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科学代表。2015; 5: 13986.
2015年9月11日在线发布。 数字对象标识：10.1038/代表13986
预防性维修识别码：项目经理4566084
PMID：26358513

Endofin，一种新的铁调节激素铁调素的BMP-SMAD调节因子

贾斯汀·B·高,1,2 丹尼尔·华莱士,1,2 Wanjin Hong公司,三和V.内森·苏布拉曼尼亚a、，1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

BMP-SMAD信号在许多生物过程中起着关键作用，包括胚胎发育和铁稳态。铁调节激素hepcidin的失调与许多临床铁相关疾病有关。我们假设，介导BMP-SMAD信号的分子在调节铁稳态中发挥重要作用，这些蛋白中的变体可能是铁相关疾病的潜在遗传修饰物。我们检测了SMAD锚定物endofin的作用，发现肝细胞中endofin敲低抑制了基础和BMP诱导的hepcidin表达以及其他BMP调节基因，标识1和SMAD7系列。我们首次展示了就地内切芬与SMAD蛋白的相互作用以及通过内切芬敲除显著降低SMAD磷酸化，表明内切芬通过BMP-SMAD信号调节庚肽。天然存在的SNPs的特征表明，保守的FYVE结构域中的突变导致内鳍定位错误，可能影响下游信号传导和调节铁调素的表达。总之，我们已经确定了BMP-SMAD信号通路与hepcidin表达调控和铁稳态之间迄今尚未认识到的联系，即内切酶。这项研究进一步定义了铁调节的分子网络，并为铁相关疾病的治疗提供了潜在的靶点。

转化生长因子-β（TGFβ）家族由33个结构相关的生长因子组成，包括TGFβ和骨形态发生蛋白（BMPs），它们调节多种细胞反应，如增殖、分化和凋亡1,2,三,4TGFβ家族成员与细胞膜上两种不同的丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，称为I型和II型受体5,6在配体结合后，II型受体磷酸化甘氨酸-氨基酸（GS）结构域的I型受体，导致受体调节的小母亲磷酸化和激活，以对抗十脑停搏（R-SMAD）7,8TGFβ和激活素信号激活R-SMAD:SMAD2和SMAD3，而BMP信号激活SMAD1、SMAD5和SMAD89,10在转移到细胞核以激活各种靶基因的转录之前，R-SMAD随后与共同介体SMAD（SMAD4）形成异型复合物11.

SMAD锚是最近鉴定的衔接分子，可促进TGFβ受体和SMAD蛋白之间的相互作用，增强信号转导和靶基因的表达12,13TGFβ信号由SMAD受体激活锚（SARA）介导，而BMP途径中的信号由内体相关FYVE域蛋白（endofin）介导14内啡肽，由ZFYVE16型基因，包含一个保守的双锌指，即FYVE（Fab-1、YGL023、Vps27和EEA1）结构域14,15FYVE结构域是富含半胱氨酸的锌2+具有基本基序的结合域，与磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）结合，PI3P是早期内体中高度富集的脂质16,17因此，FYVE结构域负责将内脏定位到内脏小泡，这对于其将SMAD运输到早期内脏小体中内化的BMP受体的功能很重要14与之前报道的C753S突变一样，干扰FYVE域，使内脏定位错误，并减弱BMP信号13,14.

TGFβ超家族信号传导的中断与癌症、心血管、纤维化和骨骼疾病有关18BMP-SMAD信号也通过调节hepcidin（一种由HAMP公司基因，负责调节血清铁水平。大多数铁紊乱与庚西啶的失调有关。由于庚肽缺乏导致的铁超载会导致膳食铁的过度吸收，并可能导致组织和器官损伤19相反，过量的铁调素限制了饮食中的铁吸收和巨噬细胞的铁循环，限制了铁对红细胞前体的可利用性，最终导致铁限制性贫血。因此，hepcidin的调节在许多层面上都受到严格控制。这包括与跨膜BMP受体结合的BMP，该受体由血球蛋白（HJV）促进，血球蛋白是一种增强BMP信号传导以诱导转录的共受体HAMP公司以及其他BMP调节基因，如标识1（DNA结合蛋白1抑制剂）和SMAD7系列（SMAD家族成员7）20,21,22.

