到+460 bp），并执行启动子荧光素酶报告分析。在这些实验中，我们使用EWS-FLI1-过表达HT1080细胞（HT1080/EWS-FLI 1）和GFP表达细胞（HT108 0/GFP）作为参考对照(29). 结果表明SLFN11型启动子活性在HT1080/EWS-FLI1细胞中选择性增强，但在HT1080/GFP对照细胞中没有增强(图1B). 此外，EWS-FLI1在293T细胞中的瞬时表达显著增强SLFN11型启动子活性(图1C). 这些结果表明EWS-FLI1结合并激活SLFN11型发起人。

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激活SLFN11型EWS-FLI1启动子。A、，EWS-FLI1的ChIP-seq标签密度图SLFN11型发起人。箭头表示最高标记密度（染色体17，33700733，距转录起始位点A+91 bp）。黑盒子代表外显子。JASPAR预测了潜在的ETS核心共识位点（位置+181和+201 bp处的位点B和C）(网址：http://jaspar.genereg.net).B类用pGL3转染稳定表达EWS-FLI1（深灰色）或GFP（浅灰色）的HT1080细胞-SLFN11型启动子24h后再测定荧光素酶活性。y轴代表相对于对照（GFP）的启动子活性。C、，293T细胞转染SLFN11型启动子加EWS-FLI1表达质粒（深灰色）或SLFN11型在测量荧光素酶活性之前，启动子加上空白对照质粒（浅灰色）24小时。y轴代表相对于对照（对照）的启动子活性。D中，HT1080/EWS-FLI1转染野生型SLFN11型启动子（WT）或突变SLFN11型启动子（mt+91、mt+181或mt+201）作用24小时，然后测定荧光素酶活性。E、，用EWS-FLI1表达质粒和野生型转染293T细胞SLFN11型启动子（WT）或突变SLFN11型启动子（mt+91、mt+181或mt+201）作用24h后，测定荧光素酶活性。三个独立实验的代表性结果一式三份，显示为平均值±标准偏差*，第页< 0.05; **,第页<0.001乘以t吨测试。

接下来，我们分析了负责EWS-FLI1介导的SLFN11型发起人。EWS-FLI1 ChIP-Seq数据显示SLFN11型启动子，大约位于17号染色体上的基因组位置33700733，该位置位于SLFN11型TSS（+91 bp，图1A). 此外，两个潜在的ETS核心共识位点（来自TSS的+181 bp，+201 bp）被JASPAR注释，JASPAR是转录因子结合基序的开放存取数据库(23,24). 确定这些假定的FLI1结合位点对EWS-FLI1诱导的SLFN11型启动子活性，我们测试了3个SLFN11型通过定点突变（mt+91，mt+181，mt+201）实现启动子突变。荧光素酶报告分析显示，+91和+201位置的个体突变减少SLFN11型启动子活性超过80%，而+181突变没有显著影响(图1D).SLFN11型293T/EWS-FLI1细胞中的启动子活性在mt+91和mt+201中分别被抑制约90%和50%，而mt+181不影响SLFN11型启动子活性(图1E). 这些结果表明一致序列+91和+201对于激活SLFN11型EWS-FLI1启动子。

EWS-FLI1调节SLFN11型

证明EWS-FLI1激活内源性SLFN11型通过定量实时PCR和Western blot分析检测HT1080/EWS-FLI1和HT1080/GFP细胞中SLFN11 mRNA和蛋白水平(图2A-B). 与HT1080/GFP细胞相比，HT1080/EWS-FLI1细胞在mRNA和蛋白质水平上显示出显著的SLFN11高。确认SLFN11型通过EWS-FLI1表达，我们使用ASP14细胞系，该细胞系来源于A673细胞，但含有多西环素诱导的shRNA靶向EWS-飞行1(22). 结果表明，强力霉素显著降低了EWS-飞行1和SLFN11型在ASP14细胞中表达，但在不表达EWS-飞行1shRNA(图2C-D). 基于这些结果，我们得出结论，EWS-FLI1转录调节SLFN11型.

