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J签证费用。2014; (90): 51806.
2014年8月19日在线发布。 数字对象标识：10.3791/51806
预防性维修识别码：项目经理4540087
PMID：25177909

PNA-FISH快速分析小鼠B淋巴细胞染色体畸变

莎拉·米森科1和塞缪尔·班廷1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

缺陷DNA修复导致基因组不稳定性增加，这是导致肿瘤发生的突变的根本原因。通过分析不同细胞类型中染色体畸变的频率和类型，可以阐明DNA修复途径中的缺陷。特定基因敲除小鼠的产生对理解哺乳动物DNA修复生物学有很大帮助。该方案的目标是量化小鼠B淋巴细胞的基因组不稳定性。使用PNA-FISH探针标记端粒（肽核酸-荧光就地杂交）促进了中期染色体扩散中基因组不稳定性的快速分析。与成纤维细胞相比，B细胞具有特殊的优势，因为它们具有正常的倍性和较高的有丝分裂指数。因此，B细胞的短期培养能够精确测量原代细胞群体中的基因组不稳定性，与转化成纤维细胞或患者细胞系中的典型情况相比，原代细胞可能具有较少的二次基因突变。

关键词：免疫学，第90期，基因组不稳定性，DNA修复，小鼠，中期传播，FISH，原代培养

下载视频文件。（22M，mp4）

介绍

癌症是由影响调节正常细胞生长的基因的突变积累引起的。突变是DNA损伤引起基因组结构和序列改变的结果。DNA损伤可以通过多种过程发生，包括电离辐射等外源性因素，以及作为正常细胞代谢的副产物，如核苷酸碱基的自发脱氨基作用或与活性氧接触引起的损伤1.

尽管哺乳动物细胞具有一系列修复活性，可以逆转DNA损伤或恢复断裂部位的序列，但突变仍会在细胞的整个生命周期中累积。DNA损伤还可能导致干细胞衰老和功能丧失，这两个过程与衰老相关疾病有关2因此，了解DNA损伤的修复对于解决公共卫生中的两个重要问题至关重要。越来越多的证据表明哺乳动物的DNA修复途径可以促进癌细胞基因组的进化3,4这使得在分子水平上理解抑制突变的过程变得更加必要。

染色体畸变的直接可视化是确定特定细胞类型中基因组不稳定程度的一种强有力的定量方法。中期细胞的浓缩染色体可以用光镜或荧光显微镜进行分离和检查。这种细胞遗传学方法已经应用了几十年，可以用来证明与DNA修复活性丧失相关的易位或特定类型染色体畸变的出现。该协议有几个潜在的扩展：染色体可以标记为光谱核型探针（SKY）或多色荧光探针就地杂交（mFISH）鉴定易位5,6这些技术还可以确定染色体易位的频率和复杂染色体易位结构，这提供了本协议所能提供的额外信息。或者，可以生成序列特异性探针，并用于测试选定基因组位点的DNA断裂频率7.

在本方案中，我们描述了从B淋巴细胞制备中期染色体扩散。使用荧光标记的肽核酸（PNA）端粒重复序列探针，有效标记中期染色体扩散中的端粒。该协议具有几个优点。可以诱导B细胞以高有丝分裂指数生长，从而持续产生高质量的扩散。来自基因修饰小鼠的B细胞也不太可能含有二次基因突变，这可能会混淆特定基因对基因组完整性的贡献分析。PNA-FISH方法可以在一天内完成，并且可以更准确地对染色体断裂进行评分。通过使用这种方法，尤其是结合本协议中描述的特定设备，可以产生非常一致、高质量的扩散，并快速分析基因组不稳定的速率和类型。

协议

该程序由新泽西州立大学罗格斯学院动物护理和使用委员会批准。按照NIH《实验动物护理和使用指南》对小鼠进行治疗。科学家应咨询其国家和机构动物组织，以获得既定和批准的指南。

开始之前，准备中列出的解决方案表1.

1.B细胞的分离和激活

用一氧化碳安乐死老鼠2其次是颈椎脱位。定位鼠标，使身体左侧朝上，并向鼠标喷洒70%乙醇，直到毛发变湿。解剖脾脏并将其放置在带有2 ml洗涤缓冲液的35 mm组织培养皿中。在层流罩中，使用5毫升注射器的平端轻轻地将组织培养皿中的脾脏打碎。