我们假设内切芬在调节庚啶中起着重要作用，因为它在BMP-SMAD信号传导中已被证明是重要的。在这项研究中，我们研究了内啡肽在BMP-SMAD通路中庚啶调节中的潜在作用。此外，我们对影响内切芬保守FYVE结构域的自然发生的SNP进行了表征，以阐明内切芬多态性对BMP信号和hepcidin调节的潜在影响。我们的发现进一步明确了参与铁调节的分子网络，为治疗铁相关疾病和BMP相关疾病提供了潜在靶点。

结果

内皮素敲除下调基础庚肽表达

为了确定内啡肽在hepcidin调节中的作用，我们首先通过用非特异性siRNA或内啡肽特异性siRNA处理人类肝细胞系HepG2/C3A来检测调节内啡肽水平的作用。细胞与siRNA孵育24小时至96小时小时。我们观察到，通过定量实时PCR（qPCR）测量的内啡肽表达与对照组相比显著降低(图1a). 在所有时间点，内皮素表达均显著下降，24小时时约为对照水平的50%（p=0.006），72小时时最多下降70%（p<0.001）。在转染后96小时内，内皮素表达仍然有效降低。

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内皮素沉默与基础庚肽表达减少相关。

HepG2/C3A细胞转染非特异性siRNA（si-NS，白条）或内切酶siRNA（si-endofin，黑条）24～96小时(一)ZFYVE16型（内啡肽）(b条)HAMP公司, (c（c）)标识1和(d日)SMAD7系列通过qPCR测量并归一化为参考基因的几何平均值ACTB公司和高效放射治疗数据代表三个独立的生物实验。条形图表示三倍的平均值±标准误差。P（P）-使用双向方差分析计算相对于si-NS对照组的内切酶敲除值*表示第页-值<0.05**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.

在内脏被击倒后，我们观察到基底部HAMP公司所有时间点C3A细胞中的表达(图1b). 与内鳍相似，HAMP公司72小时时表达量最大（p<0.001），降至对照水平的10%，96小时时仍保持下降（p<0.00）。

BMP调节基因分析，标识1和SMAD7系列，在其启动子中含有BMP响应元件，表明在endofin敲低后基础水平降低，尽管降低的量小于HAMP公司仅在72小时（p<0.001）和96小时（p<0.001）的时间点具有统计学意义(图1c、d).

骨形态发生蛋白6对hepcidin的诱导被内切酶敲除中断

接下来，我们分析了BMP6在缺乏内切芬的情况下调节庚肽的能力。将C3A细胞与对照和内鳍特异性siRNA孵育72小时，随后用BMP6处理。浓度为1、10或100 ng/ml的BMP6处理量增加4小时HAMP公司表达量分别约为10倍、60倍和100倍。无论BMP6如何处理，经内切酶特异性siRNA处理的细胞内切酶表达均显著降低（p<0.001）(图2a). 尽管BMP6诱导了HAMP公司在所有浓度下，我们观察到内脏沉默后高达90%的表达降低(图2b). 这一减少HAMP公司内切酶敲除后的表达与未经处理的C3A细胞中观察到的表达相似，约为非特异性siRNA控制水平的10%。

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BMP诱导的HAMP公司,标识1和SMAD7系列内脏击倒后水平降低。

C3A细胞转染非特异性siRNA（si-NS，白条）或内切酶siRNA（si-内啡肽（黑色条）72小时，用BMP6以1、10或100 ng/ml的剂量处理4小时(一)ZFYVE16型（内啡肽）(b条)HAMP公司, (c（c）)标识1和(d日)SMAD7系列通过qPCR测量并归一化为参考基因的几何平均值ACTB公司和高效放射治疗数据代表三个独立的生物实验。条形图表示三倍的平均值±标准误差。P（P）-使用双向方差分析计算数值*表示第页-值<0.05**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.

