肿瘤血管生成抑制剂短期治疗后的加速转移

总结

引言

许多临床前研究表明，抑制VEGF途径的多种策略可以阻止肿瘤生长，最近批准了VEGF中和抗体（贝伐单抗）和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂（RTKIs）（索拉非尼和舒尼替尼）临床验证靶向VEGF或其受体（尤其是VEGFR2）作为抗癌治疗(福克曼，2007). 本研究的目的是测试每天短期服用VEGF RTKI是否会影响小鼠实验性和自发转移的生长。该实验设计的基本原理是基于一些最近的临床和临床前观察结果。首先，虽然索拉非尼和舒尼替尼已被批准用于治疗肾细胞癌，以及肝细胞癌（仅索拉非尼布）和胃肠道间质瘤（仅舒尼替布），但持久的临床反应很少见。此外，包括贝伐单抗在内的此类药物的单剂使用在许多情况下并没有产生有意义的有益活性。第二，当这些药物不连续给药时，例如使用舒尼替尼（开药4周，停药2周），有时会在无药间歇期观察到肿瘤再生(Burstein等人，2008年)或停止治疗时(Johannsen等人，2008年). 第三，临床前研究中有报道称，当停止治疗时，肿瘤会迅速血运重建(Mancuso等人，2006年). 最后，我们最近报道，在舒尼替尼治疗后的患者中观察到的促血管生成血浆蛋白的一些变化可以在非肿瘤小鼠中重现，而且这种变化具有剂量依赖性(埃博斯等人，2007年). 总之，这些结果表明，在持续抗血管生成治疗期间，宿主对VEGF抑制的系统反应可能在肿瘤和血管再生中发挥作用，最终避免反应(Bergers和Hanahan，2008年;Casanovas等人，2005年)以及可能影响继发性（转移性）疾病的进展，这可能会影响新佐剂和佐剂给药的结果(冯·梅伦，2008;Shuch等人，2008年). 在这项研究中，我们检查了舒尼替尼对转移的影响，舒尼替布的选择不仅基于我们之前的工作，也基于目前临床上使用的这种药物的间断给药计划(Motzer等人，2006年).

结果和讨论

我们的第一个实验在实验性转移模型中测试了短期舒尼替尼治疗的效果。人类转移性乳腺癌231/LM2-4^LUC公司+将表达荧光素酶的细胞注射到严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠的尾静脉，然后在接种肿瘤细胞之前或之后分别接受载体治疗或短期舒尼替尼治疗方案（120 mg/kg/天，持续7天）（a、B和C组）；图1A). 通过生物发光测量，在肿瘤细胞注射之前或之后给予短期舒尼替尼治疗可加速实验性转移(图1A)与车辆治疗对照组相比，中位生存率显著降低(图1B). 显示舒尼替尼治疗小鼠转移增加的典型图像见图1C选择每天120毫克/公斤的舒尼替尼治疗7天是基于先前的临床前研究，这些临床前研究证明，这种短期方案可以最大限度地提高小鼠血浆中促血管生成蛋白的上述多重宿主衍生变化。之前已经证明，持续给予60 mg/kg/天的舒尼替尼治疗方案（如下所述）在长期治疗后可产生最佳的肿瘤抑制效果，且毒性最小(埃博斯等人，2007年). B组在注射肿瘤细胞前24小时停止治疗，以尽量减少对肿瘤细胞的任何潜在直接药物影响，因为停药24小时后，舒尼替尼的血药浓度显著降低，并最大限度地增加上述舒尼替布诱导的宿主分子变化，停止治疗后2-5天内出现逆转(埃博斯等人，2007年). 重要的是，当数值/数值在肿瘤细胞接种前7天，用其他VEGF RTKIs治疗小鼠，包括索拉非尼（150 mg/kg/天）和SU10944（225 mg/kg/日）（参见图S1A–S1C在线提供）。这些结果表明，宿主对多靶向血管生成激酶抑制的反应可能导致即使在药物被移除后肿瘤的发生率也会增加。

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图1

静脉肿瘤接种前后短期舒尼替尼治疗加速实验性转移并降低生存率

（A） 231/LM2-4号机组^LUC公司+在接种肿瘤之前（B组）或之后（C组），将细胞注射到接受载体（A组）或短期舒尼替尼每日治疗的SCID小鼠的尾静脉中，连续7天。生物发光定量显示，与对照组相比，B组和C组的肿瘤生长加快。展示了一个具有代表性的实验。A组，n=10；B组，n=5；C组n=10。数据表示为平均值±标准偏差。

（B） Kaplan-Meier生存曲线显示，与A组相比，B组（log-rank test，p=0.0055）和C组（log-rank tesd，p<0.0001）小鼠的中位生存率显著降低。数据是多项实验的总结。A组，n=31；B组，n=11；C组，n=19。0.001<**p<0.01***p<0.001。

