介绍
在肿瘤发展过程中，癌细胞会遇到各种微环境压力，包括缺氧和营养剥夺(1). 为了应对这些应激条件，细胞激活了许多稳态途径，这些途径统称为综合应激反应（ISR）。ISR的激活伴随着翻译起始因子eIF2α被包括PERK和GCN2的eIF2激酶家族磷酸化引起的蛋白质合成的整体减少(2——4). 矛盾的是，eIF2α磷酸化的增加导致激活转录因子4（ATF4）的表达增强，ATF4是一种碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子(5)主要通过5′UTR机制增强其mRNA的翻译(6). ATF4反过来转录上调最终决定细胞命运的多个效应器，这取决于应激的严重程度和持续时间以及其他微环境因素。研究表明，肿瘤细胞可以诱导ISR适应其微环境中的生理应激条件，如缺氧和营养剥夺(7——9).
eIF2激酶PERK和GCN2未能完全诱导ISR并激活ATF4可降低体内外肿瘤细胞的生长(10——12). 与相应的正常组织相比，人类肿瘤样本中ATF4的水平较高，并且ATF4表达与人类宫颈癌中的缺氧区域重叠(10)支持ATF4在这些条件下的生存作用。此外，在异种移植模型中，从转化细胞中删除或敲除ATF4可显著降低肿瘤生长(11). 有趣的是，ATF4过度表达与化疗药物（包括顺铂、阿霉素、长春新碱和足叶乙甙）的耐药性相关(13——15).
最近，删除了珀克据报道，在小鼠乳腺癌模型中，可降低肿瘤转移的发生率(12). 由于ATF4是PERK的下游，它也可能在转移级联中发挥作用。在体外试验中，抑制PERK或敲除GCN2可减少乳腺癌和黑色素瘤细胞的迁移(16). 此外，ATF4被证明是神经嵴细胞上皮-间充质转化（EMT）的关键调节因子，而EMT是上皮性肿瘤转移所必需的过程(17).
癌细胞与细胞外基质（ECM）的粘附性丧失是它们进行静脉注射并进入血管和淋巴管所必需的(18). 在循环过程中，癌细胞必须在循环的恶劣环境中生存并抵抗失巢凋亡，失巢凋亡是一种因与ECM失去接触而导致的特殊形式的细胞死亡(19,20). 转移癌细胞已被证明通过激活影响外源性和线粒体介导的凋亡的几种信号通路，对失巢凋亡产生耐药性(20,21).
乳腺上皮细胞（MEC）基质脱落后PERK介导的ISR激活被证明可以促进生存，并且是3D培养和体内泌乳乳腺中适当腔填充所必需的(22). 然而，ATF4在这些过程中的确切作用以及这种作用的机制基础尚未阐明。在这里，我们重点关注ATF4在转移行为中所起的具体作用，包括迁移、侵袭和定植远处位点的能力。我们发现ISR在基质附着丧失后被强烈激活，并通过诱导ATF4依赖的细胞保护性自噬反应作为生存信号，其特征是关键自噬基因的转录调控，如自动液位计5,自动液位计7，以及ULK1系列此外，我们发现ATF4显著降低了ROS的生成，以防止失巢。抗氧化反应的激活以几个抗氧化基因的表达增加为特征，特别是血红素氧化酶1（HO-1），一种将血红素降解为一氧化碳（CO）、胆绿素和亚铁的速率限制酶(23). 有趣的是，HO-1的诱导依赖于NRF2，NRF2是一种主抗氧化转录因子，也受PERK调节(23——26). 最后，我们还证明了ATF4依赖性生存反应对小鼠有效的肺部定植至关重要，HO-1表达是肺癌和胶质母细胞瘤患者总生存率降低的预测标志。综上所述，我们的研究表明，ATF4在介导抗氧化剂和自噬前ISR中起着核心作用，该ISR使癌细胞在肿瘤转移期间存活并迁移到次要部位。
结果
ATF4表达对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。
侵袭和迁移是转移所必需的关键细胞特征，ATF4的缺失与缺氧期间细胞迁移的减少有关(16). 为了检测ATF4表达对HT1080人纤维肉瘤细胞（一种在小鼠肺部形成侵袭性转移瘤的细胞系）迁移的影响，我们使用了划痕和Transwell迁移分析。当HT1080细胞稳定表达非靶向shRNA（shNT.HT1080）或抗ATF4的shRNA（shaATF4.HT1080(补充图1A; 本文的在线补充材料；数字对象标识：10.1172/JCI78031DS1号机组). 接下来，我们评估了shNT的迁移能力。HT1080和shATF4细胞在缺氧（0.5%）下通过Transwell迁移。将shNT和shATF4.HT1080细胞暴露于0.5%低氧和常压缺氧10小时(补充图1B)或单独缺氧(补充图1C). 未观察到ATF4缺失或缺失细胞迁移行为的显著差异(补充图1、B和C). 为了确定ATF4是否影响细胞侵袭，将含有或不含ATF4（shNT和shATF4）的HT1080细胞置于24个Transwell Matrigel涂层板中，并在缺氧（0.5%）条件下暴露8小时后检测细胞侵袭。与上述迁移试验一样，ATF4的表达并没有显著改变HT1080细胞的侵袭能力(补充图1D).