BMP调节基因标识1和SMAD7系列在endofin敲除和BMP6处理后也受到抑制。尽管如此，BMP6的诱导作用和内切酶敲除后的抑制作用的幅度小于HAMP公司表达式(图2c、d).

Duolink邻近连接分析显示就地SMAD1与内酯而非SARA的相互作用

为了评估内切芬是否通过BMP-SMAD信号通路调节hepcidin，我们使用邻近连接分析（PLA）分析了SMAD1与内切芬的相互作用。PLA是一种新技术，允许就地蛋白质相互作用的检测。PLA利用抗体识别与PLA探针结合，PLA探针以斑点的形式产生局部信号，从而揭示接近的蛋白质（<40 nm）。在该测定中，我们使用SMAD锚定的SARA和SMAD2/3作为对照，它们是TGFβ的密切相关的信号传导成分，但不是BMP途径。在处理PLA之前，用myc标记的内酯或myc标记SARA构建物转染C3A细胞48小时。

通过PLA，我们观察到内源性SMAD1蛋白与内切酶的相互作用，该蛋白定位于细胞的细胞质区域(图3). 我们发现，尽管观察到的信号点较少，但内翅片也与SMAD2/3相互作用。我们表明，SARA只与SMAD2/3交互，而不是SMAD1(图3). 这些相互作用仅在转染的细胞中观察到，表明该测定的特异性。与单个抗体孵育的细胞显示出低信号或无信号，并用于评估背景信号(图3).

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近端连接实验表明，内脏而非SARA与SMAD1相互作用。

在用myc、SMAD1和SMAD2/3总抗体处理PLA之前，用myc标记的内切酶或myc标记SARA质粒转染C3A细胞48小时。作为阴性对照，C3A细胞与一种抗体孵育（顶面板），对于阳性对照，我们使用形成同源二聚体的内源性TfR1。剩下的面板显示了用两种抗体培养的细胞，以评估SMAD锚定和SMAD蛋白的相互作用。PLA实验后，用抗鼠二级抗体培养细胞，以鉴定转染细胞（左面板）。中间面板显示了SMAD锚定和SMAD相互作用的PLA评估，右侧面板显示了合并的免疫荧光（IF）和PLA图像。细胞核用DAPI染色，如中间和右侧面板所示。数据代表了三个独立的生物实验。比例尺代表20μm。

SMAD1/5/8磷酸化随着内切酶敲除而降低

为了确定内切芬是否通过BMP-SMAD信号通路调节hepcidin表达，我们分析了内切芬击倒后SMAD1/5/8蛋白的磷酸化。将C3A细胞敲除内脏，用BMP6（10 ng/ml）处理4小时HAMP公司,标识1和SMAD7系列通过qPCR检测BMP调节基因转录的下游效应。

在用内切酶特异性siRNA处理72小时后，免疫印迹显示BMP6处理和未处理C3A细胞中的内切酶蛋白水平降低(图4a、b). 如前所述，我们观察到用BMP6处理的细胞中SMAD1/5/8磷酸化显著增加（p<0.001）23与BMP6处理（p=0.022）和未处理C3A细胞（p=0.016）的对照组相比，内切芬的敲除导致SMAD1/5/8磷酸化显著降低(图4c). 内皮素mRNA水平下降，这与内皮素蛋白水平下降相对应(图4d). 与相同细胞中SMAD1/5/8磷酸化的减少一致，HAMP公司,标识1和SMAD7系列内脏蛋白敲除后，mRNA显示基础和BMP诱导的水平降低(图4e–g).