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EWS-FLI1对SLFN11表达的调节。A、 mRNA水平EWS-飞行1和SLFN11型在HT1080/EWS-FLI1和HT1080/GFP中通过实时定量PCR进行检测。y轴表示归一化为HT1080/GFP控件的相对表达式。B、，使用针对FLI1（EWS-FLI1，68 kDa）、SLFN11（98 kDa，GSK-3β（46 kDa。C、，mRNA水平EWS-飞行1和SLFN11型在A673或ASP14细胞中用或不用（对照）多西环素（Dox，2µg/ml）处理4天。y轴表示归一化为控件的相对表达式。三个独立实验的代表性结果一式三份，显示为平均值±标准偏差*，第页< 0.05; **,第页<0.001乘以t吨测试。D中，用或不用多西环素（Dox，2或4µg/ml）处理4天的A673或ASP14细胞中EWS-FLI1和SLFN11的蛋白质水平。

SLFN11型表达与FLI1公司表达并可能预测ES患者的无瘤生存期

接下来，我们测试了FLI1公司和SLFN11型利用ES肿瘤样本和正常骨骼肌组织的基因表达微阵列数据进行表达(26,30). 如所示图3A,FLI1公司和SLFN11型表达显著相关(第页= 0.83,第页< 0.0001). 我们还检查了FLI1公司和SLFN11型NCI儿科临床前测试项目中儿童癌症样本队列中的表达，包括ES、横纹肌肉瘤（RMS）、骨肉瘤（OS）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、脑癌和Wilms瘤的原发肿瘤、异种移植和细胞系样本(http://home.ccr.cancer.gov/nocology/oncogenomics网站) (28).FLI1公司和SLFN11型163份儿童癌症样本中的表达水平高度相关(第页= 0.68,第页< 0.0001,图3B). ES和ALL，表示高EWS-飞行1和FLI1公司分别表现出最强SLFN11型表达式(图3B). 脑癌和RMS表现出强烈的相关性表达FLI1公司和SLFN11型(图3B).

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SLFN11型在临床ES样本中，FLI1的表达与无瘤生存率呈正相关。A、，散点图显示了SLFN11型表达式（x轴，对数2归一化强度）和FLI1公司表达式（y轴，对数2标准化强度）。第页，相关系数。B、，散点图显示了SLFN11型（x轴，以中线为中心的原木2归一化强度）和FLI1公司表达式（y轴，以中线为中心的对数2归一化强度）。C、，44例ES患者的Kaplan-Meyer曲线。根据以下方面对患者进行分层SLFN11型表达水平（高于或低于中位数）。缩写：RMS，横纹肌肉瘤；骨肉瘤；急性淋巴细胞白血病。

我们还评估了SLFN11型表达可能是ES患者无瘤生存的预后标志。患者被分为两组SLFN11型高于或低于中位数表达，并通过Log-rank检验进行分析。ES患者较高SLFN11型表达较低的患者预后更好SLFN11型表达式(第页=0.0046，危险比=3.17，比率的95%置信区间=1.43–7.05，图3C).

EWS-FLI1介导的SLFN11表达决定DNA损伤反应

因为SLFN11的表达使细胞对DNA损伤剂敏感(4,5,7)，我们测试了EWS-FLI1介导的影响SLFN11型ES细胞对喜树碱敏感性的表达，喜树碱是一种特异性拓扑异构酶I抑制剂，其衍生物伊立替康和拓扑替康广泛用于抗癌设备(31). 我们发现，强力霉素诱导的EWS-FLI1下调显著降低了ASP14细胞对喜树碱（IC）的敏感性50分别=94 nM和17 nM（在有和无强力霉素的情况下）；图4A). 类似地，用SLFN11型siRNA增加了对喜树碱（IC）的抗性50=75 nM与10 nM（有无）SLFN11型siRNA；图4B). 相反，HT1080/EWS-FLI1细胞对喜树碱的敏感性高于HT1080/GFP细胞（IC50分别为0.29µM和0.85µM；图4C)、和SLFN11型与对照siRNA-转染HT1080/EWS-FLI1细胞（IC50分别为0.62µM和0.19µM）(图4C).

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EWS-FLI1介导的作用SLFN11型喜树碱反应和尼拉帕立布与替莫唑胺协同作用中的表达。A、，用强力霉素（Dox，2µg/ml；红色实心圆圈）或不含强力霉素的ASP14细胞（对照，开放圆圈）预先孵育2天后，用喜树碱处理，然后评估细胞活力。B、，转染A673细胞SLFN11型用喜树碱处理siRNA（红色实心圆圈，siSLFN11）或非靶向siRNA（siControl，黑色实心圆圈）或不含任何siRNA（开圆圈，模拟）2天，然后评估细胞活性。C、，HT1080/GFP（GFP，开圆）、HT1080/EWS-FLI1（EWS-FLI，黑色实心圆）、带有非靶向siRNA的HT1080/EEWS-FLI1（开方形，EWS-FLI/siControl）或带有SLFN11型在测量细胞活力之前，用喜树碱处理siRNA（红色实心正方形，EWS-FLI1/siSLFN11）2天。D中，ASP14细胞预先孵育有或没有强力霉素（分别为Dox和Control），然后用niraparib（1µM）加替莫唑胺（Dox/niraparib，Control/niraparib）或仅用替莫唑酰胺（Control，Dox）处理2天，然后评估细胞活力。E、，A673细胞转染SLFN11型siRNA（siSLFN11）或非靶向siRNA（siControl），然后用niraparib（1µM）加替莫唑胺（siSLF N11/niraparib，siControl/niraparib）或仅用替莫唑酰胺（siSL FN11，siControl）处理2天，然后评估细胞活力。未处理细胞设为100%。三个独立实验的代表性结果一式三份，显示为平均值±SD。**，第页<0.001乘以t吨测试。