基质分离诱导ISR和未折叠蛋白反应。
转移还需要将肿瘤细胞从ECM中分离出来，进行静脉注射，并通过血流将其转移到次要位置。据报道，上皮细胞中ECM附着缺失可诱导PERK介导的应激反应(22). 为了测试这一点，我们将HT1080细胞置于悬浮应力下。与在附着条件下生长的细胞相比，悬浮培养的细胞中检测到eIF2α磷酸化增加()24小时，持续36小时。ECM丢失后的p-eIF2α水平与那些用塞巴斯金（TG）（一种SERCA泵抑制剂和成熟的ISR诱导剂）治疗的细胞中的水平相当。同时检测到ATF4水平增加(). DLD1大肠腺癌细胞中也观察到类似的通过PERK诱导ISR(补充图2)，证明这种效应并不局限于单个细胞类型。ATF4转录物的mRNA水平显著上调，靶向DNA损伤-诱导转录物-3(DDIT3/CHOP公司),自动变速箱3和天冬酰胺合成酶(ASNS公司)48小时后表明ATF4能有效诱导ISR(). 这些结果表明，ECM连接缺失刺激以ATF4及其靶基因诱导为特征的ISR信号。
诱导ISR对抗失巢凋亡至关重要。(A类)HT1080细胞在附着（ATT）或悬浮（SUSP）条件下生长，并用0.5μM TG或1μM ST处理。全细胞裂解物用于检测p-eIF2α、eIF2 a、ATF4、CHOP、c-PARP、裂解caspase-3（c-Casp3）和β-actin的水平。(B类)的转录水平CHOP公司,ATF3型，以及ASNS公司相对于18S rRNA。数据表示为3个独立实验中与附加培养物相比的平均倍数变化(n个=3，平均值±SD）*P（P）<0.05**P（P）<0.01，学生的t吨测试。(C类)转染shNT或shPERK的HT080细胞在附着或悬浮条件下培养，并进行Western blot分析。(D类)shNT公司。HT1080细胞在附着或悬浮培养中用1μM PERK抑制剂GSK2606414（GSK414）处理。对所示蛋白进行免疫印迹分析。(E类)通过台盼蓝排除试验分析细胞存活率，并用3个独立实验的平均细胞存活率表示(n个=3，平均值±SD）*P（P）< 0.01; **P（P）<0.001，由学生t吨测试。(F类)用抗GCN2（shGCN2）和非靶向对应物（shNT）的shRNA稳定转染HT1080，在附着和悬浮条件下培养，并对指示蛋白进行免疫印迹。所有免疫印迹都是两个独立实验的代表。
PERK介导的eIF2α磷酸化是未折叠蛋白反应（UPR）过程中激活的3条信号通路之一(27). 其他信号模块包括转录因子XBP1通过核酸内切酶/激酶IRE1α剪接和增强翻译，以及转录因子ATF6的易位和蛋白水解裂解。HT1080细胞在48小时内失去基质附着，导致拼接的数量大幅增加XBP1型转录和XBP1s蛋白表达(补充图3，A和B). 我们还检测到ATF6处理增加了24小时，持续到48小时(补充图3B). XBP1s和裂解ATF6蛋白的水平与TG诱导的水平相当，表明脱附应激诱导了全谱UPR反应。
ISR信号的丢失会增加失巢凋亡介导的细胞死亡。
基质附着丧失导致程序性细胞死亡，这种现象称为失巢凋亡(20). 在脱离后48小时内，我们没有观察到明显的凋亡水平，其特征是HT1080或DLD1细胞中没有裂解的PARP（c-PARP）和c–caspase 3(和补充图2). 相反，促凋亡剂staurosporine（ST）使这些细胞中的凋亡标记物显著增加。
ISR对细胞命运（生存和死亡）有不同的影响，这取决于应激的持续时间、严重程度和性质。为了确定ISR在细胞命运中的作用，将稳定转染shNT或shRNA抗PERK（shPERK）的HT1080细胞置于悬浮状态。与shNT中ATF4表达和eIF2α磷酸化的诱导相比。在shPERK.HT1080细胞中，eIF2α磷酸化诱导和ATF4表达显著减弱，同时c-PARP和c-caspase 3水平也显著升高()相当于shPERK.HT1080细胞存活细胞分数减少2倍48小时().
作为在这些条件下阻断PERK激活的另一种方法，我们使用了一种高度特异的PERK抑制剂（GSK414），该抑制剂与激酶结构域结合并抑制PERK活性(28). HT1080细胞（图1D）或DLD1细胞的治疗(补充图2)GSK414阻断了悬浮培养物中PERK的激活，如p-PERK水平、p-eIF2α水平和ATF4诱导的降低(和补充图2). 虽然GSK414本身并没有引起附着细胞凋亡的显著增加，但悬浮培养的处理导致c-PARP和c-caspase 3水平的显著诱导，这相当于48小时内细胞存活率降低约70%(). 为了研究细胞质、氨基酸感应激酶GCN2是否在赋予失巢抗性中发挥任何作用，我们还将shGCN2.HT1080细胞置于附着和悬浮条件下。在悬浮应激48小时后，GCN2的缺失不会导致p-eIF2α或ATF4水平升高的任何变化(). 此外，shGCN2.HT1080细胞未显示任何明显的凋亡标记物诱导，表明GCN2在抗失巢凋亡中不起致病作用。我们从这些结果中得出结论，细胞基质脱离后PERK的诱导是抵抗失巢凋亡介导的细胞死亡的机制。
ATF4在抗失巢凋亡中起关键作用。
我们想确定ATF4在抗失巢凋亡中的作用。均为shNT。HT1080和shNT。DLD1细胞在基质脱离后表现出ATF4诱导(). 相反，通过稳定转染shRNA（shATF4）在两种细胞系中敲低ATF4表达，导致较高水平的凋亡，对应于细胞存活率降低50%以上(). 此外，我们利用CRISPR/CAS9系统靶向自动变速箱4-编码序列并建立了CRISPR-ATF4 HT1080细胞系。与shATF4.HT1080细胞类似，CRISPR-ATF4.HT108O细胞在悬浮48小时后对失巢凋亡的敏感性增加(补充图4A). 与shPERK细胞（悬浮24小时足以诱导凋亡）相比，我们在悬浮48小时之前在shATF4.HT1080或CRISPR-ATF4 HT1080细胞中未观察到明显的失巢凋亡(和补充图4A). 这种延迟可能归因于PERK的其他细胞效应，与ATF4激活无关，例如IFN信号下调和NRF2激活(29,30).
ATF4具有抗失巢症的能力。shNT和shATF4.HT1080(A类)以及shNT和shATF4.DLD1单元(B类)在附着或悬浮条件下生长，并进行ISR和凋亡标记物的Western blot分析。(C类)在悬浮培养的shNT和shATF4.HT1080细胞中测量3个独立实验的平均细胞存活率(n个=3，平均值±SD）*P（P）<0.05**P（P）<0.01，学生的t吨测试。(D类)稳定表达四环素i-shATF4或i-shNT的HT1080细胞在附着或悬浮条件下生长48小时，或在DMSO（-）或Dox（+）预处理后用0.5μM TG处理以改变ATF4的表达。测量c-PARP和裂解caspase-3水平，并与ST治疗进行比较。(E类)感染空载体、对照（Ad-Cre）或mATF4（Ad-mATF4）的shATF4.HT1080裂解物的免疫印迹，并在附着或悬浮培养物中培养48小时。(F类)通过台盼蓝排除试验测定细胞活力。细胞存活率表示为3个独立实验的平均值±SD(n个=3，平均值±SD）*P（P）<0.05**P（P）<0.01，学生的t吨测试。所有免疫印迹都是两个独立实验的代表。
为了进一步探讨ATF4在抗失巢凋亡中的作用，我们建立了一个HT1080细胞系，其中ATF4的水平可以通过抗ATF4（i-shATF4）的多西环素诱导（Dox-inducible）shRNA进行调节。该系统允许ATF4的调控表达，而无需直接调制ISR的任何其他成分。在TG治疗和悬浮状态下，添加Dox有效地阻断了ATF4的表达(). 重要的是，与i-shNT处理相比，i-shATF4.HT1080细胞的Dox处理导致细胞凋亡显著增加。HT1080细胞(). 为了尽可能减少shATF4细胞的效应是由于shRNA的非靶向效应所致的可能性，使用腺病毒介导的转导在shATF4.HT1080细胞中表达了小鼠ATF4（mATF4）的全长版本(). 作为对照，我们还用腺核感染shATF4细胞，以排除病毒感染可能引起的任何影响。与腺核感染的shATF4.HT1080细胞相比，shATF4.HT1080中mATF4的表达完全阻断了失巢凋亡，悬浮应激后存活细胞的百分比没有显著降低(). 最后，我们测试以确定是否在反式在没有PERK的情况下可以从失巢凋亡中拯救细胞。mATF4在shPERK中的表达。HT1080没有逆转失巢凋亡敏感表型，进一步支持了PERK在这一过程中的重要作用和额外的信号转导(补充图3B).