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内啡肽沉默降低SMAD1/5/8蛋白的磷酸化。

在用BMP6（10 ng/ml）处理4小时之前，用非特异性siRNA（si-NS）或内切酶特异性siRNA（si-endofin）转染C3A细胞72小时(一)收集细胞，用抗内切芬、磷酸-SMAD1/5/8抗体对裂解产物进行免疫印迹。β-actin作为负荷对照。扫描胶片上显影的色带，用密度测定法定量内脏的含量(b条)和pSMAD1/5/8蛋白(c（c）)使用GeneGenius成像系统相对于肌动蛋白。mRNA表达(d日)ZFYVE（采埃孚）（内啡肽）(e（电子）)HAMP公司, (（f）)标识1和(克)SMAD7系列通过qPCR测量并归一化为参考基因的几何平均值ACTB公司和高效放射治疗数据代表三个独立的生物实验。条形图表示三倍的平均值±标准误差。P（P）-使用双向方差分析计算相对于si-NS对照组的内切酶敲除值*表示p值<0.05**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.

FYVE域中的多态性影响正确的内鳍定位

由于内脏蛋白表达的减少调节了庚肽水平，这反过来又会导致体内铁水平的增加，我们推断，影响内脏蛋白定位或功能的单核苷酸多态性（SNPs）可能具有类似的作用。我们通过SNP数据库搜索确定了自然发生的内鳍SNP变体，并使用SIFT（从耐受性中筛选不耐受性）和PolyPhen-2（多态性表型v2）进行分析蛋白质预测工具，用于确定潜在的有害突变，并通过HA-epitope标记的内环结构物的定点突变产生这些突变。这些被瞬时转染到C3A细胞(图5a、b).

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破坏内脏保守FYVE结构域的突变会导致定位错误。

通过定点突变产生含有六个经鉴定为潜在有害的天然内啡肽的质粒构建物，并转染到C3A细胞中。48小时后，用抗HA抗体对细胞进行免疫染色（第一列）。细胞也用细胞器标记物EEA1和ERp57进行免疫染色，如第二列所示。细胞核用DAPI染色，如第三列所示，第三列是第一和第二面板的覆盖层。(一)FYVE域（红色矩形）的内脏蛋白结构示意图，并绘制了非同义（方框）和移码（三角形）突变。(b条)Western blotting显示了含有非同义和移码SNP的蛋白质的相应大小以及提前终止密码子。(c（c）)面板显示，C3A细胞转染了不受FYVE结构域影响的内脏SNP变体。(d日)面板显示转染SNP变体的C3A细胞影响FYVE域。数据代表了三个独立的生物实验。比例尺代表20μm。

通过免疫荧光和共焦显微镜分析细胞内内皮素的表达，以确定SNP对内皮素定位的影响。我们在细胞质中观察到内源性内切酶作为类似内切酶体的囊泡状结构。利用内体标记物早期内体抗原1（EEA1）进行的共定标研究显示了一定程度的重叠(图5c). 用野生型HA表位标记的内鳍构建体转染显示出类似的定位模式，与内源性内鳍相比，一些囊泡被注意到稍微增大。三种内鳍变体（E1431Q、T1519N和T928Y）的分析英尺*8） 所有具有完整FYVE结构域的细胞都显示出类似于野生型结构体的内体定位模式。然而，一个非同义突变（R766G）和两个移码突变（K325Q）英尺*4和N729K英尺*19） FYVE结构域被破坏，显示出弥散的细胞质定位模式。与ER标记ERp57的共校准显示出一定程度的重叠(图5d). 在带有HA标记的内切酶-C753S突变体中也观察到了类似的ER定位，该突变体也有一个FYVE结构域被破坏，并且之前已经证明会导致蛋白质的错误定位14,24.