  1. 将70μm尼龙网插入50 ml试管中，并将脾样品转移到2 ml洗涤缓冲液中的尼龙网中。使用注射器的平端轻轻地破坏网状物中的脾脏。
  2. 用8ml洗涤缓冲液冲洗注射器背面和35mm板，并通过70μm尼龙网过滤。在4°C、300 x g下离心10分钟。
  3. 吸取并丢弃上清液，并将颗粒重新悬浮在3 ml ACK裂解缓冲液中。用移液管上下快速移液，以打乱团块并孵育5分钟。添加10毫升洗涤缓冲液，并在4°C下以300 x g离心10分钟。
  4. 抽吸并丢弃上清液，通过轻敲试管底部，然后用吸管吸取1 ml洗涤缓冲液，重新悬浮颗粒。添加50μl抗CD43 MACS微床并在冰上孵育30分钟。添加10 ml洗涤缓冲液，轻轻混合，并在4°C下以300 x g离心10分钟。添加10 ml洗涤缓冲液，轻轻混合，并在4°C下以300 x g离心10分钟。
  5. 通过在MACS磁铁上放置一个柱来设置一个迷你MACS柱。将带标签的15 ml锥形管放在柱下方。向色谱柱中添加1 ml洗涤缓冲液，并使其通过15 ml试管。
  6. 吸取上清液，并在1 ml洗涤缓冲液中重新悬浮。清洗缓冲液用完后，将样品装入柱中。
  7. 样品通过色谱柱后，添加1 ml清洗缓冲液以清洗色谱柱。将7 ml洗涤缓冲液直接添加到15 ml试管中收集的样品中。
  8. 用血细胞仪计数细胞。将5000000个细胞/孔所需的细胞体积转移到50 ml试管中。在4°C、300 x g下离心10分钟。用LPS 1:500和IL4 1:1000补充B细胞培养基。
  9. 吸取上清液，并添加最终浓度为1000000个细胞/ml所需的适当体积的补充B细胞培养基。
  10. 将细胞置于6孔板中，其中5 ml细胞为1000000个/ml，放置在37°C、5%CO的增湿细胞培养箱中2.

2.B细胞固定

  1. 向含有5 ml B细胞的微孔中添加50μl秋水仙素（最终浓度为100 ng/ml），并在37°C下培养1小时。在37°C水浴中预热75 mM KCl溶液。将B细胞转移到标有15 ml的试管中。用胶带盖住标签，并在4°C下以300 x g离心10分钟。
  2. 吸取管中留有1 ml的上清液，并用吸管重新悬浮颗粒。在旋涡上敲击或脉动时，逐滴加入5毫升预热的氯化钾。
  3. 添加10 ml KCl并倒置混合。在37°C水浴中孵育15分钟。加入5滴新鲜固色剂，倒置搅拌。在4°C、300 x g下离心10分钟。吸取管中留有1 ml的上清液，并通过上下移液管重新悬浮颗粒。
  4. 在旋涡上轻敲或跳动时，一滴一滴地加入5毫升新鲜的固定剂。再添加10毫升固定剂，在室温下培养30分钟。
  5. 在4°C、300 x g下离心10分钟。吸取上清液，将其留在试管中1 ml，然后用吸管重新悬浮。添加14 ml新鲜固定剂，并在4°C下以300 x g离心10分钟。
  6. 再重复步骤2.7两次。
  7. 加入14毫升新鲜的固定剂。用Parafilm密封盖子，并在-20°C下储存过夜。

3.中期染色体扩散的制备

  1. 将调节环境室设置为22.9°C和52%湿度。
  2. 在4°C下，将固定的B电池在300 x g下离心10分钟。吸入固定剂，将70μl留在试管中，然后用吸液管重新悬浮。
  3. 将贴有标签的载玻片以35°角放置在湿度室中。将35μl重新悬浮的B细胞滴到载玻片上，每个样品滴两片载玻片。让载玻片在湿度室中干燥30分钟，然后将载玻片储存在37°C的载玻片箱内。