依赖ATF4的细胞保护性自噬降低失巢凋亡。
基质分离已被证明能诱导依赖PERK的自噬程序存活失巢症(22). 我们希望确定ATF4是否在这一过程中发挥关键作用。当置于悬浮液中时，HT1080细胞表现出自噬诱导，这从LC3BI加工为LC3BII和p62降解（也称为SQSTM1）可以明显看出，p62作为泛素结合支架蛋白(). 相反，与shNT相比，shATF4.HT1080细胞的LC3B处理能力显著下降。HT1080细胞悬浮培养24小时(). 到48小时，shATF4细胞缺乏任何LC3BII表达，表明ATF4表达对自噬至关重要(). 用蛋白酶体抑制剂E64d/Pep处理shATF4.HT1080细胞进行的自噬通量分析显示，与shNT相比，LC3B处理减少。悬浮HT1080电池(). 重要的是，自噬反应在shATF4.HT1080细胞中无法维持，当ATF4表达在反式Ad-mATF4().
ATF4介导的自噬为抗失巢凋亡提供细胞保护。(A类)用抗LC3B（LC3BI和LC3BII）和p62抗体的免疫印迹法测定在附着或悬浮条件下生长的HT1080细胞的自噬水平。(B类)对悬浮液中shNT和shATF4.HT1080细胞的自噬诱导差异进行了类似测量，并与无血清培养基（EBSS）培养的细胞进行了比较。(C类)用悬浮培养物中生长的E-64d（10μg/ml）和10μg/ml胃蛋白酶抑制素A（Pep）处理细胞48小时，进行自噬通量测定。(D类)用对照组（shATF4+Ad-Cre）或mATF4（shATF4+Ad-mATF4）转染的shNT和shATF4.HT1080细胞中LC3B的免疫印迹。LC3BII与LC3BI的比率表示为根据shNT和shATF4.HT1080细胞的附加条件进行归一化。(E类)随着spautin-1浓度的增加，自噬被抑制，细胞裂解物通过Western blots进行分析。(F类)在指定的时间点用spautin-1（5μM）处理HT1080细胞。同样进行自噬和凋亡标记物的免疫印迹。所有免疫印迹都是两个独立实验的代表。(G公司)测量并表示3个独立实验的平均细胞存活率(n个=3，平均值±SD）**P（P）<0.01，学生的t吨测试。(H（H）)mRNA水平自动液位计5,自动液位计7，以及ULK1型通过RT-PCR在悬浮液中生长48小时的shNT和shATF4.HT1080细胞中测量相对于18S rRNA的相对含量。数据表示为3个独立实验中与附加培养物相比的平均折叠变化(n个=3，平均值±SD）**P（P）<0.01，学生的t吨测试。
自噬对肿瘤细胞既有细胞保护作用又有细胞抑制作用(31). 一方面，自噬可以通过消除未折叠的蛋白质和损坏的细胞器来抑制肿瘤细胞的生长，特别是在肿瘤发生过程中。然而，在与肿瘤微环境相关的应激条件下，它还可以通过提高细胞的凋亡阈值来促进肿瘤细胞的生长(32). 为了研究ATF4依赖性自噬在ECM附着丧失过程中的作用，我们用增加浓度的spautin-1处理HT1080细胞，spautin-1是一种自噬抑制剂，通过抑制自噬小泡成核所需的VPS34/PI3K复合物发挥作用(33). Spautin-1处理（5和10μM）降低了HT1080细胞在附着和悬浮培养条件下的LC3B处理(). 重要的是，在悬浮条件下用spautin-1处理的细胞显著增加了c-PARP和c-caspase 3的水平(). 使用5μM spautin-1进行的时间进程分析显示，细胞凋亡显著增加()生存率降低()治疗后24小时。
ATF4转录调节几个自噬基因，通过直接结合其启动子来响应细胞应激条件，如缺氧(34——36). 我们研究确定关键的ATF4靶向自噬基因在基质分离后是否受到调控。我们发现转录水平和蛋白质水平显著增加（约4倍）自动液位计5,自动液位计7，以及ULK1系列暂停48小时(). 这些转录物的表达及其相应的蛋白水平依赖于ATF4，因为它们的诱导在缺乏ATF4的情况下被显著阻断(补充图5A). 与非靶向siRNA转染（siNT转染）细胞相比，HT1080中siRNA对ATG5、ATG7和ULK1的敲除导致LC3处理失效(补充图5、B和C). 与我们之前的观察结果类似，在缺乏ATG5、ATG7或ULK1的情况下未能诱导自噬导致细胞凋亡增加(补充图5、B和C). 因此，ATF4介导的自噬诱导对基质脱落的反应是一种抗失巢凋亡的细胞保护机制。
ATF4缺失会增加悬浮细胞培养物中的ROS水平。
基质脱落通常与活性氧生成增加引起的大量氧化应激有关(37). 有趣的是，ATF4的激活也与细胞免受氧化应激有关，氧化应激通过转录激活多种抗氧化基因来维持细胞中的氧化还原状态(2,38). 因此，我们假设ATF4的丢失会显著降低细胞改善ROS生成增加的能力，并使细胞对失巢凋亡介导的细胞死亡敏感。为了验证这一点，在附着培养和悬浮培养条件下，用载体或Trolox处理shNT和shATF4.HT1080细胞，Trolox-一种维生素E的水溶性类似物和一种有效的抗氧化剂。与经载体处理的细胞相比，添加Trolox可显著提高shATF4细胞的细胞活力(). 相比之下，Trolox处理显著降低了shATF4.HT1080细胞悬浮液中的c-PARP和c-caspase 3水平，而没有显著改变PERK和eIF2α磷酸化状态的水平(). 巧合的是，失巢细胞的激活也与葡萄糖缺乏和细胞中ATP产量下降有关，这两种情况都被证明可以诱导ISR(37). 因此，持续ISR信号的存在可能反映了癌细胞在失去细胞间或基质接触时必须承受的多种压力条件。
缺乏ATF4会导致基质脱离后的氧化应激。(A类)用50μM Trolox（Tlx）处理shNT和shATF4.HT1080细胞48小时。显示了作为2个独立实验代表的指示蛋白质的免疫印迹。(B类)通过台盼蓝排除法在Trolox处理的培养物中测量3个独立实验的平均细胞存活率，并表示为平均值±标准偏差(n个=3）*P（P）<0.05**P（P）<0.01，学生的t吨测试。(C类)在指定的时间点测量shNT和shATF4.HT1080细胞中的DCF-DA荧光水平。(D类)纳米的测量14一氧化碳2（以红色突出显示E类)在不同时间点从shNT和shATF4中释放。HT1080细胞保存在悬浮培养物中或用5 mM咪唑（Miso）处理作为阳性对照。的数据C类和D类表示为3个独立实验的平均值(n个=3，平均值±SD）*P（P）<0.05**P（P）<0.01，学生的t吨测试。(E类)OPPC和测量值的示意图14一氧化碳2（红色）。