我们进一步评估了SLFN11在PARP抑制剂与替莫唑胺联合应用的协同效应中的作用。ASP14和A673细胞对单药替莫唑胺（50–200µM）或尼拉帕利（1µM(图4D–E). EWS-FLI1敲低的ASP14细胞和A673细胞SLFN11型击倒显示出对niraparib和替莫唑胺联合用药的耐药性(图4D–E). 这些发现表明SLFN11型EWS-FLI1增强ES细胞对喜树碱的敏感性，并在PARP抑制剂与替莫唑胺的协同作用中发挥作用。

FLI1公司和SLFN11型其他类型癌症中的共表达

接下来我们检查了FLI1公司和SLFN11型在其他类型的癌症中。通过分析博德研究所（the cancer cell Line Encyclopedia，CCLE）1036个癌细胞系的基因表达数据集(5)我们观察到，大多数ALL、急性髓细胞白血病（AML）和慢性髓细胞白血病细胞系在FLI1公司和SLFN11型(图5A). 我们还评估了FLI1公司和SLFN11型在从癌症基因组图谱（TCGA）的基因表达数据集获得的结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的肿瘤样本中。结果表明：FLI1公司和SLFN11型233例结肠癌的表达高度相关(第页= 0.62,第页< 0.0001,图5B)，994例乳腺癌(第页= 0.45,第页< 0.0001,图5C)195例前列腺癌(第页= 0.19,第页= 0.007,图5D). 总之，这些结果表明FLI1调节SLFN11型不仅在ES中表达，在其他儿童癌症、白血病、乳腺癌和前列腺癌中也表达。

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之间的相关性SLFN11型和FLI1公司在Broad Institute癌症细胞系小组（CCLE）中的表达SLFN11型和FLI1公司和ETS1型在临床肿瘤样本中。散点图显示了SLFN11型（x轴，对数2归一化强度）和FLI1公司表达式（y轴，对数2归一化强度）(A类)，在结肠癌、乳腺癌和前列腺癌的TCGA样本中(B类–D类).E–F，之间的相关性SLFN11型（x轴，对数2归一化强度）和ETS1型表达式（y轴，对数2标准化强度）。n、 样本数量；第页，相关系数。缩写：CLL，慢性淋巴细胞白血病；急性髓细胞白血病；慢性粒细胞白血病。

ETS1型和SLFN11型乳腺癌和前列腺癌的共表达

检查其他ETS转录因子(12)可能会调节SLFN11型我们测试了27个ETS成员的表达水平与SLFN11型在NCI-60癌细胞系中（CellMiner工具：http://discover.nci.nih.gov/cellminer网站) (32,33).ETS1型,FLI1公司,ETV4型、和肠出血性（EHF）与SLFN11型NCI-60癌细胞株面板基因表达数据集中的表达(|第页| > 0.43,第页< 0.05,表1). ETS成员相关性分析的扩展SLFN11型在CCLE数据集中FLI1公司,ETS1型,ERG公司,SPI1号机组,ELF3级,ETV4型、和肠出血性（EHF）具有SLFN11型(|第页| > 0.20,第页< 0.01,表1).ETS1型，也与SLFN11型在乳腺癌的TCGA数据集中(第页= 0.43,第页< 0.0001;图5E)和前列腺癌(第页= 0.54,第页< 0.0001;图5F).