4.端粒PNA FISH

  1. 探针的制备
    1. 预热去离子甲酰胺至37°C。将2μl端粒PNA探针与7μl去离子预热的甲酰胺混合，在37°C下孵育1小时。
    2. 将FISH主混合料预热至37°C。从步骤4.1.1开始，向混合物中添加7μl预加热的FISH主混合物，并在37°C下培养1-3小时。
    3. 在80°C下将探针混合物变性8分钟。在37°C条件下，将探头置于内部1小时。
  2. 染色体载片的预处理
    1. 将装有50 ml 0.01 M HCl至37°C的玻璃滑座罐预先置于水浴中。
    2. 在室温下，将载玻片放在另一个装有2个SSC的玻璃滑座罐中5分钟。
    3. 将2μl胃蛋白酶原液加入预热的玻璃滑座罐中，倒置搅拌。将载玻片转移到这个玻璃载玻片固定罐中，并在37°C下培养90秒。
    4. 在室温下，将载玻片在装有1x PBS的不同玻璃滑座罐中清洗2次，每次清洗5分钟，摇晃。然后在1x PBS/MgCl中清洗载玻片5分钟2在室温下，摇晃。
    5. 将载玻片转移到含有新鲜1%甲醛/1x PBS/MgCl的玻璃载玻片固定罐中2在室温下保持10分钟。
    6. 在室温下，将载玻片放在另一个装有1x PBS的玻璃滑座罐中清洗5分钟，摇晃。
    7. 准备一个乙醇脱水系列，方法是使用含有70%、90%和100%乙醇的单独玻璃滑动罐。
    8. 将载玻片转移到每个罐中3分钟，从70%乙醇开始，然后是90%乙醇，然后是100%乙醇。完成后，将乙醇罐置于-20°C。
    9. 将多余的乙醇轻拍到纸巾上，以35°角支撑载玻片，使载玻片风干。干燥后，用钻石笔在载玻片背面标记18 x 18 mm的区域进行杂交。
  3. FISH载玻片的变性
    1. 将120μl 70%去离子甲酰胺/2X SSC涂敷在24 x 60 mm盖玻片上。将滑梯接触盖玻片。将载玻片在80°C的温度下在热板上变性90秒。
    2. 迅速小心地从盖玻片上滑下，将玻片放在冰镇的70%乙醇中3分钟，然后分别放在90%和100%乙醇中3 min。让玻片风干。
    3. 准备一个潮湿的房间，方法是在一个塑料盒子里衬上一个紧盖和湿纸巾。纸应该是潮湿的，但不能被水浸透。
    4. 在潮湿的室内，将步骤4.1.3中的预退火探针混合物涂敷到载玻片上的标记区域，用18 x 18 mm盖玻片覆盖，并在37°C下培养1小时。
  4. 吸入后清洗
    1. 在45°C水浴中预武装50%甲酰胺/2x SSC、1x SSC和4x SSC/0.1%吐温-20。
    2. 小心地取下盖玻片，在黑暗中摇晃5分钟，在预先加热的50%甲酰胺/2x SSC中清洗玻片3次。用预先加热的1x SSC 3x清洗载玻片，每次5分钟，摇晃。最后，在预先加热的4x SSC/0.1%吐温-20 3x中清洗载玻片，每次5分钟。
    3. 在光线保护的玻璃载玻片染色罐中，在DAPI中对载玻片染色3分钟。
    4. 在2x SSC中摇晃清洗载玻片5分钟。涂抹35μl Mowiol安装介质，用24 x 60 mm盖玻片盖住，并将玻片存放在4°C下。

5.染色体显微分析

  1. 使用标准外荧光显微镜分析中期载玻片。使用带有自动化舞台的成像平台，如MetaSystems Metafer平台，以获得最佳效果。对于每个中期扩散，收集一张DAPI荧光图像以可视化染色体，以及一张端粒探针荧光信号图像。(例如，Cy3-其他荧光可用，且效果同样良好。）
  2. 用图像分析程序覆盖图像并进行分析。

具有代表性的结果

来自一个细胞的中期染色体应形成包含40条染色体的离散簇（如果使用小鼠细胞）(图1A). 每条染色体的一端都有一个着丝粒，它是一个浅蓝色的球体。在正常染色体中，染色单体末端有两个端粒信号，每个着丝粒有两个信号。相间核也会出现在幻灯片上。这些将是可见的蓝色球体，带有红色端粒信号，但没有浓缩染色体（参见示例图1B). 为了量化基因组不稳定性，间期核可以忽略不计。

可以观察到许多不同类型的染色体畸变。染色单体断裂是组成每个中期染色体的两个姐妹染色单体中的一个的断裂。如果研究人员发现一个染色单体出现不连续，或染色体一端的单个端粒信号丢失，则可以对其进行评分（参见图1B). 染色体断裂是通过寻找染色体一端端粒信号的丢失来确定的（例如图1C). 在某些情况下，染色体的断裂端可以观察到一个片段，其端粒信号在相同的中期扩散（如图1C). 在其他情况下，染色体末端可能不存在。

可以观察到几种类型的染色体重排。放射状染色体有多种形式，其特征是涉及两条染色体的复杂重排（图中用红色箭头显示了三个例子图1D). 放射状染色体还包括更复杂的重排，包括三条或更多的染色体。染色体也可能结合形成双着丝粒染色体，这表现为染色体两端带有着丝粒的端到端融合（图中用白色箭头表示图1D). 罗伯逊易位是两条染色体的着丝粒之间的一种易位，表现为四条姐妹染色单体臂附着在一个着丝粒上（见图1E).