为了测量ATF4表达对氧化应激水平的影响，我们检测了悬浮培养的shNT和shATF4.HT1080细胞在不同时间点的2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCF-DA）荧光。与附着培养物相比，shNT和shATF4.HT1080细胞在悬浮6小时时，DCF-DA荧光水平显著上调(). 24小时前，shNT。与shATF4细胞相比，HT1080细胞的DCF-DA荧光水平降低(). 随着时间的推移，shATF4.HT1080细胞中的持续高荧光活性表明，在缺乏ATF4的情况下，活性氧持续累积，随后基质附着丧失。
作为细胞氧化应激水平的二级检测，我们使用了磷酸戊糖氧化循环（OPPC）检测。氧化应激增加后，OPPC升高，通过维持NADPH/NADP来维持细胞的氧化还原状态+比率(39). 通过OPPC增加的流量可以通过在补充有标记的培养基中培养细胞来检测d日-[1-14C] 葡萄糖和测量释放14一氧化碳2随着时间的推移(). 逐渐积累的14一氧化碳2在两个shNT中都观察到。HT1080和shATF4.HT1080电池(). 然而，到24小时时14一氧化碳2与shNT细胞相比，shATF4.HT1080细胞与5mM米索尼达唑处理（一种有效的促氧化剂）诱导的shNT细胞相比较，表明通过OPPC的代谢流量增加(). 总之，这些结果支持一种模型，即缺乏ATF4会导致氧化应激水平逐渐升高，最终导致对失巢凋亡的敏感性。
ATF4是抗氧化基因HO-1表达的有效诱导物，以响应失巢。
ATF4转录调节几个抗氧化基因以应对氧化应激，包括HO-1型，谷胱甘肽过氧化物酶1(通用处理器X1)和超氧化物歧化酶2(SOD2标准) (40,41). While期间通用处理器X1和SOD2标准水平基本保持不变，HO1公司悬浮24小时后，转录物水平以ATF4依赖的方式增加了近5倍(). 与其转录表达相关，HT1080和DLD1细胞悬浮24小时后HO-1的蛋白水平显著上调(和补充图6A). 重要的是，在shATF4细胞中检测不到HO-1蛋白水平，可以通过在附着培养物和悬浮培养物中重新表达mATF4来恢复(). HT1080中HO-1表达的敲除()或DLD-1单元(补充图6、B和C)导致c-PARP和c-caspase 3水平随时间增加，表明HO-1表达对细胞抵抗失巢凋亡至关重要。在siNT和siHO-1 HT1080中的DCF-DA荧光测量显示，在没有HO-1的情况下，18小时内ROS显著积累(补充图7A). 同样，通过OPPC测量的代谢流量也较高14一氧化碳2与非靶向对照相比，siHO1 HT1080细胞中的积累(补充图7B)确认其抗氧化性能，以应对活性氧生成的增加。
ATF4诱导HO-1的表达以应对分离激活的氧化应激。(A类)RT-PCR分析HO1公司,通用处理器X1，以及SOD2标准在shNT和shATF4.HT1080细胞中悬浮生长48小时。数据表示为3个独立实验中与附加培养物相比的平均折叠变化(n个=3，平均值±SD）*P（P）<0.05**P（P）<0.01，学生的t吨测试。(B类)通过免疫印迹分析测定shNT和shATF4.HT1080细胞以及腺病毒AMATF4感染的shATF4.5T1080细胞中HO-1的表达。(C类)用越来越多的抗HO-1（siHO-1）或siNT siRNA转染HT1080细胞。测定了指示蛋白的免疫印迹。(D类)生长出慢病毒介导过表达hHO-1（shATF4+hHO-1）的shATF4.HT1080细胞。进行凋亡标记物的免疫印迹。(E类)中ARE的示意图HO1公司启动子和引物组(第1页,第2页,第3页)表示包括3个ARE位点和转录起始位点（TSS）的扩增区域。通过α-ATF4或α-NRF2抗体和测量人类3个ARE的富集度进行ChIP分析HO1公司RT-PCR启动子。用抗组蛋白3（α-组蛋白3 D2B12）和兔IgG（α-兔IgG）抗体分别作为阳性和阴性对照，扩增人类基因组的人RPL30外显子3。数据表示为输入DNA的比率（1:25），并表示为两个独立实验的平均值(n个=2，平均值±标准差）*P（P）<0.05**P（P）<0.01，学生的t吨测试。(F类)悬浮48小时后，对转染siNT或siNRF2的shNT和shATF4.HT1080细胞中的指示蛋白进行免疫印迹分析。所有免疫印迹都是两个独立实验的代表。
为了进一步研究HO-1的作用，用表达全长人HO-1蛋白（hHO-1）的慢病毒载体转染shATF4.HT1080细胞。免疫印迹证实悬浮培养48小时后HO-1蛋白水平高于shATF4.HT1080细胞(). 关键的是，shATF4.HT1080中HO-1蛋白的再表达阻断了细胞凋亡(). 总之，这些结果强烈表明，基质脱离后ATF4的诱导导致HO-1上调以应对氧化应激的增加。未能诱导这种ATF4介导的抗氧化反应导致对失巢凋亡介导的细胞死亡的敏感性增加。
ATF4在失巢凋亡后与HO1启动子结合。
ATF4通过直接结合其靶基因启动子中的C/EBP-ATF调节元件（CARE）来调节基因表达(42). 分析HO1公司启动子没有发现任何典型或推测的ATF4结合位点。然而，HO1公司是NRF2的已知直接靶点，NRF2是抗氧化应激反应的主要调节器(23). 以前的报告表明，抗氧化反应元件（are）存在于HO1公司启动子，至少有一项研究报告ATF4和NRF2在体外相互作用，提示潜在的协同功能(40). 我们专注于HO1公司启动子，因为它们被证明是NRF2结合位点。通过引物对扩增ARE第1页,第2页，以及第3页(). 在3个ARE中，ChiP仅在悬浮培养的ARE1（-3975/-3900）和ARE3（-9048/-8928）中观察到ATF4结合显著增强(和补充图7B). 作为对照，用于扩增RPL30外显子3区域的组蛋白H3 Lys 4特异性抗体显示出与应激条件无关的结合(). 这些数据强烈表明ATF4与HO1公司启动子，可能通过与NRF2的相互作用在基质分离后转录上调其表达。
ATF4和NRF2协同增加基质分离期间HO-1的表达。
在氧化应激后ISR的激活过程中，PERK直接磷酸化NRF2以转录激活抗氧化基因程序(25). 在基质附着丧失后，HT1080细胞表现出NRF2表达增加，即使在悬浮48小时后也能持续(). NRF2的这种诱导可能是关键的，因为NRF2被广泛认为是HO-1的主要转录诱导物(23). 实际上，在shNT中，siRNA（siNRF2）对NRF2表达的抑制。与非靶向对照siRNA相比，HT1080细胞悬浮后HO-1表达显著降低(). 当shATF4.HT1080细胞中NRF2表达下调时，HO-1的表达被完全阻断(). 重要的是，NRF2的敲除增加了悬浮状态下shNT和shATF4.HT1080细胞的凋亡，并复制了shATF4.HT1080的凋亡表型(). 此外，我们观察到NRF2结合在HO1公司促进剂，在悬浮条件下进一步增加().