（C） 在肿瘤植入后1天、7天和27天拍摄各组的代表性图像，在接受舒尼替尼治疗的小鼠中可见转移增加。苏尼替尼的剂量和治疗计划如（A）所示。

接下来，我们使用图示的方案测试了短期舒尼替尼治疗对原发性肿瘤切除后产生的远处自发转移的影响图2A接受短期辅助舒尼替尼治疗的小鼠通过生物发光测量显示自发性转移性肿瘤负荷增加(图2A和​和2B），2B型)与总体生存率下降相对应(图2C). 为了确保药物治疗前各组之间的肿瘤负担相等，在将切除的肿瘤分为A组和B组之前，对其进行称重(图2D).

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图2

短期舒尼替尼治疗增加原发性人类异种肿瘤切除后的自发性转移并降低生存率

（A） 原位生长231/LM2-4^LUC公司+手术切除肿瘤，SCID小鼠每天接受载体（A组）或短期舒尼替尼治疗（B组）。生物发光双周定量显示，与A组相比，B组肿瘤生长加快，自发转移增加。数据表示为平均值±SD。

（B） 初级肿瘤切除前后（切除后第5天和第30天）肿瘤细胞的典型生物发光图像。

（C） 相应小鼠的Kaplan-Meier生存曲线显示，与A组相比，B组的中位生存率显著降低（log-rank检验，p=0.0024）。0.001<**p<0.01。

（D） 在将切除的肿瘤分为A组和B组之前，对其进行称重，以确保各组之间的肿瘤负担相等。苏尼替尼的剂量和治疗计划如（A）所示。

我们以前曾报道过手术切除高度转移的原位生长的231/LM2-4肿瘤会导致肺部、肝脏和淋巴结的自发转移，而安乐死的主要决定因素是广泛的内脏和外周转移(Man等人，2007年). 在本文描述的自发和实验性转移研究中，我们同样认为内脏和外周疾病是小鼠死亡的主要原因（数据未显示）。为了测试舒尼替尼治疗后转移性疾病分布的差异，小鼠接受了与图1在肿瘤植入27天后处死，以评估231/LM2-4^LUC公司+生物发光法测定肿瘤负荷(图S2). 在接种肿瘤前后接受舒尼替尼的小鼠的总体肿瘤负担增加（B组和C组与A组相比；图3A，inset），这与多器官转移性肿瘤负担增加相对应，但总体肿瘤分布没有明显差异(图3A). 用抗人波形蛋白抗体对小鼠器官肿瘤组织进行免疫组织化学染色，证实B组和C组各器官的微转移较A组对照组增加(图3B，上部面板）。重要的是，当静脉注射人类MeWo黑色素瘤细胞到另一个肿瘤模型中时，观察到多个器官的转移增加数值/数值用载体或短期舒尼替尼治疗预处理的小鼠（分别为A组和B组；图3B，下部面板）。使用人波形蛋白特异性抗体检测到的微转移的例子显示在图3C最后，在两种肿瘤模型中，可见的肺表面结节和肺重量增加表明肿瘤负担增加，典型的苏木精-伊红（H&E）和抗波形蛋白染色显示为图3D.

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图3

短期舒尼替尼治疗后小鼠多器官转移增加

（A） 遵循与中所述相同的实验设计图1A在第27天处死SCID小鼠，比较短期苏尼替尼治疗（插图）后总体肿瘤负担的增加以及多器官中相应的生物发光增加（A、B和C组）。数据以平均值±SEM表示。生物发光值差异较大的实例不允许在所有组中达到统计显著性。单向方差分析得出0.01<*p<0.05。

（B） 通过231/LM2-4器官中人类波形蛋白的免疫染色证实了微转移^LUC公司+肿瘤模型位于（A）（上面板）或数值/数值静脉（iv）接种人MeWo黑色素瘤细胞之前接受载体（A组）或短期舒尼替尼治疗（B组）的小鼠（下面板）。根据是否存在可检测的微转移，组织切片评分为阳性或阴性。NT=未测试。

（C） 使用人类特异性波形蛋白抗体显示脾脏、肝脏、肾脏和大脑微转移的典型示例。

（D） 231/LM2-4切除的肺^LUC公司+对MeWo肿瘤模型的表面肿瘤结节进行视觉评分，并通过苏木精-伊红（H&E）和抗波形蛋白免疫染色确认大转移（显示典型图像）。对于231/LM2-4中的A、B和C组^LUC公司+肿瘤模型，每组10例。对于MeWo肿瘤模型中的A组和B组，每组n=5。