表1

NCI-60和CCLE基因表达数据集中ETS家族成员与SLFN11表达的相关性分析。

NCI60型*CCLE公司*
基因
符号		相关性
系数		基因
符号		相关性
系数
ETS1型0.44†FLI1公司0.39‡
FLI1公司0.43†ETS1型0.22‡
ETV6发动机0.37ERG公司0.21‡
ELK3公司0.33SPI1号机组0.20‡
ERG公司0.23ETV6发动机0.18
欧洲复兴基金会0.21ELF2级0.18
ELK4（英语四级）0.20ELK3公司0.16
ELF2级0.20GABPA公司0.15
GABPA公司0.11ELF1级0.13
ELF4级0.08ELK4（英语四级）0.10
SPI1号机组0.06ELF4型0.09
ETV1型0.03上海浦东国际机场0.06
预计技术成熟度50.01ETS2公司0.05
ETS2公司−0.03预计技术成熟度50.03
ELK1型−0.07SPIB公司0.03
ELF1级−0.07欧洲电视台70.03
欧洲电视台7−0.09ELK1型0
ELF5级−0.13ETV1型−0.03
香料−0.13FEV公司−0.03
SPDEF公司−0.23ETV2型−0.08
ETV3型−0.24ELF5级−0.09
ETV2型−0.26ETV3型−0.09
FEV公司−0.29欧洲复兴基金会−0.10
ELF3型−0.34SPDEF公司−0.16
SPIB公司−0.41超高频−0.25‡
肠出血性（EHF）−0.43‡ETV4型−0.25‡
ETV4型−0.44‡ELF3级−0.26‡
*，ETS基因通过降低皮尔逊相关系数进行排序；
†，皮尔逊|第页| > 0.43,第页<0.05（经Bonferroni调整）；
‡，皮尔逊|第页| > 0.20,第页<0.01（Bonferroni调整）。

启动子萤光素酶报告基因分析用于测试ETS1和SLFN11型表达式。图6显示ETS1能够激活SLFN11型293T细胞中的启动子(图6A). 此外，SLFN11型通过改变ETS一致序列，启动子活性降低SLFN11型启动程序（参见图1A). 突变体mt+91约减少80%，mt+201突变体约减少60%(图6B)，表示中的位置+91和+201SLFN11型启动子对ETS1介导的SLFN11型最后，siRNA-介导ETS1型敲除抑制乳腺癌细胞系Hs 343.T中SLFN11在RNA和蛋白质水平的表达，并导致对喜树碱治疗的耐药性(图6C-E). 这些结果与ETS1在调节SLFN11型拓扑异构酶I抑制剂在乳腺癌中的表达和敏感性。

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的规定SLFN11型ETS1表达。(A类)将荧光素酶质粒转染293T细胞SLFN11型在测量荧光素酶活性之前，启动子加上ETS1表达质粒（深灰色）或加上空白对照质粒（浅灰色）24小时。y轴代表相对于对照（对照）的启动子活性。(B类)用ETS1表达质粒加野生型转染293T细胞SLFN11型启动子（WT）或突变SLFN11型启动子（mt+91、mt+181或mt+201）作用24h后，测定荧光素酶活性。(C类)mRNA水平ETS1型和SLFN11型在乳腺癌细胞系Hs 343.T中转染ETS1 siRNA或非靶向siRNA（对照）。y轴表示标准化为控件的相对表达式。(D类)转染ETS1 siRNA或非靶向siRNA的Hs 343.T中ETS1和SLFN11的蛋白水平（对照）。GAPDH（37 kDa）用作负荷控制。(E类)转染Hs 343.T细胞ETS1型用喜树碱处理siRNA（实心环，siETS1）或非靶向siRNA（siControl，实心环）2天，然后评估细胞活性。三个独立实验的代表性结果一式三份，显示为平均值±标准偏差*，第页< 0.05; **,第页<0.001乘以t吨测试。

讨论

最近的研究表明，SLFN11的高表达增强了癌细胞对广泛的DNA损伤剂的反应(4,5,7). 然而，在本研究之前，还没有关于SLFN11型在癌细胞中(34). 我们的研究表明EWS-FLI1是SLFN11型ES中的表达式。与SLFN11型，我们发现其他3个人类Schlafen基因SLFN5型,SLFN12型和SLFN13型与不相关FLI1公司在NCI-60和CCLE数据集中的表达，表明FLI1特异性调节SLFN11型，但不是另一个的表达SLFN公司尽管基因在人类染色体17q12上的位置相同(2).