D类震荡

先前的研究表明，内酯通过将SMAD蛋白锚定到BMP受体来增强BMP-SMAD信号。在这里，我们通过介导BMP-SMAD通路中的SMAD1/5/8磷酸化，确定了内切芬是调节庚啶所需的一种新的信号成分。我们还表明，影响内脏定位的变体可能会影响hepcidin的表达，并可能作为铁超载的遗传修饰物发挥作用。

用特异性siRNA敲低内切芬导致基底庚肽表达下调。内切酶的敲除也导致BMP调节基因的下调，标识1和SMAD7系列，表明内啡肽对BMP-SMAD途径中基因的基本表达至关重要。我们的结果支持先前的研究，其中发现一种突变和非功能形式的内啡肽，即FYVE（C753S）突变体，转染到小鼠成肌细胞C2C12细胞中，可降低BMP反应报告基因的表达13相反，野生型的稳定结构略微增强了报告基因的表达。

一些BMP已被证明能诱导hepcidin的表达在体外25,26,27只有BMP6被发现是庚西啶和铁的重要且非冗余的调节器体内25为了确定endofin是否调节BMP诱导的铁调素表达，我们沉默endofin并检测BMP6处理的C3A细胞中铁调素的表达。尽管用BMP6诱导了100倍的hepcidin，但与对照组相比，我们观察到hepcidin的表达受到抑制，这表明内啡肽对BMP调节hepcidin很重要。内皮素在调节骨形态发生蛋白信号中的重要性之前已经被证明体内在里面爪蟾胚胎，内脏调节BMP诱导的中胚层模式，其特征是早期中胚层标记物Xbra、Xhox3和Xwnt8的表达增加。FYVE（C753S）突变体的表达显示，尽管BMP刺激，但中胚层标记物的表达降低，这表明内啡肽是BMP信号传递所必需的13.

已知SMAD锚通过与TGFβ受体相互作用和定位SMAD蛋白来介导TGFβ信号传导。然而，最近通过联合免疫沉淀（co-IP）的研究结果表明，它们对该途径是不必要的28,29。我们首次演示了就地内膜和SARA分别与SMAD1和SMAD2/3相互作用。这验证了之前关于SMAD锚在介导TGFβ信号传导中的作用的报告12,13,30,31此外，我们发现内鳍的相互作用类似于SMAD2/3，这表明内鳍可能在BMP和TGFβ信号通路中发挥作用。这之前在人类胚胎肾细胞系HEK293T和其他人类肝细胞系Hep3B和HepG2中显示32.

为了确定endofin调节铁调素的潜在机制，我们研究了endofin沉默对SMAD激活的影响。SMAD1/5/8蛋白是受体调节的SMAD，将BMP信号从膜受体传递到细胞核并激活BMP应答基因的表达。我们观察到，在BMP6处理和未处理的对照细胞中，内切芬的敲除导致SMAD1/5/8磷酸化降低。相对hepcidin mRNA表达的测量结果表明，内切酶敲除后，其表达下调，这表明内切酶介导SMAD1/5/8磷酸化，随后影响HepcidinmRNA的表达。这与之前的研究结果类似，内啡肽通过与不同SMAD的相互作用促进BMP调节基因的表达。研究表明，内皮素通过与未磷酸化的SMAD1相互作用并将SMAD1锚定到BMP受体以激活，从而增强BMP-SMAD信号13Endofin还通过与SMAD4相互作用增强BMP-SMAD信号传导，招募SMAD4到激活的SMAD，以介导SMAD复合物的形成32这些SMAD复合体然后穿梭到细胞核，诱导靶基因的转录。