接下来，我们想确定NRF2是否绑定到HO1公司启动子依赖于ATF4。敲除HT1080细胞中的NRF2（siNRF2）导致ARE1和ARE3中ATF4的结合显著减少，表明NRF2是ATF4与HO1公司发起人(补充图7C). 然而，对shATF4.HT1080细胞的ChIP分析显示，NRF2与AREs的结合在HO1公司发起人(补充图7D). 总之，这些数据强烈表明ATF4和NRF2的合作活动增加HO1公司mRNA和蛋白质水平，也表明这些转录因子中任一种的缺失都会影响ECM分离下HO-1的诱导。
人类纤维肉瘤细胞在肺部定植需要ATF4。
为了测试ATF4丢失和无法在体内系统中安装有效anoikis的后果，我们使用荧光素酶表达的shNT进行了肺部定植分析。HT1080或shATF4.HT1080电池(补充图6A). 本试验中的定殖取决于注射细胞在循环中的存活以及细胞的附着。体外每个细胞系的荧光素酶活性具有可比性（数据未显示）。shNT和shATF4.HT1080细胞注射小鼠由于肺部毛细血管中的细胞被明显捕获，因此在胸腔中显示出强大的荧光素酶活性。由于在接种后4小时对小鼠进行成像，这些结果表明注射时细胞是活的。(补充图8A). shNT小鼠的生物发光信号持续增加。每周对HT1080细胞进行一次测量，而在注射两个不同shATF4克隆中的任何一个的小鼠中均未检测到信号(补充图8B). 在7只注射了shNT的小鼠中。HT1080细胞，6产生了相当大的肺集落，H&E染色增加，而注射shATF4克隆的小鼠都没有(补充图8、C和D). 与所有shNT小鼠一样，总体存活曲线反映了肺部定植的显著差异。由于肿瘤相关的体重减轻，HT1080肺菌落必须进行安乐死(). 相反，11只shATF4.HT1080注射小鼠全部存活，其中一些小鼠在静脉注射后100多天存活().
ATF4和HO-1促进纤维肉瘤肺定植。(A类)小鼠尾静脉注射shNT的Kaplan-Meier生存分析(n个=4）或shATF4 HT1080克隆(n个= 8). ***P（P）=0.0002，对数秩检验。(B类)shNT公司(n个=5），shATF4(n个=5）和ATF4过度表达（shATF4+Ad-mATF4）HT1080细胞(n个=8）静脉注射，获得生物发光图像。显示了注射后4小时和8周的典型图像。(C类)平均辐射（光子/s/cm2/sr）根据注射后的时间绘制小鼠胸部/肺部区域的图（平均值±SEM）。(D类)shNT公司。注射HT1080细胞、shATF4、HT1080和HO-1–过度表达细胞（shATF4+hHO-1）。平均辐射率绘制为时间的函数（平均值±SEM）*P（P）<0.05**P（P）<0.01，学生的t吨测试。(E类)注射shNT小鼠的Kaplan-Meier生存分析。HT1080型(n个=5），shATF4.HT1080(n个=5），和shATF4+hHO-1.HT1080(n个=10）个单元格(*P（P）=0.0285，注射shATF4.HT1080和shATF4+hHO-1.HT1080细胞的小鼠组之间的对数秩检验）。(F类)将i-shATF4.HT1080细胞注射到雌性裸鼠的右侧，给小鼠灌服含或不含1 mg/ml Dox（+Dox，n个= 8; –多克斯，n个= 7). 当肿瘤达到约400 mm时，手术切除原发肿瘤三，并测量胸部/肺部区域的生物发光，并绘制随时间（天）变化的曲线。数据表示为平均值±SEM*P（P）<0.05，学生的t吨测试。
为了进一步测试ATF4是否是有效肺部定植所必需的，通过尾静脉注射将shNT、shATF4和腺-mATF4。HT1080细胞引入裸鼠体内(). 与之前的实验类似，小鼠注射了shNT。与注射shATF4.HT1080细胞的细胞相比，HT1080的细胞荧光素酶活性显著增加。注射后8周，shNT。HT1080-和mATF4重组的HT1080细胞显示出可比较的信号(). 这些数据表明，ATF4不仅可以拯救细胞形成肺集落的能力，而且还可以在细胞因缺乏基质附着而无法增殖的初始阶段促进存活。此外，在反式与shATF4.HT1080细胞相比，ATF4缺陷细胞的荧光素酶活性部分但显著增加(). 这种部分恢复可能归因于其他几个基因以依赖ATF4的方式对肿瘤微环境作出上调反应。与shATF4对应物相比，HO-1的过度表达也导致小鼠次级转移部位（如后腿肌肉和腹部）增加，总体存活率降低(补充图9，A–C，以及). 注射shNT小鼠的连续肺切片。HT1080细胞ATF4和HO-1高表达()以及LC3的适度表达。重要的是，这些蛋白的最高表达水平显示了这些肿瘤中广泛的共定位区域（如箭头所示)提示ATF4和HO-1的表达在HT1080纤维肉瘤细胞形成肺集落中起重要作用。
HO-1高表达与患者的转移和总生存率降低相关。(A类)从Kaplan-Meier绘图仪/肺癌中获得1406例肺癌患者的总体生存概率，并将HO-1的低（黑色）表达水平与高（红色）表达水平进行分层(http://www.kmplot.com/lung). (B类)胶质母细胞瘤患者上调（≥2倍于平均值）、下调（≤2倍于均值）或中度患者的总体生存概率HO1公司表达来自乔治敦癌症数据库（G-DOC Plus）(https://gdoc.georgetown.edu/gdoc/)，使用n个表示每组的患者编号。根据对数秩检验计算统计显著性。(C类)注射shNT小鼠连续肺切片的免疫组织化学分析。使用ATF4、HO-1和LC3抗体的HT1080细胞。插图显示了3种检测到的蛋白质的共定位区域。D类和E类显示已知有淋巴结转移的原发性乳腺肿瘤手术标本中HO-1和ATF4的表达(D类)原发性肉瘤患者的脑转移灶(E类). T、 肿瘤区域；N、 正常组织。原始放大倍数，×2，×5（插图）(C类)；×2，×4（插图）(D类和E类).