自从之前发表的研究表明，舒尼替尼治疗后，对小鼠已建立的原发性肿瘤具有有效的肿瘤生长抑制作用(Christensen，2007年)在原位原发性肿瘤和实验性转移模型中，我们比较了短期和持续的舒尼替尼治疗。231/LM2-4号机组^LUC公司+细胞被植入乳腺脂肪垫数值/数值小鼠，当肿瘤达到200mm时，给予载体或持续舒尼替尼治疗（60 mg/kg/天）^三尺寸（A组和B组；图4A). 第三组小鼠在肿瘤植入后第二天开始接受短期舒尼替尼治疗（120 mg/kg/天，共7天）（C组；图4A). 与对照组相比，短期或持续治疗后均观察到显著的肿瘤生长延迟，而持续的舒尼替尼治疗具有更强的抑瘤作用。相反，当将相同的细胞静脉注射到数值/数值在接种肿瘤之前或之后立即接受短期舒尼替尼治疗的小鼠（A、B和C组；图4B). 与对照组（D组和E组；图4B). 与对照组相比，相应的生存曲线显示B、C和D组的中位生存率显著降低，而E组的生存率没有总体延长。重要的是，作为苏尼替尼治疗在原位原发肿瘤和实验性转移模型中对抗效果的另一个例子，我们在数值/数值用持续舒尼替尼治疗荷人MeWo黑色素瘤的小鼠(图S3). 这与短期舒尼替尼治疗后立即静脉接种肿瘤细胞58天后观察到的小鼠肺部转移增加形成对比(图3D).

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图4

区分短期和持续舒尼替尼治疗原发性和转移性疾病的对抗效果

（A）数值/数值携带原位生长231/LM2-4的小鼠^LUC公司+当肿瘤平均体积达到200 mm时，接受载体（A组）或持续舒尼替尼治疗（B组）^三第三组从肿瘤植入后第二天开始接受短期舒尼替尼治疗（C组）。A组达到肿瘤体积终点（1500mm^三)在第27天，B组和C组的比较肿瘤体积在同一时间点显著减少（Student t检验p=0.002）。与接受短期治疗的小鼠相比，接受持续舒尼替尼治疗的小鼠表现出更强的肿瘤生长抑制作用（分别为到终点的41至62天）。所有组n=5。

（B）数值/数值小鼠静脉注射231/LM2-4^LUC公司+在肿瘤接种前（B组）或接种后（C组），每天用载体处理细胞（A组）或接受短期舒尼替尼治疗7天。生物发光定量显示，短期舒尼替尼治疗后，B组和C组的转移瘤生长加快。D组和E组小鼠从第8天开始接受持续的舒尼替尼治疗，D组也接受类似于C组的短期舒尼替布治疗。

（C） 相应的Kaplan-Meier生存曲线显示，与A组的对照小鼠相比，B组、C组和D组的中位生存率显著降低（分别为p=0.0011、p=0.0022和p=0.0365），E组（p=0.4485，log-rank检验）的中位存活率无显著差异。对于（B）和（C）：A组，n=7；B组，n=7；C组，n=7；D组，n=5；E组，n=5。

（D） 在同基因肿瘤模型中，与对照组小鼠（a组和B组，到达终点的时间分别为17天和28天）相比，携带小鼠B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠在持续舒尼替尼治疗后，原发性肿瘤生长延迟。A组，n=4；B组，n=4。

（E） 与对照组相比，在静脉接种相同的小鼠B16黑色素瘤细胞之前接受短期舒尼替尼治疗的C57BL/6小鼠的实验性转移加快，生存率降低（B组；通过log-rank检验，p=0.0014）。在接受短期舒尼替尼治疗和持续舒尼替尼治疗的小鼠中观察到延迟转移和提高生存率（D组；log-rank检验p=0.0047）。在肿瘤植入后7天接受持续舒尼替尼治疗的小鼠与经车辆治疗的对照小鼠相比，存活率没有差异（E组；通过对数秩检验，p=0.6368）。肿瘤植入后接受短期舒尼替尼治疗的小鼠表现出双峰反应，包括加速转移和降低生存率或延长生存率（C组；log-rank检验p=0.3391）。A组，n=10；B组，n=10；C组，n=9；D组，n=5；E组，n=5。苏尼替尼的剂量和治疗方案如图所示。