编码hepcidin或其调节因子的基因的有害突变会导致hepcidine的生产失调，并导致铁稳态的遗传障碍。由于内切芬能够调节hepcidin的表达，我们进行了进一步的研究，以确定内切芬是否是铁相关疾病的潜在遗传修饰物。使用蛋白质预测工具分析SNP数据库中的内啡肽变体，如HAPMAP、1000基因组计划和NCBI dbSNP；我们确定了六种可能有害的变体。通过间接免疫荧光鉴定表明，内酯的FYVE结构域对其定位于内酯体很重要。FYVE结构域完整的内啡肽SNP变异体显示出与野生型和内源性内啡肽相似的内啡体定位模式。然而，在保守FYVE结构域中包含提前终止密码子或非同义突变的变体显示出类似ER的扩散定位模式。这些FYVE-结构域变体的定位与先前报道的合成突变FYVE（C753S）一致，该突变也破坏了FYVE的结构域14由于FYVE结构域在将SMAD招募到早期内吞小室中至关重要，因此它可能会影响内切芬的SMAD转运功能并破坏庚肽转录15先前的研究发现FYVE结构域的破坏与膜转运的延迟、SMAD活性的降低和BMP信号的衰减有关13,14,32因此，内啡肽可能在铁相关疾病中起到遗传修饰作用，如由高频电子设备C282Y，尽管纯合子突变，仍显示表型变异。因此，评估体内自然发生的内啡肽单核苷酸多态性与导致铁相关疾病的其他基因突变的影响。内皮素中的单核苷酸多态性与银屑病的易感性有关，银屑病是一种TGFβ和SMAD信号转导的疾病33,34然而，在研究铁参数变化的全基因组关联研究中，还没有观察到内脏SNP35,36.

由于内皮素参与了内胚体的运输，目前尚不清楚内皮素是否特异性调节BMP-SMAD信号通路。在以往的研究中，内啡肽被描述为与其他信号通路相关，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和密切相关的TGFβ-SMAD信号通路24,32Endofin是A431细胞中EGF信号传导的酪氨酸靶点37在HeLa细胞中表达带有突变的Y515酪氨酸磷酸化位点的内皮素结构物增强了ERK2磷酸化，表明内皮素在调节MAPK/ERK信号通路中起作用24在另一项研究中，内啡肽通过与TGFβI型受体相互作用影响TGFβ-SMAD信号通路32此外，Hep3B细胞内切芬的敲低减弱了SMAD2应答基因的表达32然而，该研究还报告称，内皮素对TGFβ-SMAD信号传导的影响是特异性的，并不影响BMP或Wnt信号传导。未来的工作包括进一步表征由内酯调节的特定信号通路。

总之，我们已经确定内切芬是基础和BMP诱导的庚肽表达所需的重要信号成分。内啡肽通过调节SMAD1/5/8磷酸化来影响庚肽的表达，SMAD1/8/8磷酸化是庚肽转录的核心(图6). 内切芬迄今未被认识的作用的鉴定进一步阐明了参与七肽调节的分子网络，这可能有助于铁相关疾病的管理。

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内酯通过BMP-SMAD途径调节庚啶的示意图。

在BMP配体结合后，II型受体在甘氨酸-氨基酸结构域磷酸化I型受体，导致其活化，R-SMAD磷酸化，SMAD1/5/8，随后与SMAD4形成杂合物，然后转移到细胞核以激活庚啶的转录。Endofin将SMAD招募到BMP受体，调节SMAD1/5/8磷酸化，从而调节hepcidin的表达。

材料和方法

细胞培养

HepG2/C3A肝癌细胞（分类号CRL-10741，ATCC，Manassas，VA，USA）保存在含有10%FCS的最低必需培养基（MEM）中。

DNA和小干扰RNA（siRNA）构建物的转染

转染

C3A细胞生长在12孔簇板中（~4 cm2)到转染前的80-90%融合。pDHA-Neo-Endofin质粒，如前所述14根据制造商的建议，使用Lipofectamine 3000（澳大利亚马尔格雷夫生命科技公司）转染。将细胞与DNA脂质体胺复合物（100μl/孔）一起孵育48小时。