最后，我们利用侧翼异种移植瘤模型探讨ATF4诱导性缺失是否在肿瘤转移中起作用。将HT1080.i-shATF4 cl.4细胞皮下注射到裸鼠侧翼。2天后，将小鼠分为2组，其中一半给予溶解在饮用水中的Dox（+Dox）。当原发肿瘤达到约400 mm时，将其切除三以便在肺部形成转移性扩散。与-Dox（正常ATF4水平）组相比，+Dox（较低ATF4水平）组的原发肿瘤体积有所减少(补充图10、A和B). 更重要的是，在初次肿瘤切除约40天后，Dox治疗的小鼠肺部转移瘤体积也显著减少（ATF4降低）(和补充图10C). H&E染色对肺部的分析显示，与+Dox组相比，–Dox组小鼠的转移集落更大(补充图10D).
HO-1在转移性人类肿瘤中表达。
对1406名肺癌患者的公开数据集进行调查，结果显示HO-1肿瘤表达水平较高的患者的总体生存率显著降低(和参考。43). 类似地HO1公司胶质母细胞瘤患者的（转录水平≥2倍）也预示着生存率显著降低().
接下来，我们分析了肿瘤患者分离出的肿瘤中HO-1的表达模式。HO-1特异性抗体免疫化学分析(补充图11A)确定HO-1在组织病理学正常的间充质或上皮组织中没有高表达(补充表2和补充图11B). 我们还检测到HO-1在手术切除时未发现淋巴管受累或转移的原发性乳腺和肉瘤肿瘤中的表达非常低(补充图12，A和B). ATF4在这些肿瘤中的表达差异很大(补充图12，A和B). 同样，在手术切除时未证实转移的人类平滑肌肉瘤样本中也观察到HO-1的缺失(补充图12C). 相反，在淋巴结浸润阳性的原发性乳腺和转移性肉瘤（向大脑）的样本中检测到HO-1的高表达(). 重要的是，在这两种转移性肿瘤病灶中，ATF4和HO-1的高表达存在广泛的共定位(). 上述结果，再加上HO-1水平与肺癌和胶质瘤患者预后较差的相关性，支持了这样的观点，即原发肿瘤中HO-1的高表达可能赋予转化细胞抵抗基质脱落条件的能力，并有助于转移行为。
讨论
转移过程需要转化细胞获得一些特征来克服正常组织的稳态机制。在上皮细胞肿瘤中，EMT对细胞外基质的迁移和侵袭至关重要(44). 然而，在间充质细胞来源的肿瘤（如本文研究的肉瘤）中，EMT的作用尚不明确。细胞迁移和侵入ECM也是静脉注射和随后定植的关键要求。我们的体外实验结果表明，对于这两个过程，ATF4是可有可无的，至少在我们测试的间充质细胞系统中是如此。
与适当的ECM失去连接会导致细胞与不适当的底物结合和增殖(45). 为了抵消这种潜在的有害影响，失巢凋亡的过程已经进化，以确保多细胞生物的正常发育，并作为一种重要的屏障机制来防止发育异常(20). 然而，转移性癌细胞可以引发复杂的机制来逃避失巢凋亡，同时与原发部位的ECM分离。大多数预防失巢凋亡的机制通过调节BCL2等抗凋亡因子以及抑制BID、BAX和BIM等促凋亡因子来阻断caspase介导的凋亡途径。这些通路由细胞表面效应器介导，例如整合素介导的PI3K/AKT通路的激活以及受体酪氨酸激酶的激活(46,47). 然而，最近的研究表明，整合素非依赖性信号通路（如UPR）在调控失巢凋亡中发挥关键作用(22). 我们的研究结果表明，ATF4（PERK的效应子）在执行失巢细胞存活的ISR反应中起着关键作用().
HO-1参与ATF4介导转移的模型。肿瘤细胞从ECM中分离导致PERK通路（可能还有IRE1和ATF6通路）激活，这些通路通常被内质网-常驻伴侣蛋白GRP78保持不活动（为了清楚起见，这里只显示了PERK途径，这是本研究的重点）。PERK激活介导eIF2α磷酸化和ATF4翻译上调。反过来，ATF4通过上调关键自噬基因激活细胞保护性自噬程序。ATF4还与NRF2（由PERK直接激活）合作激活抗氧化蛋白HO-1，以对抗ECM丢失后增加的氧化应激。UPR的PERK臂的自噬和抗氧化效应途径的联合作用使肿瘤细胞在循环中存活更长时间，并导致继发转移部位的形成率增加。
我们的数据表明ATF4提供失巢抗性的双重机制。一种机制涉及通过调节重要的自噬相关基因，如自动液位计5,自动液位计7，以及ULK1系列我们的数据与最近的一项研究一致，该研究证实了PERK介导的细胞保护性自噬在体内外悬浮腔型乳腺癌细胞（MCF10A）中的作用(22). 我们的结果还表明ATF4通过一种互补机制赋予失巢凋亡抵抗。据报道，基质分离过程中产生的活性氧是由小GTPase RAC1与整合素结合后引起的，并且对癌细胞有益，因为它激活PI3K/AKT通路(48,49). 虽然活性氧水平增加可能具有增殖作用，但活性氧的不平衡和未缓解增加可能导致细胞器破坏，最终导致细胞死亡。我们观察到，在缺乏ATF4的情况下，基质附着丧失会导致慢性氧化应激，从而导致细胞对失巢凋亡的敏感性。重要的是，我们的结果表明，强效抗氧化剂Trolox可以拯救缺乏ATF4的分离细胞，这突出了一个事实，即ATF4抗氧化特性是抗失巢症的关键。此外，Schafer等人已经证明，抗氧化剂还可以通过增加细胞内ATP水平来防止失巢凋亡，这是一种涉及增强脂肪酸氧化的机制(37). 这项研究还表明，基质脱落对细胞内ATP水平的影响可以通过癌基因（如ERBB2）的过度表达进行现象复制(37). 有趣的是，HT1080细胞有一个激活的N-RAS突变，而DLD1细胞则有一个活化的K-RAS突变。RAS突变，如HRASV12版本已经证明激活UPR，并且在癌基因表达的情况下，UPR的重要调节因子如IRE1、XBP1、ATF6和ATF4的失活会诱导细胞凋亡(50). 此外，Croft等人已经证明通过RAS或BRAF的高活性致癌信号V600E型激活MEK/ERK信号，这是使细胞适应内在内质应激水平增加所必需的(51).