我们的研究还证明了EWS-FLI1诱导的参与SLFN11型ES细胞对喜树碱和PARP抑制剂与替莫唑胺联合作用的反应中的表达表明SLFN11型这种表达可能对DNA损伤剂更敏感。ES肿瘤最初对化疗有反应；然而，30%的患者复发，化疗敏感性相对较低，长期生存率低于20%(35). 因此，需要进一步研究SLFN11在复发性ES肿瘤中的表达或功能是否受到抑制。

EWS-FLI1被认为是治疗ES的治疗靶点EWS-飞行1通过反义cDNA或siRNA抑制ES细胞的生长和侵袭性(36,37). 最近，trabectedin，一种海洋生物碱，在鸟嘌呤N2处使DNA烷基化并毒化转录偶联修复(38,39)已证明干扰EWS-FLI1的活性并逆转EWS-FLI介导的基因表达特征(29). 此外，trabectedin通过抑制EWS-FLI1介导的Werner综合征解旋酶（WRN）的表达，与临床喜树碱衍生物SN-38在ES细胞中表现出协同作用，WRN的缺乏会导致细胞对喜树碱的超敏反应(40,41). 我们的实验表明EWS-飞行1降调节素SLFN11型表达，从而降低癌细胞对喜树碱和PARP抑制剂-三唑胺组合的敏感性。因此，开发SLFN11活化剂可以被视为组合疗法的理论基础，以提高DNA损伤剂的疗效。根据我们未公开的数据，二甲基试剂氮杂胞苷能够重新激活SLFN11型甲基化在癌细胞中的表达SLFN11型启动子，提供了一种在临床环境中激活SLFN11表达的途径。

除EWS-FLI1外，约5-10%的ES中还发现了将EWSR1与另一ETS转录因子ERG1（EWS-ERG）融合的染色体易位（21；22）（q22；q12）(42–44). ERG和FLI1都属于ETS转录因子家族中的ERG亚家族，具有相似的DNA结合结构域(12). 为了了解SLFN11在EWS-ERG表达细胞中的表达是否也被激活，我们比较了25个ES细胞株与EWS-FLI1和4个ES细胞系与EWS-ERG-表达细胞中SLFN1的水平，发现EWS-FLI和EWS-ERG表达细胞之间SLFN1表达没有差异(补充图S1). 另一种染色体易位，编码融合蛋白TMPRSS2-ERG，在大约40%的前列腺癌中发现(45). 有趣的是，在分析TCGA前列腺癌数据集时，我们没有观察到SLFN11型和电子邮箱（未显示数据），表示SLFN11型表达可能需要ETS转录因子以外的其他蛋白。

在这项研究中，我们还确定ETS1，如FLI1，是SLFN11型在乳腺癌中的表达。ETS1在乳腺癌的进展中起着重要作用(46)最近与癌症中的RAS/ERK途径有关(47). 博内蒂等。最近证实FLI1和ETS1共同促进弥漫性大B细胞淋巴瘤的生长，并影响与生发中心分化相关的基因表达(48). 此外，由于FLI1公司和ETS1型在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，11q24.3的增加可能导致FLI1和ETS1的表达(48). 我们的发现表明FLI1公司和ETS1型与SLFN11型在NCI-60和CCLE数据集以及TCGA的乳腺癌、结肠癌和前列腺癌数据集中表达。我们还观察到FLI1公司和ETS1型在乳腺癌和前列腺癌的数据集中(补充图S2). 有必要进行进一步研究，以了解FLI1和ETS1是如何共同调节或相互调节的。

总之，我们的发现揭示了SLFN11型以及ETS转录因子，它们在癌症和自身免疫疾病中通常上调。我们的研究还强调了SLFN11、FLI1和ETS1作为DNA损伤剂和PARP抑制剂与替莫唑胺组合的预测基因组生物标记物的潜在重要性。

​

翻译相关性声明

DNA损伤剂，如拓扑异构酶I抑制剂，广泛用于人类癌症的治疗。新的研究表明，聚（ADP）-核糖聚合酶（PARP）抑制剂与替莫唑胺联合治疗尤因肉瘤（ES）具有协同作用。最近，SLFN11被认为是癌细胞敏感性的预测因子，重要的是，SLFN11能够使癌细胞对DNA损伤剂敏感。在这里，我们展示了这一点SLFN11型表达由ETS转录因子EWS-FLI1和ETS1转录激活。SLFN11型可能是ES患者无瘤生存的预后标志。我们的结果进一步表明EWS-FLI1激活SLFN11型表达使ES细胞对喜树碱和PARP抑制剂加替莫唑胺组合敏感，表明SLFN11与ETS-过度表达癌症对DNA损伤剂的敏感性相关。

补充材料

1

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2

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致谢

这项工作得到了癌症研究中心、NCI校内项目（Z01 BC 006150）的支持。我们感谢Heinrich Kovar博士（奥地利维也纳St.Anna Kinderkrebsforschung儿童癌症研究所）为A673细胞提供针对EWS-FLI1的强力霉素诱导的shRNA，以及Suzanne Baker博士（田纳西州圣犹德儿童研究医院发育神经生物学系）用于EWS-FLI1表达质粒。

脚注

作者报告没有利益冲突。

工具书类

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