siRNA转染

对C3A细胞进行计数，并在12孔簇板（~4 cm）中生长到30-40%的汇合处2)在与Lipofectamine RNAiMAX（Life Technologies）复合物中转染20 pmol的非特异性或内皮siRNA（GenePharma，中国上海）之前。使用的siRNAs序列如下：非特异性（si-NS）正向5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和反向5′-ACGUGACACGGGAGAATT-3′，内切酶（si-内啡肽)正向5′-GGGCAAGACUUAGAUUACUCTT-3′和反向5′-AGUAAUCUAAGUCUGCCTT-3’。简单地说，将siRNAs稀释在50μl Opti-MEM中并轻轻混合。随后，将2μl Lipofectamine RNAiMAX在50μl Opti-MEM中稀释并轻轻混合。轻轻混合siRNA-脂质体复合物，并在室温下培养5-10分钟。随后将复合物（100μl）添加到每个细胞孔中，并在收获前培养72小时。

mRNA转录物的实时PCR分析

根据制造商的建议，使用Trizol试剂（Life Technologies）从细胞中分离出总RNA。使用Superscript III（生命技术）将RNA（1μg）反转录成cDNA。如前所述，在Viia7实时PCR系统（Life Technologies）上进行反应38中描述了用于检测mRNA转录物的引物对表1.所有靶点均归一化为参考基因的几何平均值，ACTB公司和高效放射治疗使用2-ΔCT.

表1

用于qPCR的引物对的序列。
基因底漆顺序
ACTB公司(β-肌动蛋白)F类CAGGCACCAGGGCGTG公司
R（右）GCCCACATAGGAATCCTTCTGA公司
HPRT1型F类GAAAGGGTTTATTCCAT公司
R（右）CCCATCTCCTTCATCACAT公司
HAMP公司 （Hepcidin）F类中国民航总局
R（右）AAAATGCAGATGGAAGAGAGAGTGTG
标识1F类TGGAGCTGAACTCGGAATCCG公司
R（右）GACACAAGATGCGATCTCCG公司
SMAD7系列F类TCACCTTAGCGCGACTCTGCG公司
R（右）GTTTCAGCGGAGGAGGCAC公司
ZFYVE9系列 （SARA）F类CTGTGCTTCCTGCTGTAGCCTGAAA公司
R（右）TTAGGGCTCTGTGGCACT公司
ZFYVE16型 （内啡）F类ATGGCTTTAGTGCTGCGCTGT
R（右）AGGCAGAGTTGGCCTCAGATCC公司

近端连接分析（PLA）

本实验使用小鼠/兔子红色启动剂Duolink试剂盒（Sigma-Aldrich）。HepG2/C3A细胞接种于10×10412孔簇板中每孔的细胞数并转染pDMyc-Neo-Endofin14或pDMyc-Neo-SARA14如上所述的质粒。如前所述，将细胞固定并渗透39.渗透后，在37°C的加湿室中，在封闭缓冲液（随试剂盒提供）中培养细胞1小时。接下来，在室温下将细胞与抗体稀释液中稀释的初级抗体孵育1小时。使用的主要抗体包括小鼠抗Myc 9B11抗体（1:2000；细胞信号技术）、兔抗SMAD1抗体（1:50；生命技术）、家兔抗SMAD2/3抗体（1:800；细胞信号科技）、小鼠抗TfR1抗体（1:500；生命科技）和兔抗TfR1抗体（1:100；英国剑桥Abcam）。然后在缓冲液A（随试剂盒提供）中清洗细胞2次，每次5分钟，并在37°C的加湿室中用PLA探针培养1小时。在37°C下在潮湿室中连接步骤之前，在缓冲液A中洗涤细胞2次，每次5分钟，持续1小时。在2次2分钟洗涤后，将细胞与扩增混合物在37°C的黑暗增湿室中培养2小时。细胞用1×缓冲液B（随试剂盒提供）清洗2次，每次10分钟，然后用0.01×缓冲液B清洗1分钟，然后使用试剂盒提供的安装介质安装在盖玻片上。