ATF4的抗氧化特性已被很好地证明，因为它在内质网应激后转录诱导几个抗氧化基因，从而改善活性氧(2,26,38). 我们发现，基质脱离后HO-1的mRNA和蛋白水平显著升高。有趣的是，HO-1也是HIF1α的靶点，在肾细胞癌和前列腺肿瘤中上调，并对放射治疗和光动力治疗诱导的细胞毒性产生抵抗(52——54). HO-1在肿瘤转移中的作用尚不清楚。小鼠黑色素瘤细胞（B16F10、S91和SK-mel188）过度表达HO-1也被证明通过增加血管生成和上调VEGF表达来增加肺部转移病灶(55). 同样，在大鼠体内移植HO-1过表达的胰腺肿瘤会导致肺部转移的发生率更高(56). HO-1增强肿瘤转移的一种机制涉及调节ECM的基因，如基质金属蛋白酶MMP9和MMP2，它们在肺转移瘤中上调（约5倍）(57). 据报道，HO-1被认为调节转移的其他机制包括胸腺肽-β4（Tβ4）的上调，该上调在HO-1过度表达的黑色素瘤细胞中升高，并被证明在黑色素瘤、纤维肉瘤和鳞状细胞癌中诱导转移(55,58,59). 第三种被提议的机制涉及HYAL1（透明质酸酶）的激活，该酶也被证明在HO-1升高的肿瘤中过度表达，并被认为是肿瘤转移潜能的生物标记物(55,60). 最后，HO-1被广泛证明是一种促血管生成因子，控制重要的调节因子，如VEGF和碱性FGF（bFGF）(61). 这些结果支持一种新的模型，即HO-1在多个肿瘤系统中的多个促转移活性上调中发挥中心作用，从而使其成为一个有吸引力的靶点，以阻止原发性和转移性肿瘤的生长。
HO-1抑制剂锌原卟啉IX（ZnPPIX）是一种抑制HO-1酶活性的血红素类似物，其研究表明，在减少小鼠原发性肿瘤生长细胞淋巴瘤、肺癌和肉瘤方面取得了有希望的结果(62). ZnPPIX的主要问题之一是其溶解度，这使其难以在体内工作。然而，最近的发展，如高水溶性PEG-ZnPPIX和SMA-ZnPPIX，已经显示出其抗肿瘤潜力和肿瘤药物保留方面的显著改善，并减少了小鼠的副作用(63).
尽管HO-1的原癌特性已被充分记录，但HO-1对自噬作用的确切机制尚不明确。在生理条件下，HO-1表达增加可诱导自噬，清除受损线粒体并抑制氧化应激，从而导致肿瘤发生(64,65). 然而，一旦确定为恶性肿瘤，活性氧水平的增加会促进原发性和转移性生长(66).
内质网应激和氧化应激均能诱导UPR的PERK依赖臂的激活(4,67). PERK被证明可以独立于eIF2α-P介导的ATF4上调而激活NRF2，NRF2和ATF4都表现出抗氧化特性。总的来说，我们的数据为PERK介导的ATF4和NRF2途径如何协同激活抗氧化反应以应对不断增加的ROS提供了一个新的机制见解。我们的研究结果表明，PERK-eIF2α-ATF4和PERK-NRF2信号通路之间的一个重要交叉点是转录上调HO1公司.NRF2和ATF4积累、交互并绑定到HO1公司发起人；这些主要是已知的NRF2结合位点。这种源自PERK的共同信号通路进一步增加了越来越多的证据，表明PERK可能被开发为治疗靶点(4,7,68)诱导循环肿瘤细胞失巢凋亡，防止转移生长。
方法
化学制品
TG（目录T9033）、Trolox（目录238813）、puramycin（目录P9620）和Dox（目录D9891）购自Sigma-Aldrich。Spautin-1来自Millipore（目录567569，Calbiochem）。用于悬浮培养的甲基纤维素（目录64670）和聚HEMA（目录772542）也从Sigma-Aldrich获得。PERK抑制剂GSK414由Jonathan Axten（葛兰素史克公司）提供(28).
细胞培养和稳定细胞系的产生
从ATCC（HT1080-CCL-121和DLD1-CCL-221）中获得HT1080人纤维肉瘤细胞和DLD1人大肠纤维肉肉瘤细胞，并在添加青霉素、链霉素和10%FBS的DMEM中培养。细胞密度为5×105/ml置于含有0.5%甲基纤维素的悬浮培养基中，以防止结块，并在37°C下放置在涂有聚-HEMA（6 mg/ml，95%乙醇）的组织培养板上过夜，以进行干燥。悬浮后，离心细胞并用冰镇PBS洗涤两次，以进行蛋白质测量。之前描述了稳定表达shNT和shATF4的HT1080和DLD1细胞(11). J.Alan Diehl提供了稳定转染shPERK（shPERK.HT1080）的HT1080细胞(69). 通过用TRIPZ shNT（i-shNT）或shATF4（i-shATF5）载体（Thermo Scientific）稳定转染HT1080细胞，并用2μg/ml嘌呤霉素筛选获得稳定克隆，创建i-shNT和i-shATF。用Dox（1μg/ml）诱导shRNA的表达自动变速箱4-编码序列用于从HT1080人纤维肉瘤细胞中生成pSp-CRISPR-ATF4细胞。shATF4.HT1080、pSp-CRISPR-ATF4和i-shATF4在添加非必需氨基酸和55μMβ-巯基乙醇的培养基中生长。如前所述，通过用编码全长mATF4（Ad-mATF4）的腺病毒转染shATF4.HT1080或shPERK.HT1080细胞来拯救ATF4的表达(11). 通过慢病毒将hHO-1-IRES-GFP（Precision LentiORFs，Thermo Scientific）转染至shATF4.HT1080细胞，并选择15μg/ml的杀鼠素，实现HO-1的过度表达。对于生物发光成像，用组成表达的荧光素酶质粒转染细胞，然后用500μg/ml G418进行筛选。抗人ON-TARGETplus siRNAs自动液位计5（目录L-004374），自动液位计7（目录L-020112），ULK1型（目录L-005049），HO1公司（目录L-006372），以及NRF2级（目录L-003755）从Thermo Scientific获得。免疫印迹分析证实了敲除效率。
免疫印迹分析
如前所述进行免疫印迹(三). 抗ATF4的主要抗体购自圣克鲁斯生物技术公司：抗兔ATF4（克隆C-20，目录sc-200）。以下抗体购自Cell Signaling Technologies：抗兔磷酸化eIF2α（丝氨酸51）（目录9721）、抗兔eIF2 a（目录9722）、抗家兔CHOP（克隆D46F1，目录5554）、抗兔子人特异性c-PARP（Asp214）（目录9541）、抗兔肉裂解半胱天冬酶3（Asp175）（目录9661）、，抗兔PERK（克隆体D11A8，目录5683）、抗兔LC3B（目录2775）、抗家兔p62（目录5114）、抗兔子ATG5（目录2630）、抗兔ATG7（目录2631）、抗羊NRF2（克隆体D1Z9C，目录12721）、防兔XBP1（克隆体D2C1F，目录12782）、防兔子Ku80（目录2753）、，和抗兔HO-1（克隆P240，目录5061）。以下抗体购自Sigma-Aldrich：抗兔ULK1（目录A7481）和抗小鼠β-肌动蛋白（克隆AC-40，目录A3853）。抗狂犬病磷酸化-PERK（苏氨酸982）由柯克·斯塔斯克（Eli Lilly）提供。抗狂犬病ATF6抗体由Ronald C.Wek（美国印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院）提供(70).