数据以平均值±标准差表示。0.01<*p<0.05；0.001<**p<0.01***p<0.001。

接下来，我们测试了在同基因小鼠肿瘤模型中，采用与图4A将小鼠B16黑色素瘤细胞皮下植入C57BL/6小鼠的侧翼，与上述人类异种移植实验一样，与对照组（A组和B组；图4D). 相比之下，与图4C与对照组相比，在静脉接种肿瘤之前接受短期舒尼替尼治疗7天的C57BL/6小鼠的存活率降低，而在接种后8天开始的持续舒尼替布治疗没有显示出存活优势（A、B和E组；图4E). 有趣的是，在肿瘤接种后立即接受短期舒尼替尼治疗的小鼠，在7天后停止（C组）或随后接受持续的舒尼替尼治疗（D组），在某些情况下表现出生存优势。与对照组小鼠相比，D组小鼠显示出显著的生存延长，而C组小鼠具有双相效应，大约一半的小鼠出现加速转移，其余小鼠显示出生存延长，即使在停止治疗后也是如此(图4E). 这些结果的一个潜在解释可能来自于舒尼替尼治疗对B16细胞可能具有的直接抗肿瘤活性，这一点之前已经用其他VEGF RTKIs证实过(Beaudry等人，2008年).

综上所述，我们的结果表明，同一种药物对VEGF受体酪氨酸激酶的抑制作用，使用三种不同的肿瘤细胞模型以不同的时间表和剂量给药，可以对肿瘤生长产生相反的影响。对预先建立的肿瘤进行持续的舒尼替尼治疗，可显著抑制原位生长的原发性人类异种移植瘤和同基因肿瘤的生长。相比之下，静脉接种相同细胞之前的短期治疗会加速转移，并相应地显著降低中位生存率。此外，231/LM2-4的持续治疗^LUC公司+与对照组相比，接种肿瘤细胞7天后启动的B16实验性转移模型没有产生生存优势。相反，肿瘤接种后立即进行短期舒尼替尼治疗可加速转移性疾病（在231/LM2-4中^LUC公司+模型）或产生双相反应（在B16模型中）。

我们的结果补充了Páez-Ribes等人（2009年）在本期癌细胞重要的是，在这两项研究中，抗血管生成药物治疗对局部肿瘤具有有效的抑制作用。此外，Páez-Ribes等人表明，用抗血管生成药物治疗荷瘤小鼠，包括VEGFR2单克隆抗体DC101和VEGF RTKIs，如舒尼替尼和SU10944，在长期治疗后，会导致局部肿瘤细胞侵袭增加，远处转移增强，或者，如果是DC101，只经过短期治疗。正如Pàez Ribes等人所证明的那样，这些效应似乎是由肿瘤血管系统的破坏引发的肿瘤细胞自身的适应性/逃避性反应。我们的结果提出了第二种可能性，这种可能性独立于已建立的肿瘤的适应，包括小鼠器官中的微环境变化，这些器官“条件化”后更容易肿瘤外渗。但这种转移性的“条件反射”效应是如何发生的呢？一些潜在的机制单独或组合可以发挥作用。一种是上述诱导的多种循环促血管生成细胞因子和生长因子上调，以应对治疗，包括骨桥蛋白、G-CSF和SDF1α(埃博斯等人，2007年)-所有这些都与血管生成和/或转移有关(McAllister等人，2008年;Ben Baruch，2008年;Wai和Kuo，2008年;Natori等人，2002年;Zhang等人，2000年). 其次，可能与这种分子变化有关，骨髓源性细胞的动员可能有助于增强“转移前生态位”，包括循环内皮细胞(Okazaki等人，2006年)和髓系祖细胞(Shojaei等人，2008年)，CXCR4⁺招募骨髓循环细胞(Grunewald等人，2006年)和循环VEGFR1⁺骨髓细胞(Kaplan等人，2005年). 最后，苏尼替尼和索拉非尼等公认的RTKI靶向混杂(Karaman等人，2008年)可能会对细胞抑制/损伤产生大量广泛的宿主微环境反应。这些反应反过来可能会促进肿瘤外渗，与放射治疗和多种化疗药物治疗后观察到的转移增强基本相似(van Putten等人，1975年;Vollmer and Conley，1984年;de Ruiter等人，1982年)-所有这些都可能涉及各种促炎反应(Noonan等人，2008年)或内皮微环境的改变。总的来说，这种影响可以创造一个更有利的转移生态位(Bidard等人，2008年). 然而，重要的是，与化疗和放疗不同，化疗和放疗在很大程度上是通过非特异性靶向增殖细胞的直接肿瘤细胞毒性发挥作用，并在一定时间内给药，抗血管生成药物在很大程度上将对抗宿主肿瘤支持过程，从而间接阻止肿瘤生长，并意味着（至少在理论上）可以无限期管理。无论涉及的实际机制如何，我们的结果可能与癌症治疗中几个突出问题的考虑有关，包括抗血管生成药物（如舒尼替尼）的间断治疗与连续治疗方案的相对益处、治疗持续时间、，这些药物在新佐剂和佐剂环境中的应用，以及未来可能考虑靶向转移机制的药物与抗血管生成药物联合，以提高其整体抗肿瘤疗效的前景。

实验程序

补充材料

致谢

脚注

工具书类