图1F显示了一个不存在端粒信号的中期。探针制备过程中的错误或杂交过程中盖玻片中的气泡可能导致端粒信号缺失。

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图1。通过PNA端粒FISH观察小鼠B细胞中的染色体畸变。A）正常小鼠B细胞中期的染色体结构。40条染色体可见，两端各有两个端粒信号。B）显示两个染色单体断裂的细胞（绿色箭头）。C）一个染色体断裂的中期扩展（橙色箭头）。D）显示3条放射状染色体（红色箭头）和1条双着丝粒染色体（白色箭头）的细胞。E）带有一条罗伯逊易位染色体的中期传播（黄色箭头）。F）一个杂交失败的例子，显示染色体没有端粒信号。比例尺表示每个图像中的10μm。请单击此处查看此图的放大版本。

讨论

虽然活化的B淋巴细胞特别适合制备有丝分裂染色体扩散，但也可以使用其他类型的细胞。T淋巴细胞具有B细胞的许多优点，因为它们可以从脾脏或淋巴结中纯化，并且在含有适当有丝分裂原的培养基中生长时具有较高的有丝分裂指数8胚胎干细胞（ES细胞）也适用于中期染色体分析9如果这些都不可用，可以使用成纤维细胞，尽管使用秋水仙素治疗时间更长(例如建议使用最终浓度为10 ng/ml的秋水仙素16小时，以便在固定前在中期捕获更多细胞。

我们发现，将固定染色体放在可控湿度室（如Thermotron CDS-5细胞遗传学干燥室）中，可以极大地促进中期铺片制备的一致性，但根据实验室环境的湿度和温度，在工作台上工作可能会获得良好的结果。为了获得可靠的结果，建议对每个样本至少100个中期的染色体畸变进行评分。由于手动成像每个通道中每个中期的过程可能很费力，我们使用Metasystems Metafer4自动显微镜系统获取中期，该系统可以快速找到并准确扫描大量中期染色体。

分析用端粒探针标记的中期染色体是测量染色体和染色单体断裂的理想方法，端粒信号也有助于识别复杂的染色体重排，如融合和放射状结构。用Giemsa溶液染色固定中期染色体也适用于量化染色体畸变，并具有不需要荧光显微镜的优点10用泛素体PNA探针标记端粒，通过鉴定端粒融合，扩大了染色体畸变的范围，染色体畸变可以量化，端粒融合发生在DNAPKcs基因敲除小鼠的细胞中11PNA-FISH也可用于测量端粒异常的频率，包括染色体端粒重复和染色单体端粒丢失12,13端粒缩短和染色体断裂均可导致端粒信号缺失。PNA-FISH可用于使用Q-FISH（定量FISH）敏感地测量端粒长度14.

缺乏不同DNA修复活性的细胞倾向于积累不同类型的染色体畸变。例如，DNA损伤反应因子53BP1的缺失会导致染色体断裂的累积15相反，在缺乏BRCA1的细胞中观察到大量复杂的放射状染色体结构4这些染色体重排的精确结构各不相同，但总是涉及来自两条或多条染色体的物质的融合。当细胞具有非常高水平的基因组不稳定性时，例如，在使用高剂量导致DNA断裂的药物治疗后，对单个染色体畸变进行评分变得越来越困难，这就限制了实验的动态范围。

中期传播中染色体断裂和重排的量化有助于测试特定基因是否在DNA修复中发挥作用。为此目的使用中期染色体分析的一个潜在问题是，缺乏DNA修复活性的细胞可能无法正常生长。如果修复缺陷细胞没有达到中期，则可能低估了基因对介导DNA修复的重要性。例如，RNF8-/-受p53依赖性衰老影响的细胞表现出适度的染色体不稳定性，而RNF8-/-第53页-/-双基因敲除细胞显示出更多的染色体畸变，因为p53的缺失使细胞生长更好16因此，重要的是将染色体不稳定性的测量与细胞周期分析配对，以表明敲除细胞群可以正常生长，并包含有丝分裂细胞的相当比例。

基因组不稳定性的观察本身并不能深入了解特定基因提供的修复活性的确切功能，而只是作为更多机制研究的起点。最后，尽管这种方法可用于测量染色体断裂和复杂重排，但建议使用mFISH或SKY来量化染色体易位。这些技术也从中期染色体扩散开始，但使用混合探针，用特定的荧光团组合“绘制”每条染色体。这两种技术都被推荐用于测量修复缺陷细胞中染色体不稳定性的全谱。

披露

作者没有相互冲突的利益。

致谢

这项工作得到了NIH拨款R00 CA160574（SFB）和罗格斯大学生物技术培训项目（SMM）奖学金的支持。

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