实时定量PCR
用三唑试剂（Ambion）分离RNA。使用AMV逆转录酶（Promega）进行逆转录。使用Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行实时定量PCR，并使用Applied生物系统7300实时PCR系统进行分析。使用的PCR引物（Invitrogen）在补充表1用标准曲线法定量相对mRNA水平。实验一式三份，用平均值加SD表示。
细胞活力
细胞存活率也由0.1%台盼蓝测量，并由Nexcelom Cellometer Auto X4 Cell Counter（Nexcelon Bioscience）进行数字分析和计数。所有活性实验作为3个独立实验重复进行，并计算平均细胞存活率和SDt吨检验用于计算统计学显著性。
ROS测量
shNT和shATF4.HT1080以及siNT和siHO-1.HT1080细胞在附着或悬浮条件下生长指定的时间段。将细胞进行胰蛋白酶化，在含有10μM DCF-DA（Sigma-Aldrich）的PBS中重新悬浮，并在37°C下培养30分钟。荧光水平由Fluoroskan Ascent（Thermo Electron Corporation）测量。结果代表3个独立实验±SD，统计显著性由Student’st吨测试。
14一氧化碳2释放试验
对应单元格的2.5×105细胞被放置在涂有Poly-HEMA（悬浮培养）的25 mm玻璃闪烁瓶中。细胞在DMEM中孵育，不含葡萄糖，但添加5 mMd日-[1-14C] 葡萄糖（PerkinElmer）和5mM碳酸氢钠。小瓶用塞子密封，以防止CO泄漏2.OPPC通过测量释放14一氧化碳2捕获在沃特曼GF/B玻璃纤维过滤器上，该过滤器用0.1 ml 5%氢氧化钾饱和。向小瓶中注入6N乙酸停止反应，并使用PerkinElmer Tri-Carb 2810 TR闪烁计数器测量过滤器的放射性。将数据归一化并表示为相对于无细胞放射性介质的3个独立实验的平均值。
炸薯条
ChIP分析在1×10上进行7shNT公司。HT1080和shATF4.HT1080以及siNT-和siNRF2转染的细胞，使用简单ChIP酶染色质IP测定试剂盒（Cell Signaling，目录9003），按照制造商的方案。免疫沉淀反应采用抗兔ATF4（克隆C-20，目录sc-200，Santa Cruz Biotechnology Inc.）、抗兔NRF2（目录12721，细胞信号技术）、抗家兔组蛋白H3（克隆D2B12，目录4620，细胞信号科技）和正常兔IgG（目录27129，细胞信号技术）的抗体。实时定量PCR用于分析免疫沉淀DNA片段。DNA被指定为第1页,第2页，以及第3页; 底漆套件在中提供补充表1RPL30的底漆随上述试剂盒一起提供。数值为所示两个独立SD实验的平均值。统计分析由双尾学生t吨测试。
动物
Charles River实验室的雌性裸鼠（Nu/Nu）用于所有体内实验。动物被安置在宾夕法尼亚大学动物设施内。5 × 105shNT公司。将HT1080和shATF4.HT1080以及感染了腺-mATF4或Lenti-IRES-hHO-1质粒的shATF4.HT1080细胞悬浮在总体积为100μl的PBS中，并注入尾静脉。每周对小鼠进行肺集落形成成像。当动物体重减轻15%或更多时，将对其实施安乐死。
原发性肿瘤切除和转移
雌性裸鼠（Nu/Nu）侧翼注射2×106i-shATF4.HT1080电池。注射后两天，给小鼠饮用含有Dox（1 mg/ml）和蔗糖（25 g/L）的水。对照组小鼠单独置于蔗糖水中。肿瘤长到约400毫米时被切除三手术后观察小鼠的体重，当小鼠体重减轻15%以上时，对其进行安乐死。通过生物发光成像监测转移瘤的生长。
生物发光成像
成像前，将小鼠麻醉，注射200μl 50μg/mld日-荧光素（Regis Technologies），并使用Carestream Imager（Carestreaw Health Inc.）或IVIS Spectrum（PerkinElmer）成像。使用Carestream Molecular Imaging软件（Carestreaw Health Inc.）或Living Image软件（PerkinElmer）测量胸部/肺部区域的平均相对光强度。在10%福尔马林中采集肺部；随后进行组织固定和石蜡包埋。
免疫组织化学
冷冻人体组织样本从Abramson癌症中心肿瘤组织库（宾夕法尼亚大学）获得。对来自人和小鼠肺的石蜡包埋的组织载玻片进行脱蜡和再水化，并使用10mM柠檬酸钠（pH 6.0）进行抗原回收。用3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，然后用5%正常山羊血清阻断。用单克隆抗小鼠HO-1一级抗体（1:100，目录NBP1-97507，Novus Biologicals）、单克隆抗鼠ATF4（1:250，克隆3E4C5，目录60035-1-Ig，Proteintech）和单克隆抗老鼠LC3B（1:100；克隆5F10，目录0231-100，纳米工具抗体）对连续组织切片进行免疫组化。图像由Aperio Imagescope（徕卡生物系统公司）进行扫描和分析。
有关更多信息，请参阅补充方法.
统计
生成了所有图表和所有统计数据（学生t吨测试和日志库测试）使用GraphPad Prism软件（GraphPad-software Inc.）进行。使用Student的双尾模型进行统计分析t吨测试。P（P）小于0.05的值被认为是显著的。
研究批准
动物。
所有动物实验均由宾夕法尼亚大学IACUC批准，并按照NIH和宾夕法尼亚大学指南进行。
人类肿瘤样本。
所有人体组织样本均来自宾夕法尼亚大学医学院肿瘤组织/生物样本库核心设施。根据宾夕法尼亚大学机构审查委员会审查批准的方案（IRB方案807537）获得知情同意。