蛋白质印迹

细胞裂解物在磷酸酶抑制剂裂解缓冲液中进行匀浆，并按照前面所述进行蛋白质印迹40.斑点与抗体孵育：抗内皮素14（1:30000）、抗磷酸-SMAD1/5/8（1:3000；Cell Signaling Technology，Danvers MA，USA）、抗HA 12CA5杂交瘤上清液（1:2000；ATCC，Manassas，VA，USA，1:2000；Sigma-Aldrich，Missouri，USA。使用Scanmaker 9800 XL plus（台湾新竹Microtek International Inc.）扫描胶片上显影的色带，然后使用GeneGenius成像系统（英国剑桥Syngene）通过密度测定进行量化。

突变

通过SNP数据库搜索确定了内啡肽变体(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)并使用从容忍度中分类不容忍度（SIFT；网址：http://sift.jcvi.org/)和多态性表型v2（PolyPhen-2；http://genetics.bw.harvard.edu/ph2/)程序。根据这些程序的预测，选择了六个具有潜在有害突变的变体（rs13157990、rs61741923、rs16877836、rs35915800、rs34397330和rs35033083）进行突变。所有设计用于引入定点突变的引物均由Integrated DNA Technologies（IDT，Coralville，Iowa）合成。将突变引入pDHA中带有HA标记的内酯结构14使用中列出的引物表2根据Scott的说法，然后进行了突变等。41变化如下：PCR混合物包含75 ng模板质粒DNA、每个寡核苷酸2μM、2 mM dNTPs、50 U KOD DNA聚合酶（澳大利亚维多利亚州默克化学公司）和聚合酶缓冲液，总体积为50μl。PCR在以下条件下进行；在95℃下变性2分钟，然后在95℃变性20秒，在58℃下退火10秒，在68℃下延伸5分钟。对内脏插入物进行测序，以确保产生的突变存在，并且在突变过程中没有插入其他无意的序列变化。

表2

用于定点诱变的寡核苷酸引物。
SNP标识底漆顺序
rs13157990 R766GF类TTACTTTACCAACGG公司G公司GACACCATTGCCGAGCA公司
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突变碱基用粗体表示。

间接免疫荧光显微镜

培养的细胞在玻璃盖玻片上生长过夜，并按前面所述准备免疫荧光42用于评估表达的主要抗体是兔抗内皮素14（1:500）、兔抗HA H6908（1:100；Sigma-Aldrich）、鼠抗EEA1（1:400；BD Transduction Labs，San Jose，CA，USA）和兔抗ERp5743（1:600；英国曼彻斯特大学Stephen High教授赠送）。使用ProLong Gold防褪色剂和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐（DAPI）将细胞安装在玻璃载玻片上（分子探针，Life Technologies，Mulgrave，Australia）。使用蔡司LSM 780 NLO倒置共聚焦显微镜（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）观察并捕获荧光图像。

统计分析

使用GraphPad Prism软件v.6.0（美国加利福尼亚州圣地亚哥市GraphPad-software）生成统计数据。结果表示为平均值±标准误差。使用双向方差分析（双向方差分析）比较各组之间的变量。使用Tukey多重比较测试进行事后分析，以比较各组之间的差异。统计显著性如下：*表示p值<0.05，**p<0.01，***p<0.001。使用Graphpad Prism 6绘制图形。

其他信息

如何引用这篇文章：Goh，J.B。等。Endofin是铁调节激素hepcidin的一种新型BMP-SMAD调节剂。科学。代表。 5, 13986; doi:10.1038/srep13986（2015）。

致谢

我们感谢Cameron McDonald、Gautam Rishi和Lesa Ostini提供的建议和技术援助。这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）向VNS提供的项目拨款（APP1031325）的部分支持。DFW得到了澳大利亚胃肠学会高级研究奖学金的支持。VNS是NHMRC高级研究奖学金（APP1024672）的获得者。

脚注

作者贡献J.G.、D.F.W.、W.H.和V.N.S.构思并设计了实验；J.G.进行了实验；J.G.、D.F.W.、W.H.和V.N.S.分析了数据；J.G.、D.F.W.和V.N.S.撰写了这篇论文。

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